扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。     

中国部分地区HIV感染者/艾滋病患者外周血单核/巨噬细胞功能与疾病的进展关系

目的 通过对中国HIV感染者／艾滋病（AIDS）患者外周血单核／巨噬细胞标志抗原CD14及其早期活化分子CD69的研究,探讨其外周血单核／巨噬细胞的功能状态与HIV感染者疾病进程的关系。方法采集57例未经抗病毒治疗的HIV感染者／AIDS患者及32例健康人抗凝全血,运用流式细胞分析技术对CD4^＋T淋巴细胞、CD14^＋细胞及其CD69抗原表达情况进行测定,并采用实时荧光定量RT-PCR技术检测患者血浆HIV-1载量。结果（1）HIV感染者／AIDS患者外周血CD14^＋细胞颗粒度SSC值为76±16,CD69分子在CD14^＋细胞的表达率为27％±4％,均明显高于对照组（P〈0．05）,其中AIDS组高于HIV慢性感染（HIV）组及长期不进展（LTNP）组,HIV组高于LTNP组（P〈0．05）,LTNP组与对照组比较差异无统计学意义;外周血CD14^＋细胞比例、CD14抗原水平与对照组相比差异无统计学意义。（2）HIV感染者／AIDS患者外周血CD69分子在CD14^＋细胞的表达率与CD4^＋T淋巴细胞绝对值呈明显负相关（r=-0．872,P〈0．01）,与HIV-1RNA病毒载量呈显著正相关（r=0．697,P〈0．01）。结论中国部分地区HIV／AIDS患者外周血单核／巨噬细胞的活化和吞噬功能较健康对照组有显著上升,且与疾病进展密切相关。     

人类免疫缺陷病毒-1B和C亚型Nef蛋白特异性CD8+T细胞交叉应答反应的研究

目的：探讨中国人群人类免疫缺陷病毒-1B（HIV-1B亚型）Nef蛋白特异性CD8^＋T细胞应答在B、C亚型间的交叉反应性。方法：选取51例HIV-1B亚型感染者，采取外周血单个核细胞（PBMC），用合成的54个HIV-1B、C亚型Nef全基因序列肽库作为抗原，酶联免疫斑点吸附试验（ELISpot）方法检测HIV-1B亚型Nef蛋白特异性CD8^＋T细胞对B、C亚型抗原的应答反应。结果：在产生特异性应答效应的个体中，82．9％（29／35）感染个体同时识别B和C亚型肽段。感染个体在对两个亚型肽段的识别数量及应答强度上无显著差异（P=0．529和P=0．754）。HIV-1B亚型特异性CD8^＋T细胞能针对70．4％无论B还是C亚型的Nef肽段产生应答反应。被特异性CD8^＋T细胞同时识别的B、C亚型Nef肽段间氨基酸序列的同源性显著高于仅能被识别的B亚型或C亚型肽段的氨基酸序列（P=0．01）。结论：HIV-1B亚型Nef蛋白特异性CD8^＋T细胞应答在B、C亚型间具有良好的交叉反应性，能产生交叉反应的氨基酸序列具有较高的亚型间同源性。     

猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）恒河猴适应株耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变位点筛查

目的初步明确猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）耐9-（2-磷酸甲氧丙基）腺嘌呤（PMPA）突变基因位点,指导SIV／恒河猴模型在药物评价中的应用。方法SlVmae239恒河猴适应株感染恒河猴,之后进行PMPA治疗,测定不同时间点血浆病毒载量和外周血CD4^＋T细胞数;使用CEMx174细胞进行药物敏感实验。单拷贝PCR测定病毒rt基因变异情况。结果PMPA治疗不能有效降低感染猴血浆病毒载量,且对血CD4^＋T细胞数没有显著影响;细胞水平药物敏感实验证实该病毒株对PMPA不敏感。序列比对发现S205L和M5021可能影响到病毒对PMPA的药物敏感性。结论本研究为SIV／恒河猴模型的合理使用及HIV-1的临床治疗提供了信息。     

人类免疫缺陷病毒1 Gag-特异性T淋巴细胞增殖反应特征的研究

目的了解人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者HIV-1Gag-特异性T淋巴细胞增殖反应特征,分析它们与疾病进展的关系,探讨HIV特异性免疫功能缺陷的发生机制。方法采用BrdU掺入的流式细胞仪胞内染色法,检测34例HIV-1感染者PBMC对HIV-1Gag抗原的特异性增殖反应频率,分析它们与CD4^＋T细胞绝对值、血浆病毒载量及CD8^＋T细胞活化指标的相关性。结果HIV感染者HIV-1Gag．特异性CD4^＋T细胞增殖率显著低于健康对照组（P〈0．01）,与CD8^＋T细胞CD38表达负相关（P〈0．01）,与CD4绝对值正相关（P〈0．01）,与血浆病毒载量负相关（P〈0．05）;中国HIV感染者HIV-1 Gag-特异性CD8^＋T细胞增殖率显著高于健康对照组（P〈0．01）,与CD8^＋T细胞CD38表达正相关（P〈0．01）,与CD4绝对值显著负相关（P〈0．01）,与血浆病毒载量不相关（P〉0．05）。结论HIV感染者T细胞增殖功能异常,HIV-1Gag-特异性CD4^＋T细胞增殖功能减低,其程度与疾病进展密切相关。     

东莞市艾滋病病毒1型的分子流行病学研究

目的了解东莞市不同人群中艾滋病病毒(HIV)各亚型毒株的流行情况和传播规律。方法采集东莞市经蛋白印迹法确认的24名HIV感染者的外周抗凝血,分离单核细胞、提取核酸后用套式聚合酶链反应扩增HIV-1膜蛋白(env)基因C2-V3区的核酸片段,进行序列测定,鉴定病毒亚型。用威斯康星GCG软件进行共享序列、基因离散率的计算和毒株的聚类分析。结果在24份阳性标本中,有13份标本PCR扩增阳性,亚型分析结果表明东莞市存在HIV-1B和CRF01-AE两种亚型。结论HIV-1B和CRF01-AE可能是东莞市艾滋病病毒流行的主要亚型。     

