pCMV-DKK1/IL10双表达核酸疫苗的构建及其免疫保护效果研究

目的:构建双表达人Dickkopf 1(DKK1)表位序列和IL-10功能序列的核酸疫苗载体,检测其对胶原诱导关节炎小鼠的保护作用。方法:选择4段免疫原性较高的片段并与T细胞表位片段连接,将此基因片段与IL-10的功能片段克隆至pCMV6-XL5载体中,得到pCMV-DKK1/IL10双表达核酸疫苗载体;用此质粒DNA转染COS7细胞并肌肉注射BALB/c小鼠,分别检测核酸疫苗在细胞和小鼠体内的表达;用核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内产生的特异性抗体滴度;制备胶原诱导关节炎小鼠模型,评估核酸疫苗对胶原诱导关节炎小鼠的保护作用。结果:成功构建了pCMV-DKK1/IL10双表达核酸疫苗载体,DKK1重组蛋白和IL-10能够在COS7细胞和小鼠肌肉组织中成功表达;免疫后4周即可检测到高滴度的DKK1抗体;核酸疫苗可以减轻胶原诱导关节炎小鼠的炎症症状和骨破坏的程度。结论:pCMV-DKK1/IL10双表达核酸疫苗对胶原诱导关节炎小鼠具有保护作用,该研究结果为类风湿关节炎的治疗提供了新的思路和方向。     

肌肉注射编码Ag85A的结核病DNA疫苗具有免疫原性和保护作用

到目前为止 DNA疫苗接种的两条主要途径为 DNA溶液的肌肉注射 ( im)和 DNA包被金颗粒的表皮基因枪轰击 ( gg)。作者在BALB/ c和 C5 7BL 两个品系小鼠中对 im和gg接种编码结核杆菌 Ag85 A的 DNA疫苗的免疫原性和保护效力进行了比较。　　 6～ 8周龄雌性 BALB/ c或 C5 7BL 小鼠间隔 3周 im或 gg接种结核病 DNA疫苗 3次 ,并于最后一次接种后 3周采血。用ELISA测定抗 Ag85 A抗体 ,并取脾细胞进行细胞毒性 T淋巴细胞 ( CTL )应答测定。结果显示 ,在 BALB/ c小鼠中 ,gg免疫诱生抗体和 CTL应答所需的 DNA质粒量比 im免疫低 5 …     

EGFR/HER2联合多肽表位疫苗的构建及体液免疫学分析

构建以乙肝病毒核心抗原(HBcAg)为载体的带有1个EGFR和2个HER2的模拟B细胞表位多肽的融合表达质粒pET28a/HBcAg-△n,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫BALB/c小鼠获得抗目的蛋白的抗体。采用PCR法将3个模拟表位插入HBc序列的第78～79位,再将该序列克隆入pET28a载体中,构建重组表达质粒,用大肠杆菌BL21(DE3)作宿主菌表达出融合蛋白HBHE,纯化后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫应答。测序结果表明,重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白表达正确,ELISA检测到高滴度抗体。以HBcAg为载体的B表位被成功表达和纯化,获得高滴度的与3个B表位结合的抗体,为进一步研究HER家族成员联合多肽表位疫苗的广谱抗肿瘤作用奠定了基础。     

合成的重组流感疫苗诱导的长期免疫力和株间交叉保护作用

作者将激发B细胞、辅助性T(Th)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的三个表位的寡核苷酸(HA91-108、NP55-69和NP147-158),分别插入沙门菌鞭毛蛋白基因中,得到杂交鞭毛蛋白Fla-55、Fla-147和Fla-91.将其免疫BALB/c小鼠,检测特异性体液免疫和细胞免疫应答.为评估疫苗诱导长期记忆和保护作用的能力,作者分别用Fla-对照、Fla-91+Fla-147和Fla-55+Fla-91+Fla-147鼻内免疫小鼠3次,间隔3周.末次免疫后1、4和7个月,用流感病毒A/得克萨斯/77攻击.结果表明,合成疫苗诱导的保护性免疫力至少可持续7个月.含有三种表位的疫苗免疫效果最好.Th表位与另两种表位协同时,可明显增强保护作用.所有A/H3株都有HA91-108,所有甲型病毒都具有核蛋白.因此有必要确定这些表位疫苗能否诱导交叉保护.结果表明,小鼠免疫后1个月,用甲型流感病毒株(两株为H3N2亚型,1株为H2N2型)攻击,接种Fla-91疫苗的小鼠仅能抵抗H3亚型病毒,增加Fla-147能增强Fla-91的保护力,对H2株也     

