人CD40L胞外区和人CTLA4Ig双基因共表达腺病毒载体的克隆和鉴定

目的：构建人CD40L胞外区和CTLA4Ig双基因共表达重组腺病毒载体并鉴定。方法：RT-PCR扩增人CD40L胞外区片段，与致瘤素信号肽连接后构建穿梭质粒，经酶切、插入、同源重组，获质粒pAdshCD40L-IRES2-CTLA4Ig，经293细胞包装，获共表达双基因的腺病毒pAdvshCD40L-IRES2-CTLAg，并行凝胶电泳、PCR、共聚焦显微镜检测。结果：电泳、PCR扩增出了600bp和400bp的特异性片段、共聚焦显微镜观察到CD40L绿色荧光和CTLA4Ig红色荧光的共表达。结论：成功构建了人CD40L．胞外区和CTLA4Ig共表达双基因重组腺病毒载体。     

CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞抑制淋巴细胞活化的实验研究

目的:研究CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞(BMSCs)对淋巴细胞活化的抑制效应。方法:CTLA4Ig重组腺病毒载体转染BMSCs,以RT-PCR、免疫细胞化学、蛋白印迹法检测CTLA4Ig的表达情况,MTT法、ELISA法观察转染上清对混合淋巴细胞反应(MLR)体系中淋巴细胞活化、增殖的抑制效应。结果:转染组及转染后传两代BMSCs中检测到CTLA4Ig基因的转录,CTLA4Ig弥漫表达于细胞浆;转染后检测培养上清CTLA4Ig即呈阳性,72h达高峰,传一代培养上清中仍可检测到;转染上清对淋巴细胞的增殖、IL-2分泌有明显的抑制作用。结论:CTLA4Ig重组腺病毒能有效介导CTLA4Ig基因在BMSCs中的表达。且CTLA4Ig能有效抑制淋巴细胞的活化、增殖。     

大鼠CTLA4-FasL融合基因的克隆、表达及体外生物活性研究

目的 表达并纯化CTLA4-FasL重组融合蛋白,鉴定其体外生物活性,为今后将该重组基因用于真核或者病毒载体递送系统的体内研究做准备.方法 用RT-PCR方法从大鼠脾细胞中钓取CTLA4和FasL胞外区基因,搭建二者融合的重组基因,以pGEX-6P-1载体表达和纯化融合蛋白;去除GST标签,获得的目的 蛋白经体外流式检测分析与细胞表面的相应配体B7和受体Fas分子的结合;CCK8检测系统分析其抑制T淋巴细胞的增殖作用.结果 与结论成功调取了目的 基因,获得并纯化了CTLA4-FasL目的 蛋白,该蛋白既可与细胞表面的B7配体结合,又可与细胞表面的Fas受体结合,并能明显抑制T淋巴细胞的增殖,为今后动物体内研究奠定了基础.     

miR-195重组腺病毒表达载体构建及在细胞中的表达

目的:利用AdEasy系统构建miR-195的腺病毒表达载体,为研究miR-195的功能提供条件.方法:将miRNA-195前体序列从已构建的pcDNA-miR-195载体中克隆进穿梭载体pAdTrack-CMV,通过与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中高效同源重组,获得完整的重组腺病毒质粒.利用HEK293细胞包装并扩增重组腺病毒Ad-195.Ad-195感染肺癌细胞A549后,利用miRNA的定量RT-PCR技术检测Ad-195在细胞中表达miR-195情况.随后荧光素酶报告基因实验证明,Ad-195表达的miR-195能够作用于BCL2基因上预测的miR-195靶位点.结果:实时定量PCR检测显示,Ad-195感染肺癌细胞A549后,miR-195表达水平有显著的上调.结论:miR-195的腺病毒表达载体构建成功,能够用于在细胞内过表达具有生物学功能的miR-195.     

脑红蛋白重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的：为进一步研究脑红蛋白（NGB）的生理功能并为基因治疗缺血性脑损伤提供有效的表达载体，应用细菌内同源重组方法分别构建含NGB及绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体，并对其进行鉴定。方法：用电转方法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183-pAdEasy-l细菌，再以后者作为电感受态细菌，与线性化质粒pShuttle-CMV-NGB进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-NGB，转染293细胞。制备含脑红蛋白基因的重组腺病毒。结果：通过PCR、序列测定和Western印迹杂交鉴定，确认该重组腺病毒表达载体可正确表达脑红蛋白。结论：成功地构建了表达NGB基因的重组腺病毒载体，为深入开展脑红蛋白的功能研究以及用于缺血性脑损伤疾病的基因治疗奠定了基础。     

