EBV-LMP2重组腺病毒体内细胞免疫效果及分布研究

背景与目的 EB病毒(EBV)潜伏膜抗原2是预防和治疗EBV相关肿瘤的良好靶抗原,本研究以食蟹猴为研究系统,观察携带EBV潜伏膜抗原2基因(LMP2)的重组5型腺病毒(Ad-LMP2)在动物体内引起的细胞免疫应答及病毒载体分布。方法分别使用低、中、高不同剂量的Ad-LMP2,于0周、4周以肌内多点注射的方式免疫食蟹猴,应用流式细胞仪检测动物外周血CD3、CD4、CD8阳性T细胞的比值;γ干扰素酶联免疫斑点法(IFN-γ-ELISPOT法)检测Ad-LMP2诱导的LMP2特异性CTL;RT-PCR方法检测首次和末次注射后,不同时间点外周血中重组病毒的载量,以及8周后,脑、心、肺、肝、脾、肾、睾丸、卵巢和注射局部肌肉的基因分布情况。结果与同期对照组或免疫前比较,Ad-LMP2免疫的动物外周血T淋巴细胞亚群未见差异(P>0.05);低、中、高不同剂量都能够诱导产生LMP2特异性CTL,其中,中、高剂量组反应水平较高;Ad-LMP2肌内注射后15min～1h在血中浓度最高,2～8h后分布到其他脏器。1d后,病毒主要分布在注射局部的肌肉组织中,而在脑、心、肺、肝、脾、肾、卵巢或睾丸等组织内,未检测到重组病毒。结论 Ad-LMP2在食蟹猴体内能够诱导产生LMP2特异性CTL,对T淋巴细胞亚群不产生影响,重组病毒只分布在注射局部肌肉,没有潜在危险。     

负载EB病毒潜伏膜蛋白基因的树突状细胞疫苗的体内抗肿瘤免疫作用

目的 观察负载EB病毒潜伏膜蛋白(EBV-LMP2)基因的树突状细胞(DC)疫苗体内激活的细胞毒T细胞(CTLs),在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内对人鼻咽癌(NPC)细胞株CNE-2的免疫保护作用.方法 人外周血来源的单核细胞(PBMC)经细胞因子扩增培养为成熟DC,rAd-EBV-LMP2重组腺病毒转染DC制备疫苗,对疫苗进行致瘤性检测;采用人外周血T细胞悬液腹腔注射建立人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠(hu-PBL-SCID)模型,随机分为4组:对照组、T细胞组、未转染DC组、LMP2-DC组.末次免疫7d后,接种CNE-2细胞,观察小鼠成瘤率、成瘤潜伏期、肿瘤体积及重量;定期检测小鼠血清中人IgG水平;测定小鼠脾淋巴细胞的特异性细胞毒淋巴细胞(CTL)活性.结果 rAd-EBV-LMP2-DC疫苗接种于小鼠体内未见肿瘤形成,脾、肺、肝和肾等器官未出现肿瘤病变;小鼠血清均检测出人IgG,hu-PBL-SCID嵌合模型重建成功;LMP2-DC组肿瘤的潜伏期明显延长,肿瘤生长速度、体积及重量显著减小(P＜0.01),且LMP2-DC组小鼠脾淋巴细胞显示出对肿瘤细胞强大的杀伤活性(P＜0.01).结论 EBV-LMP2-DC疫苗能在hu-PBL-SCID小鼠体内诱导产生强大的CTL反应,保护小鼠免受肿瘤细胞的攻击,对肿瘤细胞具有有效的免疫保护作用.     

