新型丝素蛋白支架复合兔髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的研究

目的探讨新型丝素蛋白多孔支架复合经PKH26标记的兔髓核细胞初步构建组织工程髓核的可行性。方法消化分离兔髓核细胞,培养获取P1代细胞,对P1代髓核细胞行番红O以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色;PKH26标记兔髓核细胞,MTT法检测标记前后髓核细胞增殖情况,将标记后的细胞接种支架,体外培养4 d后,将细胞-支架复合物植入裸鼠皮下,体内培养12周后,进行活体荧光成像技术检测、HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果 P1代髓核细胞番红O染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性;标记后细胞荧光强度分布均匀,标记前后髓核细胞光密度(OD)值比较差异无统计学意义(P>0.05);活体成像技术显示裸鼠皮下植入的细胞-支架复合体呈现强烈荧光;HE染色见多孔支架内壁有大量髓核细胞填满并分泌大量细胞外基质;甲苯胺蓝染色、番红O染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性,细胞周围大量细胞外基质分泌。结论以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞经体内培养形成的类髓核样组织,可用于组织工程化髓核的构建。     

PKH26标记和分子荧光活体成像技术在软骨组织工程研究中的应用

目的 探讨PKH26荧光标记和分子荧光活体成像技术在软骨组织工程中的应用。方法 用PKH26荧光标记犬软骨细胞,种植到多孔支架上,体外培养1周后异位移植到裸鼠背部,4周后用分子荧光活体成像系统示踪,并与X线检查结果对比。然后处死裸鼠取材,与免疫组织化学染色和免疫荧光观察结果对比。结果 4周分子荧光活体成像系统观察裸鼠背部标本处呈圆形强荧光,表明组织工程软骨在裸鼠体内生长良好。组织学切片结果显示番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色阳性,荧光显微镜下观察结果显示组织工程化软骨中细胞均呈红色荧光,Ⅱ型胶原免疫荧光染色呈绿色荧光,叠加后呈黄色荧光。结论 PKH26荧光标记和分子荧光活体成像2种方法结合应用于软骨组织工程中,能够较理想地且大体无创伤性评估组织工程化软骨组织在体内的生长情况。     

胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的分析

目的 通过原代软骨细胞的体外培养和鉴定,探讨胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养软骨细胞的可行性.方法 分离出兔鼻中隔软骨组织,用胰酶联合Ⅱ型胶原酶的方法进行消化,获取原代软骨细胞.使用倒置显微镜观察软骨细胞的形态及生长情况,并用甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化及免疫荧光染色进行表型鉴定.结果 软骨细胞原代培养形成单层细胞需要7～8d,传代培养时间约2～3 d,细胞以圆形或类上皮细胞形态为主,甲苯胺蓝染色证实细胞可特异性合成糖胺聚糖,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及免疫荧光染色可证实细胞可特异性分泌Ⅱ型胶原.结论 本研究成功建立了简单易行的胰酶联合Ⅱ型胶原酶法体外分离培养大量纯净的软骨细胞,提高了消化速率,加大了细胞释放率,为组织工程气管软骨种子细胞的获取提供重要的技术支撑.     

体外培养时间对兔间充质干细胞软骨形成的影响

目的　探讨生长因子(bFGF,TGF -β1)诱导下,培养时间对兔间充质干细胞(MSCs)体外软骨形成的影响。方法　取兔 MSCs 梯度离心,分离培养。取 P3、P5、P7、P10 代细胞,在 bFGF、TGF- β1 各20 ng/ml诱导下培养。观察细胞生长形态变化,用甲苯胺蓝染色观察细胞蛋白多糖的分泌。RT- PCR半定量检测Ⅱ型胶原mRNA的相对表达量,取关节软骨细胞作阳性对照。结果　各代细胞形态无明显差异。MSCs甲苯胺蓝染色呈异染性,RT- PCR检测Ⅱ型胶原阳性表达,各代细胞灰度值,P3 0 .16±0 .05,P5 0 .37±0. 03,P7 0 .88±0 .08,P10 0. 47±0. 05,软骨细胞 2 08±0 13。P7代细胞灰度值达最大(P<0 .01),软骨细胞是 MSCs的 3 倍以上。结论　生长因子能维持 MSCs细胞活性,促进生长繁殖。一定培养时间内,软骨生成能力渐增强,但随时间进一步延长,软骨分化减弱。     

