应用一步和套式PCR法检测SARS患者标本中的SARS病毒核酸序列

目的：建立敏感、特异和快速的针对SARS病毒的RT-PCR方法，为SARS的早期诊断及防治提供依据。方法：采用一步和套式PCR法对SARS患者不同标本中的SARS病毒RNA进行扩增及序列测定。结果与结论：应用外引物和内引物可分别扩增出约380bp和150bp的单一条带，其大小与预期的相一致。应用套式PCR可使检测敏感性从l0-6提高到lO-15。采用这种方法从SARS患者粪便、痰、鼻咽拭子和血液标本中均可扩增出与预期大小一致的条带，且测序结果显示该扩增片段为SARS病毒的特异序列，表明本研究建立的RT-PCR方法敏感、特异，可用于SARS的快速检测.．     

SARS 25例临床诊断患者血浆特异性抗体和病毒的动态检测

目的 动态检测SARS患者血浆特异性IgM和IgG以及SARS冠状病毒(SARS-CoV)的变化规律。方法 用酶联吸附免疫法对25例145份SARS临床诊断患者血浆特异性IgM和IgG进行定性检测,用RT-PCR对其中114份血浆进行SARS-CoV定性检测。结果 IgM和IgG抗体的阳性样本检出率分别为49．0％(71／145)和54．5％(79／145),阳性患者检出率均为84．0％(21／25),两种抗体大多在发病第2～4周产生,前5周检出率相近,均呈上升趋势,以后IgM抗体检出率开始下降,IgG抗体检出率则继续上升。血浆SAPS-CoV阳性样本检出率为15．8％(18／114),阳性患者检出率为40．0％(10／25),多为发病后4周内采集的样本,抗体检测阴性或初次阳性。结论 血浆特异性抗体以及SARS-CoV检测可作为SARS的确诊依据;抗体产生后大多数病人血浆病毒很快转阴,但有个别病人在抗体产生2～3周后仍能在血浆中检测到病毒序列。     

SARS病毒基因的PCR扩增及序列测定

目的 利用RT—PCR技术检测SARS疑似或临床确诊病人咽拭子、血清及自细胞中的SARS病毒，并分析了扩增产物内一个可能的突变位点。方法 采用Trizol试剂或病毒RNA提取试剂盒，抽提SARS疑似患者咽拭子、血清及外周血白细胞中的RNA，进行RT—PCR和nest PCR反应，检测SARS病毒RNA，并对扩增产物进行DNA测序。结果 14例SARS疑似患者中2例咽拭子RT—PCR结果阳性，约占14％；5例临床确诊病人中2例咽拭子nest PCR结果阳性，约占40％；6例临床确诊SARS病人中1例血清nest PCR结果阳性，占17％，其他5例疑似患者结果阴性；在22份疑似患者外周血白细胞中未检测到SARS病毒；扩增产物DNA序列与美国和加拿大在GenBank中报道的序列一致。结论 RT—PCR方法是一种快速有效的SARS病毒检测手段，为临床诊断及发病机制研究提供了依据；扩增片段内未发现突变。     

SARS病毒全基因组芯片在临床检测中的应用

目的：利用冠状病毒全基因组芯片检测SARS患者血、便和痰标本中的冠状病毒核酸，为SARS病毒核酸的诊断提供线索。方法：提取SARS患者血、便和痰样本中的冠状病毒RNA，经全基因组随机反转录和PCR扩增标记成荧光探针，与SARS病毒全基因组芯片进行杂交，同时用体外培养的病毒RNA和从健康人分离的白细胞的RNA分别做阳性和阴性对照，杂交后的芯片用Axon4100A扫描仪扫描和分析。结果：SARS患者的3种标本中都能检测到冠状病毒核酸的存在，与整个病毒基因组比较大都为一些不连续的片断。其中痰和便标本中的基因谱较为相似，并且发现编码S1蛋白的核酸在多数痰和便标本中是连续的。结论：冠状病毒全基因组芯片能够检测出SARS患者血、便和痰标本中的冠状病毒核酸，同时能够监测不同样本中该病毒全基因组变化的特点，初步显示该芯片用于临床检测的可行性。     

SARS定点收治医院工作人员SARS冠状病毒感染的危险性调查

目的了解医院工作人员感染SARS病毒的危险性。方法对与SARS患者收治相关的工作人员进行问卷调查;用酶联免疫法检测SARS冠状病毒IgG抗体。结果发放调查问卷450份,收回问卷并采集血标本441人份。接受调查者全部按照防护规定进行个人防护。5例为SARS抗体IgG阳性,均为直接接触SARS病人和(或)与SARS病人标本或衣物直接接触者,比例为5／260;非直接接触SARS病人和(或)与SARS病人标本或衣物非直接接触者,比例为0／181,二者无统计学差异。5例SARS病毒IgG抗体阳性者分别来自SARS病房、CCU病区(该病区曾发生过临床疑似SARS病人)、儿科病房和门诊、标本转送中心及洗衣班,均不符合SARS的临床可能或疑似定义。结论医院目前的防护系统是完善的。     