DNA免疫诱导的免疫优势HCV特异性CTL表位特异性CTL的定量

确定丙型肝炎病毒 (HCV)的免疫优势细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL)表位对筛选能诱导强 CTL 应答的 HCV疫苗策略非常必要。作者采用流式细胞术检测 DNA免疫小鼠 CD8+T细胞内 γ干扰素 (IFN- γ)的方法来确定 HCV的免疫优势 CTL表位 ,同时进行细胞定量。　　将表达 HCV- 1 a基因型全长核心、E2、NS5 a、NS5 b的不同 DNA疫苗分别肌注 3种 H- 2 d 小鼠和 4种 H- 2 k 小鼠 ,4～ 6周后 ,对免疫小鼠腹腔攻击表达 HCV- 1 a核心 /E1、E1 / E2、NS5 a和 NS5 b的重组痘苗病毒 ,于 5天后处死 ;或加强 1次 DNA疫苗 ,于 1 2天后处死。小…     

新型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性研究

目的 观察新型乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原中蛋白（MHBs)核酸疫苗的免疫原性。方法 以新型人体应用载体质粒pSW3891构建MHBs核酸疫苗（pSW3891/MHBs/adr)，对照组和实验组Balb/c小鼠分别基因枪法免疫对照载体质粒（pSW3891)和MHBs核酸疫苗，采用酶联免疫吸附试验检测抗HBs,LDH释放测定法检测小鼠特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）杀伤活性。结果 MHBs核酸疫苗可在体外高效表达，免疫小鼠后可产生高滴度抗HBs，血清阳性终点滴度达1：97200,小鼠脾细胞HBs特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性达78.81%。结论 新型MHBs核酸疫苗在Balb/c小鼠实验中表现出良好的体液和细胞免疫原性。     

重组毕赤酵母HBsAg诱导小鼠细胞免疫应答的研究

目的 研究毕赤酵母表达的重组HBsAg(Pichia-rHBsAg)在小鼠中诱导T细胞免疫应答的能力,评价疫苗的免疫原性.方法 以rHBsAg免疫雌性BALB/c小鼠,制备小鼠脾淋巴细胞,并在体外以抗原/特异性多肽刺激.采用ELISA法测定抗原特异性T淋巴细胞分泌的细胞因子,酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定CTL频数.结果 由毕赤酵母表达的rHBsAg可在小鼠中诱导Th1和Th2型免疫应答;加铝佐剂的rHBsAg诱导IFN-γ的水平及CTL克隆明显高于无佐剂抗原;Pichia-rHBsAg刺激小鼠细胞免疫应答的水平强于酵母-rHBsAg,与中国仓鼠卵巢细胞-rHBsAg相仿.结论 Pichia-rHBsAg可在BALB/c小鼠中诱导较强的细胞免疫应答.     

不同剂量重组(酵母)乙肝疫苗对小鼠细胞免疫应答的研究

目的：探索不同剂量重组(酵母)乙肝疫苗对小鼠细胞免疫调节作用。方法：将HBsAg免疫Balb／C小鼠一周后取淋巴结制备淋巴细胞悬液，经HBsAg刺激培养48h后检测其诱导产生的IL-2、IFN-γ的水平，另一份细胞同样经HBsAg刺激培养56h后，用氚-胸腺嘧啶核苷(^3H-TdR)标记16h后检测T细胞增殖的水平。用不同剂量HBsAg免疫小鼠后，检测血清中抗HBsIgG2a的水平。结果：中、高剂量组小鼠产生的IL-2、IFN-γ、抗HBsIgG2a以及T细胞增殖的水平显著高于低剂量组和对照组。结论：一定剂量的重组(酵母)乙肝疫苗可上调小鼠的细胞免疫功能。     

结肠癌术后辅助免疫疗法抑制肿瘤腹腔转移的免疫机制

目的探讨辅助免疫疗法促进小鼠腹腔巨噬细胞TRAIL表达,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,抑制肿瘤腹腔转移的免疫机制。方法用氟脲嘧啶(5-FU)治疗小鼠结肠癌转移模型,辅助免疫治疗,观察各组小鼠腹腔肿瘤生长情况,ELISA方法检测脾细胞培养物上清中分泌IFN-γ的水平,FSCA分析各组小鼠脾细胞内T淋巴细胞和NK细胞比例和腹腔巨噬细胞表面TRAIL的表达。结果化疗联合免疫治疗组小鼠腹腔未见肿瘤细胞生长,脾细胞内CD3+、CD4+、CD8+的T淋巴细胞和NK细胞比例明显增高,脾细胞培养物上清中分泌高水平IFN-γ,巨噬细胞表面诱导肿瘤细胞凋亡的TRAIL分子表达明显增强。结论结肠癌术后辅助性免疫治疗,能活化特异性CTL分泌IFN-γ,改善腹腔抗原提呈微环境,诱导肿瘤细胞凋亡,对化疗药物的敏感性显著增强,是有效抑制小鼠结肠癌腹腔转移的重要免疫机制。     