菊苣酸对大鼠软骨关节炎的作用及机制

目的: 探究菊苣酸(cichoric acid)对大鼠软骨关节炎的作用及机制。方法: 分离大鼠膝关节处软骨原代细胞,利用白细胞介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor alpha, TNF-α)诱导软骨关节炎细胞模型,给予低中高剂量的菊苣酸和姜黄素干预。免疫荧光分析Type Ⅱ collagen表达水平,甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色观察干预后软骨关节炎细胞变化,β-半乳糖苷酶染色进行衰老检测,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,Western blot检测FOXO4 (forkhead box O4)、p53 (tumor protein P53)和Type Ⅱ collagen蛋白表达水平,生化检测超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD),丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和一氧化氮(nitric oxide, NO)含量。结果: 分离得到大鼠软骨原代细胞,IL-1β和TNF-α诱导细胞炎性,甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色面积增加,大鼠软骨关节炎细胞构建成功。与模型组相比菊苣酸高剂量组,甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色、β-半乳糖苷酶染色和TUNEL染色平均光密度比值,MDA含量、NO含量,FOXO4和Type Ⅱ collagen蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),p53蛋白表达水平,SOD含量显著增加(P＜0.05)。结论: 菊苣酸阻止软骨关节炎导致的细胞衰老,抑制软骨关节炎导致的细胞凋亡,进而阻止原代细胞中软骨关节炎的进展,其机制与菊苣酸下调FOXO4蛋白参与的衰老进程相关。     

兔椎间盘髓核细胞体外退变模型的建立

目的 建立兔椎间盘髓核细胞体外退变模型.方法 体外分离培养兔椎间盘髓核细胞,并传至第5代,细胞被分成原代细胞组和第5代退变细胞组,用细胞爬片进行HE染色,流式细胞术测定细胞周期,RT-PCR测定Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚合素的mRNA水平的表达,化学和免疫组织化学的方法 定量测定DNA、糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的含量.结果 退变细胞由原代细胞的多角形退变成纤维细胞样的梭形,原代细胞处于S期细胞显著多于退变细胞;退变细胞的Ⅱ型胶原和聚合素的表达显著下降,而Ⅰ型胶原的表达显著升高(P<0.01);退变细胞的DNA含量及精胺聚糖和Ⅱ型胶原与DNA的比值较原代细胞显著下降(P<0.01).结论 兔椎间盘髓核细胞传至第5代会发生显著退变,主要功能基质mRNA水平的表达和含量显著的下降;Ⅰ型胶原显著升高,有退变为纤维细胞的趋势.     

细胞与组织工程血管支架的黏附方法选择

目的 选择观察细胞和组织工程血管支架黏附的最佳方法.方法 用生物可降解材料聚β羟基丁酯(PHB)作为支架材料,运用盐析方法制成实心和不同孔径的膜片;将培养的第3代血管平滑肌细胞种植于膜片上,于培养的第1、3、7、11、14天,采用倒置显微镜下观察、苏木素-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、扫描电镜检查及MTT法检测材料上细胞附着和生长情况.结果 倒置显微镜下无法观察附着于材料上的细胞;HE和扫描电镜标本制备过程中细胞丢失多,不能为材料提供准确的信息;甲苯胺蓝染色可快速观察材料上细胞附着情况;MTT法可定量测定材料上的细胞数.经比较发现,150～200μm孔径的PHB膜片上血管平滑肌细胞附着和生长最佳.结论 甲苯胺蓝染色和MTT比色法是观察细胞在材料上黏附和生长的最佳方法.     

人端粒酶反转录酶基因感染对人髓核细胞基本特性的影响

目的验证人髓核细胞感染人端粒酶反转录酶(hTERT)基因后,髓核细胞基本特性是否发生改变,是否具有致瘤性。方法慢病毒介导hTERT基因感染人髓核细胞并进行蛋白印迹法验证,倒置显微镜观察感染hTERT基因前后髓核细胞形态以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,流式细胞术测定感染前后人髓核细胞CD24表达,以Hela细胞为对照,将髓核细胞注射裸鼠背部皮下,定期肉眼观察成瘤情况,2个月后取材行苏木素-伊红(HE)染色鉴定。结果感染hTERT后蛋白印迹法验证人髓核细胞hTERT基因表达阳性,感染前后髓核细胞形态及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色无明显变化,呈三角形或多边形贴壁生长,Ⅱ型胶原染色均为阳性;流式细胞术检测感染hTERT前后髓核细胞CD24表达均为阳性,阳性率>50%;致瘤性实验结果显示,注射Hela细胞的裸鼠背部皮下长出肿块,肿块组织经石蜡包埋切片后HE染色,染色为深紫色肿瘤细胞,注射髓核细胞的裸鼠未观察到肿物,取注射部位组织行HE染色,结果为浅红色正常组织。结论慢病毒介导hTERT基因感染人髓核细胞后,人髓核细胞基本特性没有发生明显变化,且不具有致瘤性,为深入研究髓核细胞奠定基础。     