能增强抗原特异性免疫应答的新局部接种法

DNA疫苗局部接种于皮肤是一种有用的接种方法 ,但其诱导的免疫应答水平较低。为了克服这一难题 ,作者采用了一种新的局部接种技术 ,即先用快速作用粘合剂去除小鼠皮肤角质细胞 ,然后再将表达细胞因子〔白细胞介素 1 2 ( IL- 1 2 )和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 ( GM- CSF)〕的质粒 ( p IL- 1 2和p GM- CSF)和 1型人类免疫缺陷病毒 ( HIV-1 ) DNA质粒 ( p CMV1 6 0 B/pc REV)涂于皮肤进行局部接种。　　作者分别在 0、7和 1 4天将 1 0～ 1 0 0 μgDNA表达质粒涂于去除角质层的雌性BALB/c小鼠皮肤 ,于末次加强后 7天和 3个月…     

抗JEV质粒DNA免疫:膜锚定和分泌性包膜蛋白的免疫原性

乙型脑炎病毒 ( JEV)包膜 ( E)蛋白能刺激机体产生抗病毒中和抗体。作者用聚合酶链反应法扩增 JEV GP78株的前膜 ( pr M)和 E蛋白区基因并克隆于 p CEP4真核表达载体 ,得到 p MEa(能合成 pr M和膜锚定 E蛋白 ,Ea)和 p MEs(能合成 pr M和分泌性蛋白 ,Es)两种质粒 DNA。为研究其免疫原性并与市售JEV灭活疫苗作比较 ,作者对 BALB/c小鼠进行了免疫和加强免疫 ( 50 μg质粒 DNA或空白载体肌注、1μg质粒 DNA基因枪皮肤注射、1 /1 0人用剂量的 JEV灭活疫苗接种 )。免疫后 7周用致死量 JEV( 2 0 L D50 )进行脑内攻击。攻击前用 …     

肌肉注射卵白蛋白/白细胞介素18融合DNA可有效诱导抗原特异性Th1型免疫应答

Th1型细胞可选择性分泌白细胞介素 2( IL- 2 )、γ干扰素 ( IFN- γ)和 β肿瘤坏死因子( TNF- β) ,调节以补体结合和调理抗体 (如Ig G2 a同种型抗体 )产生为特征的细胞介导免疫。作者构建了一种携带卵白蛋白 ( OVA)和 IL - 1 8( IFN-γ诱导因子 ) c DNA融合基因的哺乳动物细胞表达质粒 p OVA/IL- 1 8,并在 C57BL/6小鼠中研究了其是否能有效诱导抗原特异性 Th1型免疫应答。　　作者首先对含 SV4 0复制起点并表达免疫球蛋白基因的哺乳动物细胞表达质粒进行修饰 ,以去除其中绝大部分免疫球蛋白编码区及新霉素抗性基因 ,随后分别…     

弓形体重组质粒pcDNA_3-SAG1免疫小鼠诱导的细胞免疫应答研究

目的 :用 pc DNA3- SAG1真核表达质粒直接免疫小鼠 ,观察 DNA免疫所诱导的小鼠细胞免疫应答 ,为研制弓形虫疫苗奠定基础。方法 :大量制备重组质粒 pc DAN3- SAG1,然后将其导入 BAL B/ c小鼠体内 ,每隔 2 1d接种一次 ,一共免疫三次。用 MTT方法对脾脏的 NK细胞和其淋巴细胞的转化率进行测定 ;采用免疫荧光法对 CD4+、CD8+ 细胞进行测定。结果 :实验组 NK细胞杀伤率为 :70 .0± 3.6 4,而 pc DNA3及空白对照分别为 :48.5± 6 .0 8和 47.0± 5 .93。实验组 NK细胞活性比对照组明显增高 (P<0 .0 5 ) ,而 pc DNA3质粒及空白对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对 T淋巴细胞亚群 CD4+、CD8+进行动态分析 ,可见随着感染时间的延长 ,CD8+的数量逐渐上升 ,CD4+ / CD8+的比率逐渐下降 ,实验组与 pc DNA3质粒及空白对照有明显差异 (P<0 .0 5 ) ;Con A刺激小鼠淋巴细胞转化实验 ,能刺激免疫鼠及对照鼠淋巴细胞增生 ,实验组与 pc DNA3质粒及空白对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论 :重组质粒pc DNA3- SAG1免疫 BAL B/ c小鼠可诱导一定的细胞免疫。     

