鸡流感病毒SAα-2,3 Gal和α-2,6 Gal受体分布特点及其在流感病毒生态系统中的作用

目的：探讨鸡流感病毒受体分布特点及其在流感病毒生态系统中的位置和作用。方法：应用凝集素组织化学染色技术检测鸡呼吸道和消化道流感病毒SA受体的分布,用荧光素Alexa 488标记的禽流感病毒H9N1、人流感病毒H1N1分别与鸡呼吸道、消化道各解剖部位结合。结果：鸡呼吸道均表达SA-α2,3Gal和-α2,6Gal受体,SA-α2,6Gal受体在气管、支气管和次级支气管呈高密度分布,而SA-α2,3Gal受体在呼吸道的分布以副支气管上皮细胞为主;消化道结肠上皮细胞SA-α2,3Gal受体呈弥漫分布,但SA-α2,6Gal受体仅少量分布。同时,禽流感病毒H9N1、人流感病毒H1N1均可与呼吸道和消化道上皮细胞结合。结论：鸡同时表达SA-α2,3Gal和-α2,6Gal受体,能与禽流感病毒和人流感病毒结合,有助于病毒基因重配,可充当产生人类流感大流行潜在的中间宿主。     

实验动物小鼠及西藏小型猪和猴的甲型流感病毒受体分布特征

目的分析小鼠、西藏小型猪和猴的流感病毒sialic acid(SA)α-2,3-Gal[α-2,3-半乳糖唾液酸]受体和SAα-2,6-Gal受体在不同器官、组织分布特征,为流感病毒的组织嗜性及可能的跨种属传播提供基础数据。方法应用外源凝集素亲和组织化学染色法分析上述实验动物的流感病毒SAα-2,3-Gal受体和SAα-2,6-Gal受体的分布特点及特异性。结果除脑和心脏外,气管与支气管、肺脏、肾脏、脾脏、肝脏、小肠都有SAα-2,3-Gal和SAα-2,6-Gal受体分布,其中小鼠的SA-2,3-Gal受体主要分布在气管纤毛上皮细胞和基底细胞,SAα-2,6-Gal受体在气管纤毛上皮细胞有弥漫性表达;在肺实质,SAα-2,3-Gal受体弥漫性存在于肺泡。西藏小型猪的SAα-2,6-Gal受体主要分布在气管和支气管内上皮细胞的假复层纤毛上皮细胞,肺脏中,SAα-2,6-Gal主要分布在上皮细胞中而SAα-2,3-Gal主要分布在内皮细胞中,在肺泡内层SAα-2,6-Gal和SAα-2,3-Gal受体表达相似;猴的气管和支气管中,SA-2,3-Gal受体主要分布在气管无纤毛上皮细胞(主要是基底细胞),以及支气管部分纤毛和无纤毛上皮细胞;SAα-2,6-Gal受体在气管支气管纤毛细胞和无纤毛上皮细胞有弥漫性表达,且2种受体在肺细胞中均有分布。结论流感病毒SAα-2,3-Gal受体和SAα-2,6-Gal受体在不同器官中均有不同程度分布,其中主要分布在气管与支气管、肺脏等上、下呼吸道。     

唾液酸受体并非流感病毒各亚型在雪貂组织中播散分布的决定因子

目的 探讨流感病毒在雪貂组织中的分布与唾液酸受体的关系.方法 用病毒分离的方法分析流感病毒H5N1( SZA06H,A/VN/1203/04),SH1N1,H3N2(Brisbane/09,HK/09)在雪貂各组织中分布,用直接免疫荧光法分析雪貂各组织的唾液酸受体的分布,并通过体外实验证实活病毒与组织上受体的结合.结果 H5N1(SZ)和H5N1(A/VN/1203/04)在雪貂的肝、脾、肺、肠中有分布,H5N1(A/VN/1203/04)在脑组织中也有分布,而SH1N1、H3N2( Brisbane/09,HK/09)只分布于肠组织.而唾液酸受体SAα2,6Gal和SAα2,3Gal的Ⅰ型受体分布于脾、心、肺、肠、脑组织中,和SAα2,3GalⅡ型受体分布于肝、脾、心、肺、肠、脑组织.SH1N1病毒与SAα2,6Gal能结合,而H5N1与SAα2,3Gal结合.结论 H5N1能在雪貂的多器官组织组织中分布和繁殖,而H3N2和SH1N1仅能在肠组织中分布繁殖.SAα2,6Gal和SAα2,3Gal受体在雪貂多器官组织中均有表达,说明唾液酸受体是病毒进入的门户,但不是病毒分布的决定因子.     