肌肉免疫DC-EBV-LMP2诱导免疫应答的研究

目的探讨肌肉免疫DC-EBV-LMP2诱导的免疫效果。方法从BALB/C小鼠分离骨髓细胞,诱导培养获得小鼠DC,以100 MOI的rAd-LMP2感染获得DC-EBV-LMP2,继续培养48h,诱导DC-EBV-LMP2成熟。用免疫酶法确定LMP2在DC中表达。0,2,4周,以2×105个DC-EBV-LMP2/只免疫BALB/C小鼠,于第5,8周分别LMP2特异性水平和T细胞亚群的变化。结果结果显示,肌肉免疫DC-EBV-LMP2可诱导BALB/C鼠LMP2特异性免疫应答,且第5周强于第8周。CD8+T/CD3+T细胞亚群的比值在第5周高于对照组,而第8周低于对照组。结论 DC-EBV-LMP2肌肉免疫BALB/C鼠可诱导LMP2特异性CTL。     

艾滋病病毒外膜蛋白与干扰素融合基因表达产物的免疫学研究

为了将艾滋病病毒外膜蛋白(env)与干扰素(IFNα-2b)融合基因表达的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠，观察小鼠的免疫功能状态和细胞免疫应答，将IFNα-2b基因片段插入到env基因的下游，经脂质体转染，筛选重组痘苗病毒，经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。用重组病毒vJ16env／IFNα-2b免疫小鼠，以生理盐水和野生型痘苗病毒作为对照，检测小鼠脾淋巴细胞对ConA、LPS及IgG的反应性；用流式细胞仪测定小鼠脾细胞CD4^+、CD8^+T细胞计数与CTL。结果表明，与对照组比较，实验组脾淋巴细胞对ConA、LPS及IgG的反应性显著增高(P&;lt;0．05)；CD4^T淋巴细胞计数和CTL活性也显著增高(P&;lt;0．05)；CD8^T淋巴细胞计数呈增高趋势，但未达到显著意义的程度。结论：重组病毒vJ16env／IFNα-2b能增强小鼠的免疫功能和诱导细胞免疫。     

人结核分枝杆菌hsp70DNA疫苗的免疫保护作用研究

目的研究人结核分枝杆菌hsp70 DNA疫苗对小鼠的免疫保护作用.方法用人结核分枝杆菌hsp70 DNA疫苗免疫雄性BALB/c小鼠,8周后,用结核杆菌H37Ra进行攻击8周,检测小鼠淋巴细胞刺激指数(SI)、腹腔巨噬细胞培养上清释放NO量、小鼠血清IFN-γ、IL-2的含量,并计数小鼠肝、肺活细菌数.结果hsp70 DNA疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞刺激指数(SI)为3.24±0.57,与对照组(2.63±0.47)比较,差异不具有显著意义;腹腔巨噬细胞培养释放NO量与对照组比较无显著差异,但较对照组高26%.免疫小鼠其血清IFN-γ量为981.40pg/ml,与对照组(565.90pg/ml)相比,差异具有显著意义(P＜0.05);小鼠血清中IL-2的浓度较对照组明显提高(P＜0.05).经hsp70 DNA疫苗免疫的小鼠受结核杆菌攻击后其肺、肝脏结核杆菌数较对照组少.结论人结核分枝杆菌hsp70 DNA疫苗免疫小鼠后能提高小鼠腹腔巨噬细胞培养上清释放NO量,刺激IFN-γ、IL-2的分泌,说明此疫苗能诱导CD4+Th1和CD8+ CIL的细胞免疫反应,增强小鼠细胞免疫功能,并使小鼠能抵抗结核杆菌的攻击.