不同时间EBV-LMP2重组腺病毒体内细胞免疫效果研究

目的观察携带EB病毒(EBV)潜伏膜抗原2基因(LMP2)的重组5型腺病毒(Ad-LMP2)免疫Balb/C小鼠后,不同时间点的免疫反应。方法每只小鼠通过肌内注射的方式免疫2×109VP的Ad-LMP2重组病毒颗粒,使用γ干扰素酶联免疫斑点检测方法(IFN-γELISPOT),分别于免疫后1、2、3、4、5周检测小鼠脾淋巴细胞中,LMP2特异性释放IFN-γ的细胞数。观察不同时间点特异性CTL反应强度的变化。结果 Ad-LMP2免疫小鼠1周时,就已经产生明显针对LMP2的特异性CTL,1×106个小鼠脾淋巴细胞中,可以检测到约800个特异性释放IFN-γ的细胞。随着时间的延长,与1周时的结果相比CTL水平2、3、4周均没有明显改变,5周时稍有下降(P<0.05)。结论 Ad-LMP2免疫Balb/C小鼠,1周内就能够诱导出LMP2特异性CTL,产生的CTL能够稳定存在。     

重组人白细胞介素-12对食蟹猴的反复给药毒性研究

目的:观察重组人白细胞介素-12(rhIL-12)对食蟹猴的长期毒性。方法:食蟹猴皮下注射给予rhIL-12,剂量分别为0.5,5和40μg·kg-1,每周3次,共13周。检测指标包括临床症状、血液学、血生化、免疫、血清抗体和组织病理学检查。结果:rhIL-12给药后导致动物出现腹泻、面部及眼睑部肿胀、腹股沟淋巴结肿大、溃疡、及注射局部红斑和硬结等临床症状,并出现贫血和白细胞分类异常,血液生化指标出现肝脏转氨酶升高,免疫学指标出现外周血总T淋巴细胞比例增加,CD4细胞百分率下降,CD8细胞百分率增加。第7次给药后,给药组动物产生了rhIL-12抗体。结论:食蟹猴皮下注射给予rhIL-12,毒性靶器官和组织为血液系统、肝脏、心脏、肾脏和淋巴结等免疫调节系统,其安全剂量为0.5μg·kg-1。     

冻融人外周血树突状细胞基因疫苗体外抗肿瘤活性研究

目的观察EB病毒潜伏膜蛋白重组腺病毒(rAd-EBV-LMP2)转染的冻融人外周血树突状细胞(DC)诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗肿瘤活性。方法人外周血来源的单核细胞经细胞因子扩增培养为成熟DC,液氮冻存;rAd-LMP2重组腺病毒转染冻融DC制备疫苗。动态观察细胞形态学特征,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DC疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖活性,以及诱导的CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。结果rAd-LMP2转染的冻融DC疫苗具有形态迥异、多突起的典型形态学特征,其刺激同种T淋巴细胞的增殖能力明显高于对照组(P<0.01),能诱导高效的CTL活性(P<0.01),与新鲜DC疫苗差异无统计学意义(P>0.05)。结论rAd-LMP2转染冻融DC疫苗在体外能激发较强的EBV-LMP2特异性的功能性CTL,为EBV相关的鼻咽癌(NPC)的免疫治疗提供策略。     

鼠疫疫苗在食蟹猴模型中的免疫学评价

目的 通过将鼠疫耶尔森菌的F1抗原和重组V抗原组成的鼠疫疫苗免疫食蟹猴,对疫苗的免疫效果进行评价.方法 将20只食蟹猴按简单随机法分成低剂量组、高剂量组和生理盐水对照组,分别于0和2周肌内免疫,并于1剂后2周和2剂后2周采血.用ELISA检测免疫动物血清中的总IgG抗体;另外,分离外周血淋巴细胞,用酶联免疫斑点试验检测分泌IFN-γ的外周血淋巴细胞.用t检验对结果进行比较.结果 免疫后,对照组均未产生抗体,而疫苗组产生了较强的抗体应答.2剂免疫后2周,低、高剂量组的抗F1抗原IgG抗体几何平均滴度分别为(4.71±0.32)1g和(5.09±0.21)lg(t=-2.76,P＜0.05),两组的抗重组V抗原IgG抗体几何平均滴度分别为(4.75±0.52) lg和(5.12±0.58) lg(t=-1.37,P＞0.05).经F1和V抗原体外刺激产生IFN-γ的外周血淋巴细胞,细胞数均无明显增加.F1抗原刺激后,低、高剂量组分泌IFN-γ的外周血淋巴细胞数分别为(1±1)/106和(1±2)/106(t=-0.16,P＞0.05).重组V抗原刺激后,两组分别为(7±15)/106和(6±7)/106(t=0.88,P＞0.05).结论 鼠疫疫苗在食蟹猴模型中能诱导较强的体液免疫应答,但不能诱导明显的细胞免疫应答.     