犬体内唾液酸受体的组织分布及对H3N2亚型犬流感病毒的易感性研究

目的测定犬体不同组织器官内流感病毒受体的类型和分布差异,验证犬对H3N2亚型犬流感病毒的易感性。方法采集健康英国史宾格犬的不同组织器官,利用凝集素免疫荧光组织染色方法,检测组织内人型流感病毒唾液酸受体唾液酸α2,6-半乳糖(SAα2,6Gal)和禽型流感病毒唾液酸受体唾液酸α2,3-半乳糖(SAα2,3Gal)类型与分布;用H3N2亚型犬流感病毒人工感染英国史宾格犬,采集不同组织器官,用免疫组织化学染色法进行病毒的组织分布差异性分析。结果多种组织器官中同时存在着SAα2,6Gal和SAα2,3Gal两种类型的受体,少数组织器官中存在单一受体;SAα-2,6Gal受体在分布的广泛性、在同一器官中的表达量上高于SAα-2,3Gal型受体。人工感染后,病毒分布量与受体量整体趋势基本一致,仅在个别器官中存在差别。结论禽型和人型流感病毒受体广泛分布于犬的各个组织器官,犬具备同时感染禽型和人型流感病毒的分子基础。     

2株广西鸭源H6N2亚型禽流感病毒遗传进化以及对BALB/c小鼠的致病性分析

目的：探讨广西鸭源H6N2亚型禽流感病毒的分子遗传特征，评估其对哺乳动物BALB/c小鼠的致病性。方法：选择前期在广西分离的2株鸭源性H6N2禽流感病毒A/DK/GX/3101/2018(GX3101)、A/DK/GX/5220/2018(GX5220)，基因测序和遗传进化分析病毒全基因组的核苷酸同源性及遗传进化，受体结合特异性法分析2株病毒的受体结合特性，应用BALB/c小鼠评估鸭源H6N2病毒的致病性。结果：2株H6N2病毒属于欧亚谱系，HA裂解位点处为PQIETG/GL，属低致病性禽流感病毒特征，HA蛋白氨基酸位点出现E190V位点的氨基酸突变，2株病毒均识别与结合禽型SAα-2,3 Gal受体。病毒接种小鼠后，肺组织病毒分离培养阳性，小鼠肺组织出现炎症细胞浸润、肺泡结构完整性破坏，免疫组化检测病毒抗原显示，GX3101病毒接种小鼠的肺组织出现流感病毒核蛋白（NP）阳性。结论：广西鸭源H6N2毒株具有禽流感病毒的特点，可不经适应直接跨种属间屏障感染哺乳动物小鼠，须密切监测家禽中流感病毒H6N2流行和进化演变。     

甲型流感病毒HA受体结合特异性检测

目的构建甲型流感病毒HA受体结合特异性检测方法,了解当前各亚型流行株受体结合特性。方法以辣根过氧化物酶标记去唾液酸胎球蛋白(Fet-HRP),分别用α-2,3-(N)-唾液酸转移酶和α-2,6-(N)-唾液酸转移酶处理,合成3-Fet-HRP、6-Fet-HRP特异性受体拟合蛋白。分别包被怀槐凝集素(MAA)、接骨木凝集素(SNA)和各亚型流感病毒行ELISA试验进行受体特异性鉴定。结果该检测方法成功建立,各亚型与3-Fet-HRP、6-Fet-HRP均有一定结合。H1N1、H3N2亚型结合6-Fet-HRP的能力高于3-Fet-HRP,禽流感H5N6亚型偏向于与α-2,3受体结合,H7N9亚型对2种蛋白结合能力无明显差异。结论该方法对了解当前流感流行株生物学特性和未来新型毒株的传播方向和风险提供科学预测。     

H7N9禽流感病毒在鸡多个器官分布的研究

目的建立免疫荧光及激光共聚焦检测H7N9禽流感病毒的方法,了解H7N9禽流感病毒在鸡多个器官的分布情况。方法从活禽市场现场宰杀的20只活鸡中筛选H7N9禽流感病毒阳性者,取其气管、肺、肝、肠制作石蜡切片,用抗流感病毒核蛋白单抗孵育结合后与DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)及带有FITC(异硫氰酸荧光素)的二抗孵育结合,阳性样本有蓝色和绿色荧光,阴性样本仅发出蓝色荧光,用荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜分别进行观察。结果在受检的20只活鸡中,共发现9只活鸡感染H7N9禽流感病毒,感染率为45%。其中5只在气管切片观察到病毒颗粒荧光,2只在肺组织切片观察到病毒颗粒荧光,6只在肝组织切片观察到病毒颗粒荧光,5只在肠组织切片观察到病毒颗粒荧光;其中1只鸡在四种器官中均阳性,1只鸡只在肠组织切片中观察到病毒。结论鸡全身多个器官组织有H7N9禽流感病毒的受体,肺组织较其他三种器官组织受体分布少,病毒在鸡的消化道分布也较广泛,提示粪-口途径是活禽感染H7N9流感病毒的重要途径。免疫荧光及激光共聚焦实验可检测病毒在组织及细胞的分布。     