人胚髁突软骨细胞的分离和培养

目的研究体外正常人胚髁突软骨细胞的分离、培养。方法应用两次酶消化法,在高糖型DMEM培养基中进行软骨细胞原代和传代培养,相差显微镜观察细胞,HE染色、甲苯胺蓝染色鉴定和观察细胞生物学特性。结果髁突软骨细胞胞体圆钝,呈多角形、圆形,单层＂铺路石＂样生长。HE染色见细胞质疏松,核圆形,1～2个核仁;甲苯胺蓝染色可见细胞质内有大量均匀的紫红色颗粒。结论本实验方法可获得大量均一性的髁突软骨细胞。     

重组大鼠血小板衍生生长因子（rR-PDGF-AA）对体外培养大鼠椎间盘细胞促增殖的影响作用

目的 了解重组大鼠血小板衍生生长因子(rR-PDGF-AA)在大鼠椎间盘细胞培养过程中的促增殖作用.方法 对大鼠椎间盘细胞单层培养并于传代后建立对照组与实验组,定时于倒置显微镜下观察细胞形态、增殖的变化,行HE、甲苯胺蓝及免疫组化染色;对传代细胞于固定时间测定细胞吸光度值(OD),并描绘细胞生长曲线;经流式细胞仪检测处于S(DNA合成)期的细胞百分比值.结果 ①在倒置相差显微镜下连续观察,7 d后原代细胞逐渐贴壁,多为梭形,有伪足伸出;经胰酶消化传代后,细胞贴壁生长速度加快约需4-5 d,而加入血小板衍生生长因子组椎间盘细胞汇合时间缩短,生长加速.HE染色可见细胞形态及胞内变化,甲苯胺蓝及免疫组化染色分别可见细胞外蛋白多糖及Ⅱ型胶原合成增加;②MTT法测定OD值经过方差分析检验可知,F值为20.276,P=0.000,说明五组之间比较差异具有显著性.五组之间两两比较得出对照组、1 μg/L组和10 μg/L组之间比较无差异,1000 μg/L组和100 μg/L组之间比较无差异,对照组、1 μg/L组、10 μg/L组分别与1000 μg/L组、100 μg/L组比较差异具有统计学意义;③经流式细胞仪检测可见血小板衍生生长因子在有效浓度内与处于S期的细胞百分比呈正相关.结论 血小板衍生生长因子对体外培养的椎间盘细胞的分裂增殖、基质中胶原及蛋白多糖的合成具有促进作用;并且在有效剂量范围内呈现正相关.     

Butyrate alleviates inflammatory response and NF-κB activation in human degenerated intervertebral disc tissues

Butyrate has multiple protective effects in inflammation-related intestinal diseases. Previous studies have found that butyrate could inhibit inflammation in rheumatoid arthritis. Inflammation is a pivotal inducement in the degeneration progress of the intervertebral disc. The anti-inflammatory treatment has an apparent curative effect in the symptomatic treatment of spine-related disease. Herein we investigated whether butyrate plays a protective role in degenerated intervertebral disc model. To mimic the lumbar disc local inflammatory environment, human primary nucleus pulposus cells were cultured with interleukin-1β (IL-1β, 10 ng/ml) to build a nucleus pulposus cell inflammation model. Butyrate was added to the cell culture medium to test the effect of butyrate on disc inflammation. Furthermore, a cultured nucleus pulposus tissue model was treated with butyrate (1 mM) to simulate the local treatment of intervertebral disc disease. Herein, we found that butyrate could downregulate the production of the inflammatory mediator caused by IL-1β stimulation in the cell culture model. Additionally, butyrate inhibits the secretion of pro-inflammatory cytokines or graded enzymes in disc tissues from lumbar disc herniation patients. Furthermore, the anti-inflammatory function of butyrate in lumbar disc degenerated model may be caused by inhibiting the activation of the nuclear factor kappa B (NF-κB) signal pathway. This study presents butyrate as a candidate therapeutic method to treat lumbar disc degenerative disease.     