SARS冠状病毒多聚酶区抗原在感染诊断中的作用探讨

目的原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-COV）非结构蛋白RNA多聚酶表位区,了解其在SARS-COV感染诊断及作为病毒复制指标方面的意义。方法通过PCR扩增获得RNA多聚酶表位区基因,与原核表达载体pET32a＋连接,转化大肠杆菌BL-21表达获得重组融合蛋白。经切胶透析纯化后,应用ELISA检测SARS患者及动物模型血清标本的IgG抗体。结果获得原核表达的RNA多聚酶表位区。ELISA检测正常人血清均阴性,SARS患者血清阳性率为95％;检测SARS病毒感染实验动物血清阳性率100％,灭活纯化病毒接种恒河猴均为阴性。结论RNA多聚酶表位区具有很好的免疫原性,可用于感染诊断的检测及作为病毒复制的指标。     

聚合酶链反应DNA扩增对肺结核疗效监测

目的:探讨聚合酶链反应(PCR)痰结核杆菌DNA扩增对肺结核疗效监测的临床实用价值。方法:对31例初治涂阳肺结核患者进行2年的随访研究,定期行痰涂片抗酸染色和PCR检查。结果:31例中有27例痰PCR在治疗结束前转阴,另4例痰PCR持续阳性时间长达12月左右。31例中有3例初治有效后复发,2例为PCR持续阳性患者,1例为痰涂片和PCR复阳患者,PCR复阳时间比涂片早2月。485份痰标本痰PCR和涂片检查总符和率为88.9%(431/485)。结论:提示痰PCR是检测肺结核疗效敏感的方法,痰PCR和涂片检查总符合率较高,复发多见于痰PCR持续阳性患者。     

肝肾移植术后受者人巨细胞病毒两种检测方法的对比研究

目的:探讨巢式PCR(Nest PCR)检测器官移植术后受体人巨细胞病毒(HCMV)DNA,并与传统ELISA法作方法学对照。方法:巢式PCR针对HCMV AD169株IEA基因设计内外两对引物,对59例肝、肾移植术后受体(肝移植27例、肾移植32例)血、尿标本进行HCMV DNA检测。分离血清作EIASA检测IgG、IgM。结果:血液Nest PCR阳性率肝移植62.9％,肾移植46.8％;ELISA法阳性率:IgC35.5％,IgM27.1％,IgG+IgM18.6％,IgM阳性标本(16例)DNA检测皆为阳性,6例IgG、IgM皆阴性标本DNA检测仍为阳性。两法检测,P<0.05,证明两法存在显著差异,结论:巢式PCR是一种敏感特异、简便快速诊断HCMV感染的方法,灵敏度及特异性高于传统ELISA,能弥补ELISA的假阴性,更适用于临床检测器官移植术后HCMV感染。     

夹层杯集菌离心涂片法初筛肺结核患者的临床应用价值

目的探讨夹层杯集菌离心涂片法检测抗酸杆菌提高门诊肺结核患者诊断准确率的临床应用价值。方法对1 762例门诊疑似肺结核患者的痰标本同时进行直接涂片法、浓缩集菌涂片法和夹层杯集菌离心涂片法检测抗酸杆菌,比较3种方法对即时痰的阳性检出率;对145例确诊肺结核住院患者的痰标本同时进行浓缩集菌涂片法和夹层杯集菌离心涂片法检测抗酸杆菌,比较2种方法对清晨痰的阳性检出率。结果夹层杯集菌离心涂片法检测门诊即时痰标本抗酸杆菌阳性检出率为15.6%,明显高于浓缩集菌涂片法(9.2%)和直接涂片法(5.9%)(P<0.05);同时夹层杯集菌离心涂片法在检测确诊肺结核住院患者的清晨痰标本阳性检出率显著高于浓缩集菌涂片法(P<0.05)。结论夹层杯集菌离心涂片法检测抗酸杆菌能够有效地提高门诊患者的确诊率,减少肺结核病的漏诊率,为临床医生的诊断治疗提供了重要参考依据。     

SARS期间住院儿童SARS-CoV(IgG)抗体水平回顾性分析

目的回顾性分析SARS期间在院儿童SARS-CoV（IgG）抗体的出现规律，探讨儿童与成人产生SARS-CoV（IgG）抗体的差异。方法ELISA及蛋白芯片法检测85例在院儿童SARS-CoV（IgG）抗体水平。结果在院患者中儿童比成人抗体阳性率要高（17．6％vs6．3％，P〈0．05），其中自血病患儿阳性率最高，达31．6％，蛋白芯片技术分析发现主要为病毒N、3CL、Sl蛋白抗原反应阳性。结论在院儿童具有较高的SARS-CoV（IgG）抗体阳性率。     

我国SARS病毒BJ01株基因组亚cDNA克隆的构建与鉴定

目的：构建我国SAILS病毒BJ01株基因组全序列的cDNA克隆，为进一步构建该毒株的全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法：根据BJ01株病毒基因组序列中含有的特异酶切位点，利用DNAstar软件设计7对引物。然后通过RT-PCR扩增出覆盖病毒基因组全长的7个cDNA片段，并分别将其克隆至pGEM-T Easy或Topo载体。结果与结论：已构建出SARS-CoV BJ01株基因组的7个亚cDNA克隆，经酶切鉴定和序列测定表明，所获得的cDNA克隆为BJ01株病毒的特异序列。     

