海洋细菌Thalassomonas sp. LD5中新型褐藻胶裂解酶TsAly7C的研究

目的对来源于Thalassomonas sp.LD5的褐藻胶裂解酶TsAly7C进行研究,以期获得具有优良性质的褐藻胶裂解酶,适应工业需求。方法在生物信息学分析的基础上,对TsAly7C进行了重组表达和酶学性质研究。结果通过生物信息学分析,TsAly7C属于PL7家族的第一亚家族。对重组TsAly7C(rTsAly7C)酶学性质进行分析,rTsAly7C的最适温度是30℃,最适pH为8.0(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液),在底物中添加300 mmol/L NaCl时降解能力最强。rTsAly7C的pH稳定性和温度稳定性较好,在0~30℃保存1 h仍保有80%以上的酶活,是1种适低温性褐藻胶裂解酶。Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺和十二烷基硫酸钠(SDS)对rTsAly7C的酶活有明显的抑制作用。rTsAly7C是1种双功能褐藻胶裂解酶,以内切形式裂解褐藻胶产生不饱和二糖和单糖。     

噬琼胶卵链菌β-琼胶酶基因YM01-5的克隆表达及其酶学性质的研究

目的 从青岛近海海水中分离鉴定了1株能够降解琼胶的海洋新菌—嗜琼胶卵链菌（Catenovulumagarivoransgen. nov. sp. nov.）YM01T,并对其进行了全基因组测序。本文对该菌的1个β-琼胶酶基因YM01-5进行了克隆表达,并对重组琼胶酶的酶学性质进行了研究。方法 利用镍柱亲和层析对重组琼胶酶进行了分离纯化,采用DNS法测定重组酶的酶学性质,薄层层析(TLC)和质谱(MS)法对AgaYM01-5的酶解产物进行分析。结果 β-琼胶酶基因YM01-5全长2 412 bp,编码803个氨基酸,预测分子量为91.6 kDa,其催化模块属于糖苷水解酶GH50家族。重组琼胶酶YM01-5酶学性质的研究结果表明,该酶的最适温度为40 ℃,最适pH为9.0。在35 ℃以下具有良好的热稳定性,pH 6～10之间保持较高的稳定性,在该范围的pH缓冲液中放置12 h后,YM01-5仍能保持80%以上的酶活力。此外,该重组琼胶酶降解琼脂糖的Km、Vmax值分别为15.6 mg/mL和188 U/mg, 对降解产物的薄层层析及质谱分析结果表明,β-琼胶酶基因YM01-5以外切酶的形式作用于琼脂糖产生新琼二糖作为终产物。结论 该酶降解产物单一,有利于琼胶寡糖的制备,具有较高的工业应用潜力,它的发现也为研究菌株YM01中琼脂糖的代谢通路提供了参考。     

新型甘露聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1 530 bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56 438。此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas fimi的Man26A和Cellvibrio japonicus的mannanase A氨基酸序列同源性分别为64.3%、38%。将此基因的成熟肽的编码序列克隆到表达载体pHBM905上,得到重组质粒pHBM730,将pHBM730经SalI酶切线性化后转化3株毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168,该甘露聚糖酶基因在这3种毕赤酵母中均实现分泌表达。将此3种重组毕赤酵母GS115(pHBM730)、KM71(pHBM730)、SMD1168(pHBM730)诱导产酶,对这3种重组酶进行相关的酶学性质研究。分析表明,在KM71中表达量最高,其最适反应pH值均约为6.6,最适反应温度均约为45℃。在最适反应条件下测得其酶活力为19.64 U。此结果为瓜尔豆胶降解产物的工业化应用提供了参考。     

多肋藻(Costaria costata)多糖的提取分离及理化性质分析

目的 从多肋藻(Costaria costata)中提取分离多糖并对其进行理化性质分析.方法 采用水和2%碳酸钠水溶液于85℃提取多糖,采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)分析多糖相对分子质量,用核磁共振氢谱(<'1>H-NMR)法分析褐藻胶中M/G比,用高效液相色谱法(HPLC)分析褐藻糖胶单糖组成.结果 从多肋藻中...     

氧化葡萄糖酸杆菌胞内脱氢酶Gox0525的酶学性质研究

将氧化葡萄糖酸杆菌胞内脱氢酶推测基因Gox0525克隆至表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌中得到可溶性表达的蛋白,纯化后经HPLC以及SDS-PAGE检测,表明其活性形式为四聚体.重组蛋白Gox0525属于短链脱氢酶家族,选择该家族的催化底物谱测试,结果表明Gox0525具有还原二酮的能力,且专一性利用辅酶NADPH,在pH 9.0、30℃条件下活性较高,适合保存在pH 7.0、4℃条件下.酶反应的发生对金属离子无依赖性,添加Ca2+对酶活力有促进作用,而Fe3+有抑制作用.     