NF-κB p65反义寡核苷酸对TNBS诱导结肠炎小鼠结肠炎症和外周血T细胞及其亚群的影响

目的 探讨核因子(NF)-κB p65反义寡核苷酸(ASODN)对实验性结肠炎裸鼠(BALB/c)结肠炎症、外周血T细胞及其T亚群的影响.方法 采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠造模,并将造模型成功的40只BALB/c小鼠均分为模型对照组(UC组)和NF-κB p65反义寡核苷酸组(ASODN组)、错义寡核苷酸组(MSODN组);另设正常对照组(NC组).于造模后24 h对ASODN组、MSODN组小鼠分别进行ASODN、MSODN灌肠治疗.灌肠后第7天处死小鼠,收集结肠组织进行病理评分,收集外周血于流式细胞仪进行T细胞及其亚群测定.结果 ASODN组小鼠的结肠炎症评分较UC组和MSODN组明显改善[(5.26±0.88)vs.(10.32±1.25)和(10.40±1.28)](P＜0.05),但仍高于NC组的(1.95±0.50)(P＜0.05).(2)ASODN组小鼠T淋巴细胞、Th细胞百分比值、Th/Ts比值较UC组、MSODN组明显升高(P＜0.01),Ts细胞百分比则有降低(P＜0.05).结论 TNBS能损伤小鼠的细胞免疫功能,NF-κB p65 ASODN能修复并建立新的免疫平衡,改善结肠炎症.     

局部涂抹流感DNA疫苗的保护作用

流感疫苗一般采用血凝素 ( HA)和神经氨酸酶 ( NA)作抗原 ,肌肉注射。但 HA基因易突变 ,也有以突变率较小的核蛋白 ( NP)为抗原的疫苗。基质 ( M)基因产物有比 NP更低的突变率和分子量 ,因此作者选用编码流感病毒 M蛋白等的 DNA疫苗 ,研究经皮免疫的效果。　　作者将 6～ 8周龄 BALB/c小鼠背部皮肤用粘胶除去表皮层后 ,分别以 5、2 0、1 0 0μg剂量于 0、7、1 4天三次局部涂抹流感病毒 A/PR/8/34株 M基因 DNA疫苗 p ME1 8S- M。在免疫前和免疫的第 2 1天采集血液和粪便样品 ,用 EL ISA检测抗体滴度 ;通过细胞毒性 T细胞 ( C…     

截短的HCV核心蛋白DNA疫苗在小鼠诱导迟缓但强烈的免疫应答

将编码丙型肝炎病毒 ( HCV)核心蛋白 1～ 1 76位氨基酸的 DNA片段插入真核表达质粒载体 p AEC- K6 ,得到质粒 p IDKCo。以 6～ 8周龄雌性 BAL B/c小鼠为动物模型 ,实验组和对照组各 6只。实验组于四头肌注射p IDKCo,对照组注射空载体 p AEC- K6。两组小鼠分别在 0、3、7、1 4和 2 1周注射质粒1 0 0μg。在初次免疫后的 0、2、4、6、8、1 0、1 2、1 6、2 3及 2 7周取小鼠血清 ,用含 HCV核心蛋白 1～ 1 2 0位氨基酸的重组蛋白 Co.1 2 0作为捕获抗原 ,用 EL ISA和竞争 ELISA检测小鼠血清的抗 HCV核心抗体 ,并还用Co.1 2 0作…     