H7N9禽流感病毒对人类致病的分子基础分析

【目的】 了解H7N9禽流感病毒对人类致病的分子特征,为更好地预防与治疗H7N9人禽流感提供科学依据。【方法】 从GISAID数据库中下载中国2013年分离的所有H7N9禽流感病毒株的基因及蛋白序列,并从NCBI数据库中下载其他相关的流感病毒序列,运用生物信息学软件分析H7N9禽流感病毒基因的系统进化特征?受体结合位点?宿主特异位点?飞沫传播关键氨基酸位点?致病及毒力相关位点?耐药性位点及潜在糖基化位点等的变异情况。【结果】 2013年中国流行的H7N9禽流感病毒为四源重组病毒, 所有基因片段均来源于禽类,不含任何人流感病毒基因;病毒HA的受体结合位点发生了2个关键氨基酸的变异(G186V和Q226L);在与飞沫传播有关的关键氨基酸位点中,个别氨基酸已发生了变异(T160A? Q226L);该病毒具有8个毒力增强位点;所有分离株的M2均发生了 S31N变异;分离株A/Shanghai/1/2013的NA的耐药位点发生了R294K变异;所有毒株的潜在糖基化位点均相对保守。【结论】 H7N9禽流感病毒为四源重组的新型禽流感病毒。该病毒具有与人呼吸道上皮细胞SAa-2,6 Gal受体结合的分子基础,但目前尚未获得经飞沫传播的充分条件,人传人的可能性不大。该病毒具有低致病性禽流感病毒的分子特征,表明对禽类致病性不强,但其对人类呈高致病性,这可能与其毒力位点的特征有关。所有分离毒株均发生了对离子通道抑制剂金刚烷胺类药物的耐药性突变,个别毒株已发生了对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(达菲)的耐药性突变。     

H7N9禽流感病毒与其他流感病毒对雪貂致病性与传播力的比较

目的 针对2013年3月中国爆发的人感染H7N9禽流感病毒,在雪貂体内进行致病性及传播力的研究,并与甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒进行比较。方法 对新发H7N9毒株、甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒感染雪貂后的临床症状、体征,呼吸道排毒情况,组织病理学变化等进行评价和比较,并对H7N9毒株在雪貂群体中的传播力进行研究。结果 雪貂模型的临床症状、死亡率、病毒传播以及组织病理学分析显示：H7N9病毒的致病性低于H5N1,与2009年起源于北美的甲型H1N1流感病毒相当。新发H7N9禽流感病毒可以在雪貂的呼吸道、心脏、肝脏以及嗅球进行复制。值得注意的是H7N9禽流感可以通过飞沫在雪貂间进行低水平的传播,并且在传播过程中,病毒基因组内有多个位点的氨基酸发生了替换。结论 H7N9禽流感病毒对雪貂的致病性较H5N1禽流感病毒低,与甲型H1N1流感病毒对雪貂的致病性相当,H7N9禽流感病毒可在雪貂间进行传播。     

甲型H1N1流感病毒特征及快速检验方法

2009年4月在墨西哥暴发并导致全球广泛传播的流感病毒被命名为甲型H1N1流感病毒,该病毒属于A型流感病毒的H1N1亚型,它是猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒通过基因片段重组后产生的一种新型混合型病毒株,以前在人或猪流感中均未报     

核、膜蛋白的基因能抑制禽类流感病毒及其重组株的繁殖

对人流感病毒A/Udorn/72(H_3N_2)株与禽类流感病毒A/Mallard/NY/78/(H_2N_2)重组后的重组株分析表明,仅含禽类病毒的核蛋白(NP)或膜蛋白(M)的RNA片段的重组株,在松鼠猴的呼吸道繁殖是受限制的。另外。仅有禽类的RNAl和NS基因的重组株(Clone 12)在松鼠猴的气管内的繁殖也明显受限制,而只具有其中一个基因的Clone 9, Clone 2, 则限制就不明显。由此表明,禽类流感病毒的NP和M基因在宿主范围的繁殖限制中起主要作用,而RNAI和SN基因的结合,同样起着繁殖受限制作用。     

Identification of dual receptor-binding specific strains of human H5N1 viruses in China

Objective Both the 2,6 linkage and its topology on target cells are critical for the recognition by human influenza virus.The binding preference of avian flu virus H5N1 HA to the 2,3-linked sialylated glycans is considered the major factor limiting its efficient infection and transmission in humans.To monitor potential adaptation of H5N1 virus in human population,the surveillance of receptor-binding specificity was undertaken in China.Methods The binding specificity of 32 human H5N1 virus strains isolated from 2003 to 2009 was tested by 2,3-specific sialidase-treated chicken red blood cell (CRBC) agglutination assay and a solid-phase direct binding assay with synthetic sialylglycopolymers.Results Dual binding preference to 2,3 and 2,6-glycans were found in two strains:A/Guangdong/1/06 (A/GD/1/06) and A/Guangxi/1/08 (A/GX/1/08).Though minor effect of short-2,6-binding was detected in A/GX/1/08 at a low virus titer,both showed high affinity to the oligosaccharide at a high load.Notably both are of the long-2,6-recognition,with the same topology as that of human H1N1 and H3N2 viruses.Conclusion The findings suggest that human H5N1 virus in China likely acquired the potential human-adaptation ability.Further research and surveillance on receptor-binding specificity of H5N1 viruses are required.     