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)纤溶酶PFE的分离纯化

目的从可口革囊星虫中分离纯化纤溶酶,并初步研究其酶学性质。方法实验以纤维蛋白平板法检测纤溶活性,采用匀浆、抽提离心、G-25脱盐、DEAE梯度洗脱等方法从可口革囊星虫中分离纯化出纤溶酶PFE,并进一步研究pH、温度、金属离子及抑制剂对该酶活性的影响。结果分离纯化得到纤溶酶PFE,SDS-PAGE法测得相对分子质量为35kDa左右。此外,其酶学性质研究结果表明:PFE的最适反应pH为7.4,酶活力在pH6.6～9.0时相对稳定;PFE在20～40℃条件下,酶活力保持相对稳定。Fe3+对酶活性有强烈的抑制作用,Ca2+、Mg2+、Fe2+、K+、EDTA和β-巯基乙醇对酶活性均具有一定的抑制作用。结论可口革囊星虫中存在纤溶酶PFE,此酶可直接降解纤维蛋白,具有重要的临床开发价值。     

温敏载体固定化木瓜蛋白酶的特性及其消化HCG抗体的应用

以温敏性材料N-羟基琥珀酰亚胺活化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)为载体制备固定化木瓜蛋白酶,对其酶学性质进行了研究。结果表明:固定化酶的最适pH值为7.5,最适温度为65℃,米氏常数为2.72 mg/mL;经过24次温敏循环操作,剩余相对活力86.6%;在4℃条件下放置60 d,剩余相对活力为71.5%。与游离酶相比,固定化酶pH值稳定性、热稳定性、操作稳定性和储存稳定性都有显著提高。将此固定化酶应用于HCG单克隆抗体消化,与纤维素固定化酶相比,水解能力更强,更适合于大分子的酶解,特别是抗体片段的制备。     

链球菌噬菌体透明质酸裂解酶的异源表达及酶学性质表征

透明质酸酶是一类能降解透明质酸的酶的总称，在生物医药及药物递送等多方面具有重要的应用价值。为了挖掘高活性、高底物特异性及高稳定性的透明质酸酶，对来自链球菌噬菌体的透明质酸裂解酶(HylP)进行了异源表达及酶学性质表征。结果表明HylP由337个氨基酸残基构成，是多糖裂解酶家族16(PL16)新成员，重组HylP可在大肠埃希菌BL21(DE3)中可溶性表达，纯化产率可达到30 mg/L，最适酶活反应条件为40℃、pH 6.0，且在35℃及pH 6.0～7.0的中性条件下较为稳定。HylP专一性作用于透明质酸，比活力为24 u/mg；该酶的米氏常数(K_m)为0.13 mg/mL，催化常数(k_cat)为13.80 s^-1，具有较好的催化活性。链球菌噬菌体来源的HylP具有中温、高特异性、高酶活的特性，在绿色制备功能性低分子透明质酸上有潜在应用价值。     

耐热脂肪酶产生菌FS1403的分离筛选和16SrDNA基因序列的分析

从菲律宾火山口土样中分离、筛选获得一株产脂肪酶的耐热菌FS1403,对该菌脂肪酶的酶学性质初步研究表明:酶的最适作用温度为55℃,60℃处理1h保持70%酶活性,为中度耐热脂肪酶.酶的最适pH值为8.0,在pH 7～pH 10的条件下酶活都比较稳定.采用细菌16SrDNA通用引物,PCR扩增、克隆并分析了该菌的16SrDNA基因序列,同源性和系统发育学分析表明菌株FS1403与Bacillus subtilis具有最紧密亲缘关系.     