编码曼氏血吸虫天冬酰胺酰基内肽酶(Sm32)的DNA疫苗在小鼠中诱生的抗血吸虫繁殖能力

本文介绍了运用 DNA疫苗技术在小鼠中诱生针对曼氏血吸虫半胱氨酸蛋白酶——天冬酰胺酰基内肽酶 ( Sm32 )的免疫应答。作者将编码 Sm32的 c DNA,在人巨细胞病毒( CMV)启动子 /增强子的驱动控制下克隆至哺乳动物表达载体中 ,构建成 p RK7- Sm32 ,并转染哺乳动物细胞 COS- 7。将 50 μl DNA构建体 ( 1 mg DNA/ ml)耳廓注射 6～ 1 2周龄雌性 NMRI小鼠 ,免后不同时间点尾静脉采血。为检测体内表达 ,小鼠于胫骨前肌肉注射DNA构建体 1 0 0μl,1 2天后处死小鼠 ,收集肌肉组织。用逆转录聚合酶链反应 ( RT-PCR)、蛋白印迹法和免疫荧光…     

自身热休克蛋白60和破伤风类毒素及其衍生肽作为肺炎球菌结合疫苗的载体

作者将自身和外源性多肽及其来源的蛋白与4型肺炎球菌( Pn)荚膜多糖( PS4 )结合来诱导抗Pn的T细胞应答。载体分别是自身热休克蛋白6 0 ( HSP6 0 )及其p4 58m片段和外源性免疫蛋白破伤风类毒素( TT)及其T细胞表位肽p30。采用不同品系雌性小鼠( BAL B/ c、BALB/ k、BAL B/ b、C57BL/ 6、CD1、NOD)对与不同载体结合的PS4疫苗进行研究,分析鼠龄、注射次数及抗PS4抗体水平对抵抗致死剂量攻击的影响,同时检测抗载体抗体及疫苗在不同品系小鼠中的效力。　　将PS4与载体按一定的质量比结合,分别制成PS4 - p4 58m、PS4 - p30、PS4 …     

完整的重组酵母疫苗能激活DC并诱导保护性细胞免疫

为确定重组酵母是否能诱导保护性细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL )应答 ,作者应用E.G7- OVA肿瘤模型〔表达鸡卵清蛋白(OVA)的 EL- 4小鼠淋巴瘤细胞〕进行研究。C57BL / 6小鼠 (H- 2 b)皮下注射磷酸盐缓冲溶液 (PBS)或 2× 1 0 7表达 OVA的重组酵母(OVAX) ,每周 1次 ,第 2次注射后 7天用EL- 4或 E.G7- OVA细胞攻击小鼠。结果显示 ,模拟物和 OVAX免疫小鼠都逐渐产生了EL- 4淋巴瘤 ,但是 OVAX免疫小鼠能预防E.G7- OVA肿瘤形成 ,而 PBS免疫小鼠则不能。将研究动物换成 CD8+缺乏的 C57BL/6- Cd8atm IMak基因敲除小鼠 ,则两组…     

通过DNA疫苗控制病原体基因来影响抗原提呈

作者以破伤风毒素 C片段 (Fr C)和流感病毒核蛋白 (NP)为模型 ,构建有或无前导序列的质粒 p.L Fr C、p.L NP或 p.L -Fr C、p.L- NP,比较 Fr C和 NP送递至不同胞内位点对免疫应答的影响。将质粒体外瞬时转染 COS- 7细胞 ,检测蛋白的表达水平。5 0 μg质粒 DNA于 0、2 1和 42天分两点注射于 6～ 1 0周龄 C5 7BL /6小鼠的股四头肌 ,并于 0、2 1、42、5 6或 6 3天取鼠尾血测抗体 ,于35或 5 6天取脾细胞检测细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL)应答。同时于 0、2 1、2 8天以 5 μg重组 Fr C或 5 0μg半纯化的 NP与弗氏完全佐剂混合后皮…     

C3d增强麻疹血凝素中和抗体滴度的研究

作者研究了表达分泌型麻疹血凝素 ( H)和补体成分 C3d融合物的 s H- 3C3d- DNA疫苗诱导中和抗体应答的情况。　　用 p TR6 0 0表达载体构建两种疫苗质粒 :一种表达麻疹病毒 Edmonston株的分泌型血凝素 ( s H) ,另一种表达 C3d和 H的融合物 ( s H- 3C3d)。 s H包含 H的胞外部分 ,但不包括跨膜区和胞质区。　　采用 6～ 8周龄 BALB/c小鼠 ,用基因枪腹部接种 2剂共 0 .1μg DNA,于 4、2 6周用相同剂量各加强 1次。用 1 2 %脂质转染胺试剂转染 2 μg DNA于人胚肾细胞 2 93T,以抗原捕捉 ELISA法检测 H。运用 EL ISA法检测血清抗 …     