负载EB病毒潜伏膜蛋白基因的树突状细胞疫苗的体内抗肿瘤免疫作用

目的 观察负载EB病毒潜伏膜蛋白(EBV-LMP2)基因的树突状细胞(DC)疫苗体内激活的细胞毒T细胞(CTLs),在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内对人鼻咽癌(NPC)细胞株CNE-2的免疫保护作用.方法 人外周血来源的单核细胞(PBMC)经细胞因子扩增培养为成熟DC,rAd-EBV-LMP2重组腺病毒转染DC制备疫苗,对疫苗进行致瘤性检测;采用人外周血T细胞悬液腹腔注射建立人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠(hu-PBL-SCID)模型,随机分为4组:对照组、T细胞组、未转染DC组、LMP2-DC组.末次免疫7d后,接种CNE-2细胞,观察小鼠成瘤率、成瘤潜伏期、肿瘤体积及重量;定期检测小鼠血清中人IgG水平;测定小鼠脾淋巴细胞的特异性细胞毒淋巴细胞(CTL)活性.结果 rAd-EBV-LMP2-DC疫苗接种于小鼠体内未见肿瘤形成,脾、肺、肝和肾等器官未出现肿瘤病变;小鼠血清均检测出人IgG,hu-PBL-SCID嵌合模型重建成功;LMP2-DC组肿瘤的潜伏期明显延长,肿瘤生长速度、体积及重量显著减小(P＜0.01),且LMP2-DC组小鼠脾淋巴细胞显示出对肿瘤细胞强大的杀伤活性(P＜0.01).结论 EBV-LMP2-DC疫苗能在hu-PBL-SCID小鼠体内诱导产生强大的CTL反应,保护小鼠免受肿瘤细胞的攻击,对肿瘤细胞具有有效的免疫保护作用.     

治疗用乙型肝炎腺病毒注射液TC007食蟹猴免疫原性、免疫毒性和生物分布研究

目的 重复给予食蟹猴治疗用乙型肝炎腺病毒注射液（TC007）,观察其免疫原性、免疫毒性、生物分布。方法 普通级食蟹猴随机分为溶媒对照组,TC007低、中、高剂量（1.0×10⁹、1.0×10¹⁰、1.0×10¹¹ VP/只）组,Ad5-Null（1.0×10¹¹ VP/只,空载对照）组,每组10只,背部肩胛区sc给药,每周给药1次,共7次,停药恢复28 d。应用流式细胞仪进行外周血中淋巴细胞分群检测,检测经TC007刺激后分泌干扰素-γ（IFN-γ）的特异T细胞水平;免疫组化检测肝脏IFN-γ、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）表达;试剂盒法测定血清中抗Ad5抗体的中和活性,补体成分C3、C4及免疫复合物（CIC）水平;给药期及恢复期结束,进行多个组织取材,HE染色后进行病理学阅片,TaqMan探针qPCR法进行Ad5分布检测。结果 与溶媒对照组比较,各组动物血浆中CD3⁺CD8⁺T细胞、CD4⁺/CD8⁺、CD3^-CD56⁺NK细胞、CD3⁺CD56⁺NKT细胞、巨噬细胞CD45⁺CD14⁺百分率均未见明显异常;Ad5-Null组特异T细胞均未见明显改变,TC007各剂量组针对HBV 3种抗原（Core、Env、Pol）分泌IFN-γ的特异性T细胞水平显著增加（P<0.05、0.01）,停药恢复末期（d68）,效应值仍略高;TC007各剂量组和Ad5-Null组食蟹猴肝脏组织中IFN-γ、TNF-α、IL-2均高于溶媒对照组,且呈剂量相关性,但TC007各剂量组与Ad5-Null组比较未见明显差异;TC007各剂量、Ad5-Null组动物均产生抗Ad5抗体,39/40例具有中和活性;TC007各剂量组补体C3、C4未见明显异常,高剂量组CIC轻微升高（P<0.05）。Ad5主要分布于给药局部,在腋下淋巴结有少量分布,其他组织未见分布。TC007及Ad5-Null组均可见给药局部轻微至轻度皮下组织炎性细胞浸润,停药恢复28 d,病变可见明显恢复,其他组织未见病理学改变。结论 TC007在食蟹猴体内具有一定免疫原性,抗Ad5抗体具有中和活性,高剂量组可见轻微免疫复合物形成,未见免疫器官损伤,生物分布主要集中于给药部位,可产生特异性T细胞。     