2009甲型H1N1流感病毒新进展

甲型猪源性流感病毒属正粘病毒科,其可引起猪、禽和人的上呼吸道感染。2009年3月在美国和墨西哥的流感样患者的呼吸道标本中检测出新的不能分型的甲型流感病毒,并经确认为甲型H1N1流感病毒（简称2009甲型H1N1流感病毒）。这种病毒在美国和墨西哥引起暴发流行,并蔓延到世界各地,引起一些感染者死亡。文中综述了2009甲型H1N1流感病毒在基因分型、抗原特征、传播特点、致病特点、治疗等方面与已知各流感病毒不同的特征。     

Avian influenza

Influenza is an old disease but remains vital nowadays. Three types of influenza viruses, namely A, B, C, have been identified; among them influenza A virus has pandemic potential. The first outbreak of human illness due to avian influenza virus (H5N1) occurred in 1997 in Hong Kong with a mortality of 30%. The most recent outbreak of the avian influenza epidemic has been going on in Asian countries since 2003. As of March 2005, 44 incidental human infections and 32 deaths have been documented. Human influenza viruses differ with other avian influenza viruses on the choice of cellular receptors. Avian influenza viruses bind to cell-surface glycoproteins or glycolipids containing terminal sialyl-galactosyl residues linked by 2-3-linkage [Neu5Ac(alpha2-3)Gal], whereas human viruses, including the earliest available isolates from the 1957 and 1968 pandemics, bind to receptors that contain terminal 2-6-linked sialyl-galactosyl moieties [Neu5Ac(alpha2-6)Gal]. Recent evidence suggests that human bronchial ciliated epithelial cells contain Neu5Ac(alpha2-3)Gal and can be infected with avian influenza viruses. Nevertheless, avian influenza viruses can not infect non-ciliated bronchial epithelial cells. Hence, adaptation of the avian influenza virus to nonciliated cells is a prerequisite for a pandemic virus to emerge. Biological behaviors of influenza viruses indicate that once a pandemic virus emerges, isolation is not likely to contain this epidemic. A specific vaccine against the pandemic strain will not be available until 6 to 12 months after the inception of the pandemic. Judicious use of antiviral agents and stringent disease control measures are imperative to decrease the impact of a future pandemic.     

双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒

采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。     

闽北首例禽流感H5N1病例的流行病学调查分析

目的确定闽北首例人感染高致病性禽流感疫情及感染来源,为防控疫情提供科学依据。方法采用现场流行病学调查和实验室检测相结合的方法。结果该患者咽拭子、漱口液和下呼吸道抽取物等样品检测禽流感病毒（H5N1）特异性核酸阳性,病毒分离阳性。结论本调查病例确诊为闽北首例人感染高致病性禽流感病例,感染来源可能是禽流感病毒从病死禽直接传给人,未发现人传人的现象。     

广东省揭阳市2016—2020年外环境禽流感病毒监测

目的 了解揭阳市外环境禽流感病毒动态分布情况和流行特点,评估人感染禽流感病毒的风险,为人禽流感防控提供科学依据。方法 按随机抽样的方法,对揭阳市2016—2020年5个县（市、区）禽类市场进行相关标本采集,用实时荧光定量（RT-PCR）对标本进行流感病毒A型检测,阳性标本再进行H5N6、H7N9、H9N2亚型禽流感病毒核酸检测。结果 揭阳市2016—2020年共采集外环境标本1 798份,甲型流感病毒（FluA）阳性标本660份,阳性率为36.71%;其中H5N6、H7N9、H9N2亚型阳性率分别为1.61%、1.28%和21.91%。普宁市和惠来县的外环境禽流感病毒阳性率较高,分别为54.14%和51.43%。揭西县的外环境禽流感病毒阳性率最低,为4.84%。不同类型标本检测阳性率最高为清洗禽类污水（47.09%）。结论 揭阳市禽类市场外环境中存在H5N6、H7N9、H9N2及多种亚型混合的禽流感病毒污染,禽流感病毒流行区域较广,存在感染人的风险,应继续加强外环境禽流感实时监测和城乡禽类市场卫生监管。