弓形体SAG1基因DNA诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究

目的 :用重组真核表达质粒 pc DNA3- SAG1直接免疫 BAL B/ c小鼠 ,观察其 DNA免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法 :大量制备重组质粒 pc DNA3- SAG1,然后将其导入 BAL B/ c小鼠体内。抗体滴度用 EL ISA法进行测定 :采用 PCR方法对小鼠的血液组织外源基因进行检测 ;对试验组及对照组进行 RH株攻击感染 ,并对其进行分析。结果 :用 EL ISA法检测的抗体 Ig G滴度为 1∶ 2 5 6 0 ;免疫后三周、六个月从免疫鼠的血液组织中用 PCR仍可检测到特异的SAG1基因的存在 :体外弓形虫攻击感染实验组和对照组 ,可见实验组的存活时间较对照组时间延长 (P<0 .0 5 )。结论 :重组质粒 pc DNA3- SAG1免疫 BAL B/ c小鼠可诱导一定的体液免疫应答和一定的保护性作用     

DNA免疫诱导抗HCV核心抗原的体液与细胞免疫应答的鉴定

丙型肝炎病毒 (HCV)是引起急、慢性非甲非乙型肝炎的主要原因。目前尚无有效的预防制剂。序列分析表明 ,HCV的核心基因是高度保守的区段 ,故近年来人们的研究集中在以含有核心及包膜基因的质粒进行的DNA免疫上。本文报告了以插入 HCV核心基因片段的重组质粒 p CI- HCV- C免疫小鼠所诱导的免疫应答情况。　　将编码 1～ 1 91氨基酸的 HCV核心基因插入 p CI质粒的 Mlu 及 Xba 酶切位点之间 ,构建携带 HCV核心基因的重组质粒p CI- HCV- C。将纯化的 p CI- HCV- C质粒1 0 0μg注入 6～ 8周龄雌性 BAL B/c小鼠胫骨肌肉内 ,以 p…     

编码38kDa蛋白细胞毒性和辅助性T细胞表位的DNA疫苗对抗结核杆菌细胞免疫的诱导

作者构建了编码结核杆菌 3 8k Da蛋白两个表位的 DNA疫苗 ,并与已报道能诱导强 CD8+细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL)和 1型辅助性 T细胞 (Th1 )应答的编码完整 3 8k Da蛋白的 DNA疫苗 p XJ3 8进行了比较。　　作者首先将编码 3 8k Da蛋白 Th表位的DNA序列插入载体 VR1 0 1 2特定酶切位点间 ,构建成质粒 v Th;将编码 CTL 表位的DNA序列单独或与编码 Th表位的 DNA序列同时插入 pc DNA3 .1 +,构建成质粒 p P3和 p Th P3。将重组后的质粒转入大肠杆菌DH5α大量扩增 ,通过聚合酶链反应 (PCR)或限制酶切分析筛选阳性克隆。用 1 0 0 …     

多价小基因DNA疫苗诱导免疫应答的定量定性分析

作者比较了多价小基因 DNA疫苗与全长蛋白疫苗诱导的 CD8+T细胞应答及保护效力 ,并证实了位于翻译起始密码子侧翼的Kozak序列对小基因疫苗的重要性。　　作者用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒( LCMV)感染 8～ 1 2周龄 CB/ 6小鼠后 7天 ,取小鼠脾细胞与转染了 p CMV- SV(具有Kozak- GCCATGA序列的质粒 )、p CMV-SV- (具有 GCCCATG序列的质粒 )或p CMV- β(表达 β-半乳糖苷酶的质粒 ,阴性对照 )的组织培养细胞 BAL B c1 7( H- 2 d)和 KO(H- 2 b)一起培育。细胞毒性试验结果显示 :转染了 p CMV- SV的 KO细胞被细胞毒性 T…