重组NIS基因腺病毒的制备及在心肌细胞中的特异表达

目的 构建肌凝蛋白轻链-2(MLC-2v)启动子调控的NIS腺病毒载体,探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性.方法 将MLC-2v启动子和NIS基因亚克隆至腺病毒穿梭载体,再与含有骨架质粒(pAdEasy-1)的大肠杆菌(BJ5183)同源重组,经人胚肾细胞(HEK293)包装并扩增得到重组腺病毒Ad-MLC-NIS,同时构建巨细胞病毒(CMV)启动子调控的腺病毒Ad-CMV-NIS、仅含有启动子的腺病毒Ad-MLC和仅含有NIS基因片段的腺病毒Ad-NIS作为对照组.腺病毒体外感染心肌细胞和非心肌细胞,通过Western blot检测NIS蛋白的表达,行动态摄碘及NaClO4摄碘抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性.通过台盼蓝染色实验检测腺病毒感染及NIS摄碘情况对心肌细胞活力和增殖的影响.结果 成功构建重组NIS腺病毒.Western blot检测示感染Ad-CMV-NIS的心肌细胞和非心肌细胞均呈NIS蛋白高表达;感染Ad-MLC-NIS的非心肌细胞出现微量蛋白表达,而心肌细胞中NIS蛋白高表达.动态摄碘实验示感染Ad-MLC-NIS的H9C2细胞、A549细胞、U87细胞摄碘峰值分别为5844.0、833.6、846.0放射性计数·min-1.H9C2细胞的摄碘被NaClO4抑制.感染复数(MOI)为100的腺病毒感染心肌细胞,感染和摄碘实验对心肌细胞活力和增殖的影响较小.结论 MLC-2v启动子调控的腺病毒载体可使外源基因NIS在心肌细胞内特异性表达,表达的NIS蛋白具有摄碘功能,为NIS在心肌中作为报告基因的研究奠定了基础.     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

重组腺病毒Ad-mALR和Ad-hALR的构建及其对棕榈酸(PA)诱导的L02细胞凋亡的影响

目的 构建含肝再生增强因子(ALR)基因的重组腺病毒并探讨其抗凋亡功能.方法 采用基因重组法构建重组穿梭载体pAdTrack-TO4-mALR和pAdTrack-TO4-hALR,同源重组法构建重组腺病毒Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR,4轮扩增后获得高滴度Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR.将上述腺病毒感染L02细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达了解其感染率;Western blotting法检测ALR及Bcl-2/Bax蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测ALR对棕榈酸(PA)诱导的L02细胞凋亡的影响.结果 重组腺病毒Ad-GFP-mALR和Ad-GFP-hALR构建成功,且均能高效感染并稳定表达于L02细胞.与非感染组和感染空载病毒组相比,过表达ALR能促进L02细胞的增殖,并抵抗PA诱导的L02细胞凋亡作用,明显降低Bax,增加Bcl-2蛋白的表达.结论 ALR对寸L02细胞具有促增殖及抗PA诱导的细胞凋亡的作用.     

携带人鞘氨醇激酶及突变体基因重组腺病毒载体的制备及表达

目的制备携带人野生型鞘氨醇激酶基因(SPK^wt)及其突变体(SPK^DN)的腺病毒载体,为研究SPK的生物学功能提供高效基因转移载体。方法将野生型和突变体SPK基因亚克隆至穿梭载体pshuttle-cmv,重组的穿梭质粒经Pme线性化后,电转化E.coli BJ-AD-1感受态,获得带有目的基因的腺病毒重组子质粒;重组子经Pac I线性化后,以脂质体介导转染293包装细胞,获得重组腺病毒载体;分别行PCR鉴定重组腺病毒是否携带目的基因,Western blot鉴定目的基因是否表达,酶活性检测判断野生型基因和突变体基因表达活性。结果重组腺病毒带有目的基因,可以感染内皮细胞并正确表达,酶活性分析表明野生型SPK基因增强SPK活性,突变体SPK基因抑制SPK活性。结论成功构建了携带SPK野生型及其突受体的重组腺病毒,为研究SPK的功能提供了物质基础。     

骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响。方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达。Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况。结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性。转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加。BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节。结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化。     

BALB/c小鼠sIL-4受体基因克隆及腺病毒载体的构建

目的：克隆小鼠sIL-4R基因并构建sIL-4R基因腺病毒穿梭质粒，将之包装至重组腺病毒颗粒。方法：从小鼠脾脏细胞中提取总RNA，逆转录为cDNA，应用巢式PCR的方法克隆sIL-4R基因。目的基因经限制性内切酶酶切，定向克隆至腺病毒穿梭载体。利用脂质体将含目的基因的穿梭质粒与腺病毒包装质粒pJM17共同转染腺病毒包装细胞293细胞，PCR方法鉴定重组腺病毒阳性克隆。结果：BALB／c小鼠的sIL-4RcDNA序列与文献报道的小鼠sIL-4RcDNA序列同源性达98％，有9个碱基不匹配，与小鼠IL-4R的同种异型体的膜外区100％同源。293细胞出现特征性细胞病变。PCR鉴定获得重组病毒颗粒。结论：获得了小鼠sIL-4R基因和含sIL-4R基因的腺病毒颗粒，为探讨应用腺病毒介导sIL-4R蛋白治疗过敏性疾病打下了实验基础。     

重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

NF-κBp65特异性siRNA重组腺病毒载体的构建

目的:构建核因子-κB(NF-κB)p65特异性小干涉核糖核酸(small interference RNA,siRNA)重组腺病毒载体。方法:设计特异性NF-κBp65siRNA的靶序列对应的双链DNA,插入腺病毒穿梭质粒,然后跟腺病毒骨架质粒共转染HEK-293A细胞,穿梭质粒和骨架质粒在细胞内整合包装重组腺病毒并用β-Gal染色鉴定。重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定后,感染培养的大鼠关节软骨细胞,应用RT-PCR在mRNA水平观察NF-κBp65的表达。结果:β-Gal染色显示重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR结果显示重组腺病毒有效抑制了目的基因NF-κBp65的表达。结论:特异性NF-κBp65 siRNA的重组腺病载体可以抑制目的基因的表达,可以用于体内抑制骨关节炎的实验研究。     

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子（的hVEGF165）为靶基因,增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记（的hVEGF165）重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。