三斑海马多糖的单糖组成测定影响因素考察D

目的 研究不同因素对三斑海马多糖(HTP)降解的影响,探求适合其单糖组成测定的降解条件。方法 通过设计正交实验,采用三氟乙酸(TFA)对HTP进行降解,结合1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色谱进行单糖组成分析,比较各实验的降解情况。结果 HTP中主要含有Man、GlcN、Gal和少量的GalN、Glc、GlcA、Ara、Fuc共8种单糖。在考察条件范围内,温度和时间是影响单糖组成分析的主要因素,酸浓度是次要因素。HTP中各单糖的最适降解条件是：氨基糖GlcN和GalN为120 ℃,6 h,4 mol/L TFA;中性糖Man、Glc和Gal为110 ℃,4 h,3 mol/LTFA;糖醛酸GlcA及Ara、Fuc为100 ℃,2 h,3 mol/L TFA。通过对10种单糖标准品的降解也发现氨基糖(GlcN和GalN)较稳定,糖醛酸(GlcA和GalA)稳定性差。结论 HTP中不同结构类型的单糖对降解条件的敏感度不同：糖醛酸易降解释放,但也易被破坏;氨基糖较难降解,但降解后较为稳定;中性糖的降解难易和稳定性介于两者之间。采用同一条件降解不能准确地测定HTP的单糖组成,需要针对不同结构类型单糖的性质采用不同的条件进行降解。     

Inhibitory effects of triterpenes and flavonoids on the enzymatic activity of hyaluronic acid-splitting enzymes

The effect of triterpenes and flavonoids on the activity of several hyaluronic acid-splitting enzymes was investigated. Studies showed that the inhibitory effect of the triterpenes glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid is dependent on the source of hyaluronate lyase. Hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae (Hyal B) and recombinant hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae (rHyal B) demonstrated strongest inhibition. In contrast, hyaluronate lyases from Streptomyces hyalurolyticus (Hyal S), Streptococcus equisimilis (Hyal C) and hyaluronidase from bovine testis (Dase) showed only reduced inhibition action. A non-competitive dead end inhibition with Ki=3.1+/-1.8x10(-6) mol/mL and Kii=6.7+/-2.4x10(-6) mol/mL was found for glycyrrhizin on recombinant hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae. The inhibitory effect of flavonoids on Hyal B, rHyal B and Dase was determined depending on the number of hydroxyl groups and side chain substituents in the molecule. Flavonoids with many hydroxyl groups inhibited hyaluronate lyase stronger than those with only a few. Native hyaluronate lyase (Hyal B) showed a more extensive inhibition than the recombinant protein (rHyal B). Accordingly, the inhibition by triterpenes and flavonoids is presumably specific for each hyaluronic acid (HA)-splitting enzyme.     

Lyase to live by: Sphingosine phosphate lyase as a therapeutic target

Background: Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a bioactive lipid that regulates cell proliferation, survival and migration and plays an essential role in angiogenesis and lymphocyte trafficking. S1P levels in the circulation and tissues are tightly regulated for proper cell functioning, and dysregulation of this system may contribute to the pathophysiology of certain human diseases. Sphingosine phosphate lyase (SPL) irreversibly degrades S1P and thereby acts as a gatekeeper that regulates S1P signaling by modulating intracellular S1P levels and the chemical S1P gradient that exists between lymphoid organs and circulating blood and lymph. However, SPL also generates biochemical products that may be relevant in human disease. SPL has been directly implicated in various physiological and pathological processes, including cell stress responses, cancer, immunity, hematopoietic function, muscle homeostasis, inflammation and development. Objective/methods: This review summarizes the current know-ledge of SPL structure, function and regulation, its involvement in various disease states and currently available small molecules known to modulate SPL activity. Results/conclusion: This review provides evidence that SPL is a potential target for pharmacological manipulation for the treatment of malignant, autoimmune, inflammatory and other diseases.     

构建高表达酪氨酸酚裂解酶重组大肠杆菌合成左旋多巴

以PCR技术扩增得到弗氏柠檬酸细菌ATCC 8090中酪氨酸酚裂解酶的结构基因tpl,与表达载体pQE30连接后构建质粒pQTPL,并转化到E. coli M15中进行表达,在加入0.2mmol/L的IPTG、18℃表达14h的诱导条件下,酪氨酸酚裂解酶比活为208u/mg.50ml摇瓶中E.coli M15(pQTPL)合成左旋多巴产量达55g/L.     