脑缺血再灌注损伤后BMSCs 不同示踪方式的比较

目的比较脑缺血再灌注损伤后,不同示踪方式观察骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植后的效果。方法 BMSCs 复苏培养后,分别采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）、PKH26 进行标记,并且与绿色荧光蛋白（GFP）转染细胞,分别对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织进行移植。将75 只SPF 级雄性SD 大鼠随机均分为假手术组,模型组,BrdU、 PKH26、GFP 示踪组。采用线栓改良法制备大鼠左侧大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注损伤模型。脑缺血再灌注24 h 后,假手术组、模型组分别采用脑立体定位仪经脑实质植入10 μL 生理盐水;BrdU、PKH26、GFP 示踪组分别植入 10 μL 的BMSCs/BrdU、BMSCs/PKH26、BMSCs/GFP。采用神经行为学评分、TTC 染色、脑组织含水量法进行模型鉴定及疗效判定,采用焦油紫染色进行神经元计数,并在荧光显微镜下计数标记细胞阳性率。结果移植前细胞BrdU、 PKH26、GFP 标记率无明显差异。移植4 周后3 示踪组大鼠神经行为学评分、脑梗死体积、脑组织含水量均显著低于模型组,神经元计数显著高于模型组;神经行为学评分、脑梗死体积高于假手术组,脑组织含水量、神经元计数与假手术组差异无统计学意义;3 示踪组间上述指标差异均无统计学意义。GFP 示踪组的荧光标记细胞阳性率高于 BrdU、PKH26 示踪组。结论脑缺血再灌注损伤中,GFP 示踪方式效果更为持久,优于BrdU 和PKH26。     

Assessment of selective homing and contribution to vessel formation of cryopreserved peripherally injected bone marrow mononuclear cells following experimental myocardial damage

In view of a potential clinical use we aimed this study to assess the selective homing to the injured myocardium and the definitive fate of peripherally injected labeled and previously cryopreserved Bone Marrow Mononuclear cells (BMMNCs). The myocardial damage (cryoinjury) was produced in 59 rats (45 treated, 14 controls). From 51 donor rats 4.4 x 10(9) BMMNCs were isolated and cryopreserved (slow-cooling protocols); the number of CD34+ and the viability of pooled cells was assessed by flow-cytometry analysis before and after cryopreservation and simulated delivery through a 23G needle. Seven days after injury, BMMNCs were thawed, labeled with PKH26 dye and peripherally injected (20 x 10(6) cells in 500 microl) in recipient rats. Two weeks after experimental injury, the heart, lungs, liver, kidneys, spleen and thymus were harvested to track transplanted cells. Except a small amount in the spleen, PKH26+ cells were found only in the infarcted myocardium of the treated animals. Typical vascular structures CD34+ were found in the infarcted areas of all animals; treated rats showed a significantly higher number of these structures if compared with untreated. Morphological ultra-structural examination of infarcted areas confirmed in treated rats the presence of early-stage PKH26+ vascular structures derived from injected BMMNCs. The estimated mean CD34+ cells loss due to the cryopreservation procedure and to the system of delivery was 0.24% and 0.1%, respectively, confirming the feasibility of the procedure. This study supports the possible therapeutic use of cryopreserved peripherally injecetd BMMNCs as a source of CD34+ independent vascular structures following myocardial damage.     

射频热凝联合臭氧髓核消融治疗腰椎间盘突出症的临床价值

目的探讨射频热凝联合臭氧髓核消融治疗腰椎间盘突出症的临床应用价值。方法对40例腰椎间盘突出症患者采用射频热凝联合臭氧髓核消融治疗,其中22例患者射频靶点热凝术后即刻行臭氧髓核消融术,18例视具体情况射频热凝与臭氧髓核消融间隔时间1～5 d不等。对治疗后的10例患者进行0.5～4月随访,并按MacNab腰腿痛疗效评价标准进行评价。结果40例患者全部顺利完成治疗,术后显效率100%,平均住院时间7.6 d。随访10例患者中,疗效优4例,良5例,优良率占90%（9/10）,疗效差1例,占10%（1/10）。结论射频热凝联合臭氧髓核消融治疗腰椎间盘突出症具有重要临床价值。     

Piezo1 activates the NLRP3 inflammasome in nucleus pulposus cell-mediated by Ca2+/NF-κB pathway