SARS冠状病毒对心脏及其传导系统影响的病理学研究

目的 探讨严重急性呼吸综合征(SARS)对心脏、尤其是心脏传导系统的影响。方法 应用HE、组织化学及核酸原位杂交等方法,对6例SARS死亡患者的心脏组织及其中1例死者的心脏传导系统进行病理研究。结果 SARS患者的心脏损伤表现为心肌细胞空泡变性、萎缩和少数心肌细胞肌浆溶解,心肌问质轻度水肿、少量炎细胞浸润及轻度小血管炎;Macchiavello染色示心肌细胞胞质内偶见病毒包涵体;核酸原位杂交示少部分心肌细胞及心脏传导系统特化心肌细胞内呈现明确的冠状病毒(SAPS-CoV)阳性杂交信号。结论SARS-CoV不仅能够感染心肌细胞,而且可感染心脏传导系统中的特化心肌细胞,可引起心脏轻度病毒性心肌炎性改变。该研究结果为解释临床上SARS患者心律失常和心肌酶谱异常提供了重要的病理学依据。     

SARS-CoV细胞受体的研究进展

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是由SARS冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV)感染引起的一种新发严重急性呼吸系统传染病.SARS-CoV受体的阐明对于了解病毒的宿主与组织嗜性具有重要意义,同时也有助于了解病毒的致病机制以及研发阻止病毒结合受体的抗病毒药物.目前的研究发现SARS-CoV的受体包括血管紧张素转换酶2(ACE2)和CD209L,二者在SARS-CoV的感染致病过程中均发挥重要作用.本文综述了在SARS-CoV细胞受体结构与功能方面的研究进展.     

SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA的构建与鉴定

目的:构建我国自行分离的SARS冠状病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,为阐明SARS病毒致病的分子机制奠定基础。方法:采用分段克隆的方法对病毒全基因组进行分段扩增和克隆,然后将全基因组各cDNA片段分别进行体外连接获得全长cDNA分子,并对其接头序列进行PCR扩增和测序鉴定。结果与结论:获得了SARS病毒BJ01株基因组全长cDNA分子,对其接头处序列的测定结果表明,该全长cDNA分子为SARS病毒BJ01株的特异序列。     

人类流感病毒多重PCR分型方法的建立

目的建立一种可以同时检测人类A型流感病毒,B型流感病毒及A型流感病毒H1,H3,H5亚型的多重RT-PCR方法。方法根据人类流感病毒的特异性基因设计并合成多对特异性引物,建立可同时扩增出人类流感病毒亚型特异性片段的多重PCR的方法。同时,对该方法的特异性和敏感性进行了评价,并利用该方法对39份疑似swineH1N1的临床标本进行检测。结果该方法可同时扩增出A型流感病毒M基因203bp,B型流感病毒M基因296bp,A型流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为362bp（H1）,112bp（H3）,188bp（H5）,494bp（swineH1）。该实验最低可检测新甲型H1N1（A/Beijing/501/2009）病毒RNA0.5TCID50。该方法的特异性实验结果显示,在多重PCR检测中未检出非特异扩增的PCR产物。同时,使用该方法从39份疑似新甲型H1N1的临床咽拭子标本中检测出新甲型H1N1阳性的标本4份（10.2%）,季节性H1N1亚型2份（5.1%）,H3N2亚型12份30.7%,本次实验结果与WHO通过实时PCR方法检测的结果一致。结论本研究建立的多重PT-PCR方法快速、敏感,特异性强,可用于人类流感病毒的分型检测。     

SARS冠状病毒的多组织嗜性及其全基因序列的测定

目的研究SARS冠状病毒对不同组织的感染情况,了解SARS流行初期病毒的基因组序列。方法用Trizol RNA抽提试剂提取因SARS病毒感染而死亡的3例死者不同组织中的总RNA,并逆转录为cDNA,然后用针对SARS病毒不同基因区间的引物进行PCR扩增,并对其中1例肺组织中病毒全序列进行了测定。结果3例病例中有2例仅在肺组织中扩增到病毒序列,另1例除在肺组织中检测到病毒外,还在气管、肾、淋巴结及肝组织中检测到病毒的存在。病毒全序列分析结果显示,该序列全长为29760个碱基,具有典型的冠状病毒序列特征,除具有RNA聚合酶基因和s、E、M和N4种结构蛋白基因外,还有另外8个蛋白编码框。经与GenBank上登录的部分其他SARS冠状病毒全序列进行比对,发现该序列除存在少量的SNP外,还多出一段29个核苷酸的序列,这段序列的存在完全改变了ORF10和ORF11两个蛋白编码框,使得在此终止的蛋白翻译能够继续进行下去,从而使ORF10和ORF11两个读框成为一个读框。结论SARS病毒具有多组织嗜性;该序列有可能是病毒从动物传到人的原始序列。