以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物

进入21世纪，结核病仍然是临床上发病率和死亡率最高的传染病之一。目前，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的多重耐药，以及在抗结核药物作用过程中结核分枝杆菌的持留状态，已成为全世界结核病控制工作的主要障碍。异柠檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）是乙醛酸循环途径中的关键限速酶之一，决定了结核分枝杆菌的持留性。在文中我们将描述异柠檬酸裂解酶的基本性质及结构特征，希望能通过对ICL抑制剂作用区域的了解来推动抗持留结核分枝杆菌药物的研究。     

肝素酶和碱性成纤维细胞生长因子与胃癌转移和预后的关系

目的探讨肝素酶和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在胃癌组织中表达及其与大肠癌临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测80例胃癌石蜡切片和20例癌旁正常胃黏膜中肝素酶和bFGF的表达情况,分析两者分别表达及共表达与胃癌患者年龄、性别、分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移的关系。结果免疫组织化学染色结果表明:80例胃癌中有49例(61%)呈肝素酶阳性表达,52例(65%)呈bFGF阳性表达,主要表达在癌细胞质和(或)细胞膜中,在正常胃黏膜上皮则呈阴性表达,肝素酶和bFGF在胃癌中表达明显增高(P<0.05),且两者的表达具有明显的相关性(P<0.05)。两者单独表达和共表达均与胃癌的分化程度、分期、浸润深度、淋巴结转移有关,与患者年龄、性别无关。结论肝素酶和bFGF蛋白在胃癌组织中的表达较正常胃黏膜上皮明显上调,两者单独表达和共表达与胃癌的侵袭及转移能力密切相关。     

Alternative therapies to address the unmet medical needs of patients with phenylketonuria

Standard therapy for phenylketonuria (PKU), the most common inherited disorder in amino acid metabolism, is an onerous phenylalanine-restricted diet. Adherence to this stringent diet regimen decreases as patients get older, and this lack of adherence is directly associated with cognitive and executive dysfunction and psychiatric issues. These factors emphasize the need for alternative pharmacological therapies to help treat patients with PKU. Sapropterin dihydrochloride is a synthetic form of tetrahydrobiopterin, the cofactor of phenylalanine hydroxylase that in pharmacological doses can stabilize and increase residual enzyme activity in some patients with PKU. About one-third of all patients with PKU respond to oral sapropterin. Phenylalanine ammonia lyase (PAL) is a prokaryotic enzyme that converts phenylalanine to ammonia and trans-cinnamic acid. Phase I and II trials have shown that injectable recombinant Anabaena variabilis PAL produced in Escherichia coli conjugated with PEG can reduce phenylalanine levels in subjects with PKU. The most frequently reported adverse events were injection-site reactions, dizziness and immune reactions. Additionally, oral administration of PAL and delivery of enzyme substitution therapies by encapsulation in erythrocytes are being investigated. Novel therapies for patients with PKU appear to be options to reduce phenylalanine levels, and may reduce the deleterious effects of this disorder.     

铜绿假单胞菌中乙酰化褐藻胶的生物合成和功能研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上三大机会致病菌之一,可导致多种急慢性感染。铜绿假单胞菌感染人体后,往往会转变成过量产生乙酰化褐藻胶的粘液型细菌,并形成生物被膜(biofilm)。一旦形成生物被膜,细菌将具有极强的抗生素耐药性和逃避机体免疫系统攻击的能力,造成临床上难治性、持续性感染。乙酰化褐藻胶是P. aeruginosa 生物被膜的主要成分,决定了生物被膜的结构与功能。因此,本文从乙酰化褐藻胶的生物合成途径及调控机制、在细菌中的生物学功能及作为抗菌药物开发靶点等几个方面进行了综述。     

肝素酶 碱性成纤维细胞生长因子与大肠癌转移和预后的关系

目的探讨肝素酶(heparinase)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大肠癌组织中表达的临床意义及大肠转移和预后的关系。方法采用免疫组织化学、原位杂交方法,检测115例大肠癌石蜡切片和45例正常大肠黏膜中肝素酶和bFGF的表达情况。采用χ2检验、t检验、生存曲线和Cox比例风险回归等方法分析肝素酶和bFGF分别表达及共表达的意义。结果免疫组织化学染色证实肝素酶(91/115)和bFGF(89/115)主要表达在肿瘤细胞细胞质和(或)细胞膜中,在正常大肠黏膜上皮则呈阴性表达。肝素酶在大肠癌肿瘤细胞中表达明显增高(P=0.0001),统计结果显示肝素酶和bFGF的表达具有明显的一致性(P=0.0001),两者单独表达和共表达均与大肠癌的分期、血管浸润、淋巴结转移、微血管密度和预后有关。其中,两者共表达时与分期和微血管密度的相关性更显著;另外,bFGF还与大肠癌的分化程度有关。多因素分析结果显示大肠癌的分化程度、血管浸润、淋巴结转移和bFGF表达可以作为判断大肠癌预后的危险因素,但肝素酶不是影响预后的独立因素。结论肝素酶和bFGF均与大肠癌的转移、血管生成和预后密切相关。