Studying and understanding the mechanism of inflammation in nucleus pulposus is the key to understand and prevent intervertebral disc degeneration. We propose a model of mechanical sensitive ion channel Piezo1 mediated inflammation of nucleus pulposus cells. Piezo1 can up-regulate the level of interleukin-1β (IL-1β) in nucleus pulposus cells once it is activated. It is suggested that Piezo1 may mediate inflammation by activating Nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome to accelerate the production and maturation of IL-1β. The primary objective of this study was to explore whether Piezo1 activates NLRP3 inflammasome in nucleus pulposus cells. Piezo1 sensitization was induced by mechanical stretch following which we analyzed the priming and assembly of NLRP3 inflammasome and also studied if the downstream Ca²⁺/NF-κB pathway mediated this activation in nucleus pulposus cells. The expression of Piezo1 and NLRP3 inflammasome increased in a time-dependent manner upon mechanical stretch. Piezo1 activation promoted NLRP3 inflammasome assembly, which was demonstrated by the upregulation of caspase-1 activation and IL-1β production. Transfection of Piezo1-siRNA reversed this process. The inhibition of Ca²⁺/NF-κB pathway reduced Piezo1-dependent activation of NLRP3 inflammasome. Thus, we propose that activation of NLRP3 inflammasome in nucleus pulposus cells mediated by Piezo1 through the Ca²⁺/NF-κB pathway is a novel pathogenesis for the progress of intervertebral disc degeneration. As per our knowledge this is the first study which has provided evidence linking Piezo1-mediated inflammation in nucleus pulposus cells with the production of NLRP3 inflammasome.     

微创小切口椎板间开窗髓核摘除法治疗腰椎间盘突出症

目的探讨微创小切口椎板间开窗髓核摘除法治疗腰椎间盘突出症的疗效及手术相关问题。方法本组腰椎间盘突出症26例,按突出部位:L3/L42例,L4/L510例,L5/S114例。均采用微创小切口椎板间开窗髓核摘除法进行手术,术后定期随访。结果 26例均获得随访。疗效按M acnab标准评定,优18例,良7例,可1例,优良率96.2%。结论微创小切口椎板间开窗髓核摘除法治疗腰椎间盘突出症具有切口小,创伤轻,出血少,恢复快等优点,是一种理想的微创术式。     

臭氧+经皮腰椎间盘髓核切割联合治疗农村社区人群椎间盘突出的临床疗效评价与干预

[目的]探讨臭氧+经皮腰椎间盘髓核切割联合治疗农村社区人群椎间盘突出的临床效果.[方法]将来自农村社区的54例椎间盘突出患者分为两组,对照组采用传统的方法以及药物进行治疗,观察组采用臭氧+经皮腰椎f盘髓核切割术进行治疗,然后观察两组治疗效果.[结果]观察组总有效率为96.3％,对照组总有效率为78.8％,差异有显著性(P＜0.05).[结论]臭氧+经皮腰椎间盘髓核切割术治疗椎间盘突出的临床效果明显,值得在农村社区人群中实施和推广.     

退变腰椎间盘髓核组织中ADAMTS-5蛋白表达的临床意义

目的探讨ADAMTS-5蛋白在退变的腰椎间盘髓核组织中的表达的意义。方法采用免疫组织化学方法检测30例退变突出腰椎间盘患者（退变组）和28例腰椎骨折患者（对照组）腰椎间盘髓核组织ADAMTS-5蛋白表达情况。结果退变组27例（90.0%）表达阳性,对照组3例（10.7%）表达阳性,差异有统计学意义（χ2=17.8,P〈0.05）。结论 ADAMTS-5蛋白高表达可能是腰椎间盘退变突出的重要因素之一。     

腰椎间盘突出髓核在腰椎间盘突出症中的作用机制

本文综述了腰椎间盘突出髓核在腰椎间盘突出症中发病机制的论证。研究的论点在于腰椎间盘突出症的发病机制,以及手法治疗对腰椎间盘突出髓核产生的影响。现在的误区是,学术界按西医手术治疗腰椎间盘突出症的思路及影像学在治疗前后的改变来研究保守治疗腰椎间盘突出症,只着眼于突出髓核的病理意义,而无视腰椎内外平衡失调与腰椎间盘突出症的作用机制,只研究突出髓核形态学的变化而未能关注脊椎内、外平衡力学的改变。