人骨髓间充质干细胞脑内注射给予食蟹猴的长期毒性研究

目的研究人骨髓间充质干细胞(BMSC)脑内注射给予食蟹猴的长期毒性,为临床试验提供依据。方法24只食蟹猴随机分为对照组(生理盐水)、低剂量组(3×105个细胞/kg)和高剂量组(2.5×106个细胞/kg),每只动物脑内基底节外囊区域定向注射人BMSC2次,间隔3周。注射后观察动物的一般毒性反应,并进行体重、体温、神经功能、心电图、血液学和血液生化学、体液免疫(IgG、IgM)、细胞免疫(CD3、CD4、CD8)、尿液、脑脊液(一般性状、细胞计数、葡萄糖、蛋白质和氯化物含量)及组织病理学等指标测定。结果病理结果显示食蟹猴脑内基底节外囊区域注射人BMSC后,注射部位大脑局部出现组织坏死及炎症反应,对照组、低剂量组和高剂量组的损伤程度和范围呈递增趋势,随着时间推移,各组脑组织病变基本修复,残存少量瘢痕组织。其他各项检测指标均未见有生物学意义的显著改变。结论在本试验条件下,2.5×106/kg的剂量范围内,人BMSC食蟹猴脑内基底节外囊区域注射仅对注射局部大脑组织产生一定的病理损伤,损伤可随着时间推移逐渐修复。     

肌肉免疫DC-EBV-LMP2诱导免疫应答的研究

目的探讨肌肉免疫DC-EBV-LMP2诱导的免疫效果。方法从BALB/C小鼠分离骨髓细胞,诱导培养获得小鼠DC,以100 MOI的rAd-LMP2感染获得DC-EBV-LMP2,继续培养48h,诱导DC-EBV-LMP2成熟。用免疫酶法确定LMP2在DC中表达。0,2,4周,以2×105个DC-EBV-LMP2/只免疫BALB/C小鼠,于第5,8周分别LMP2特异性水平和T细胞亚群的变化。结果结果显示,肌肉免疫DC-EBV-LMP2可诱导BALB/C鼠LMP2特异性免疫应答,且第5周强于第8周。CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值在第5周高于对照组,而第8周低于对照组。结论 DC-EBV-LMP2肌肉免疫BALB/C鼠可诱导LMP2特异性CTL。     

麻疹病毒DNA疫苗接种在食蟹猴中诱导特异性体液和细胞免疫应答

麻疹病毒在发展中国家仍然造成很高的发病率和死亡率。人们多方研究以求改进疫苗效果 ,除佐剂亚单位疫苗和重组病毒载体疫苗外 ,以编码麻疹病毒蛋白的 DNA质粒免疫动物的研究亦获相当进展。如接种编码麻疹病毒蛋白 DNA质粒的小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答。基因枪注射恒河猴诱生了麻疹病毒特异性中和抗体 ,并减少了猴体被攻毒后产生的麻疹病毒血症。本文作者观察了食蟹猴经 DNA质粒免疫后特异性体液和细胞免疫应答情况。　　试验中使用的 Helios TM基因枪注射系统可以直接把小量 DNA送入上皮细胞内。把编码麻疹病毒蛋白的 DNA…     

人树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫

目的探讨人树突状细胞（DC）融合肝癌细胞（HCC）体外诱导T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的作用。方法应用人重组粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素4（rhIL-4）对人外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HerG2,MTT法测定融合细胞（HerG2／DC）刺激T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性实验检测HerG2／DC诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对HerG2的特异性杀伤作用。结果融合细胞HerG2／DC刺激T淋巴细胞增值能力明显提高,HerG2／DC活化的CTL对HerG2具有明显的特异性杀伤作用。结论人树突状细胞融合肝癌细胞可有效诱导T淋巴细胞产生特异性的抗肝癌肿瘤免疫。