人外周血淋巴细胞体外扩增培养前后CD25、CD29、HLA-DR系列表型研究

目的观察35例恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞在体外经扩增培养后细胞CD25、CD29、HLA—DR系列表型的变化。方法体外诱导扩增恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞及单个核细胞,应用流式细胞术测定扩增前后CD25^＋、CD29^＋、HLA—DR^＋、CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD29^＋、CD3^＋HLA—DR^＋CD3^＋HLA-DR^-、CD4^＋HLA—DR^＋、CD4^＋HLA—DR^-、CD8^＋HLA—DR^＋、CD8^＋HLA—DR^-细胞百分比的变化。结果经体外扩增培养后,CD25^＋,CD29^＋,CD3^＋HLA—DR^＋,CD8^＋HLA-DR^＋和CD8^＋HLA—DR^-细胞比例较培养前明显增加（P〈0．01）;而CD4^＋CD25^＋,CD4^＋CD29^＋CD4^＋HLA—DR^＋和CD4^＋HLA—DR^-细胞比例则明显降低（P〈0．01）;HLA—DR^＋细胞和CD3^＋HLA—DR^＋细胞培养前后细胞比例变化无统计学意义（P〉0．05）。结论经体外扩增培养后,CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）细胞比例降低,活化性T细胞的比例与培养前无统计学差异。     

直肠癌患者调节性T细胞的表达及其临床意义

①目的探讨直肠癌患者体内CD4^＋与CD25^＋调节性T细胞（treg）的含量及Fox码基因在treg中的表达覆其临床意义。②方法利用流式细胞仪检测15例直肠癌患者（观察组）术前外周血中调节性T细胞含量，同时采用RT—PCR技术检测FoxP，基因在直肠癌患者外周血treg细胞中的表达情况，并与15例健康志愿者（对照组）的外周血进行对比。③结果直肠癌患者外周血中调节性T细胞占CD4^＋T细胞总数的（11．12±0．57）％，显著高于健康对照组（8．77±0．66）％（P〈0．05）；FoxP3基因在直肠癌患者外周血调节性T细胞中呈现高表达（0．84±0．02）％，高于健康对照组的（0．76±0．03）％（P〈0．05）。④结论直肠癌患者外周血中treg的数量较正常人增高，同时伴随有FoxP，基因高表达，提示FoxP，基因可能对treg发生重要的调节功能。     

HIV-1 B亚型包膜糖蛋白gp41基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp41基因并构建真核表达我体，进一步为制备自行设计的以λ噬茵体作为栽体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以 克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板，根据Genbank中gp41基因的核苷酸序列设计引物，并在引物的5’端分别引入Kpn Ⅰ及Xho.Ⅰ酶切位点，特异性的扩增gp41基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒，再经双酶切、连接构建含gp41编码基因的真核表达栽体，并进行酶切及测序鉴定分析peDNA3、1（＋）／gp41。结果 重组质粒经Kpn Ⅰ，XhoⅠ双酶切成5、4kb与1．0kb的片断，表明表达载体peDNA3、1（＋）中插入了gp41基因片断，测序结果表明编码框正确。结论 成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp41基因的真核表达栽体peDNA3．1（＋）／gp41。     

健康人和肿瘤患者CIK细胞的生物学特性

目的 比较健康人和肿瘤患者CIK（Cytokine—induced kiuer）细胞的体外扩增速度、细胞表型和杀伤活性,以期为临床应用中效应细胞的选择提供提供实验数据。方法健康人和肿瘤患者外周血各10例,经密度梯度离心获得单个核细胞（PBMC）,以干扰素-γ、CD3MAb、IL-2和IL-1为诱导剂制备CIK细胞,直接活细胞计数法比较两者的扩增速度。流式细胞杈检测比较两者细胞表型,MTT法比较两者对K562和LOVO细胞株的杀伤活性。结果健康人外周血CIK细胞的扩增速度、对K562和LOVO细胞株杀伤活性均显著高于肿瘤患者外周血CIK细胞,（P〈0．01）;流式细胞仪检测显示健康人外周血CIK细胞CD3^＋CD56^＋百分比显著高于肿瘤患者外周血CIK细胞,（P〈0．01）。结论健康人较肿瘤患者外周血CIK细胞体外扩增快,CD3^＋CD56^＋比例高,杀伤活性强。为临床应用CIK细胞进行过继性免疫治疗提供了实验依据。     

慢性乙肝病毒携带者外周血T细胞亚群的变化及其与血清HBVDNA的关系研究

目的研究慢性乙肝病毒携带者（AsC）的细胞免疫功能变化及临床意义，探讨其与血清HBVDNA的关系。方法对120例慢性乙肝病毒携带者和60例健康人应用流式细胞仪直接免疫荧光法检测外周血T淋巴细胞亚群的百分率，并进行比较。结果乙肝病毒携带者外周血CD3^＋、CD4^＋细胞数百分率及CD4／CD8与健康对照组比较明显降低（P〈0．01）；CD8^＋细胞数百分率较健康对照组明显升高（P〈0．01）；血清HBVDNA（＋）组与HBVDNA（-）组相比，CD3^＋细胞数百分率无统计学差异（P〉0．05），CD4^＋细胞数百分率及CD4^＋／CD8^＋比值明显降低（P〈0．01），CD8^＋细胞数百分率明显升高（P〈0．01）。将HBVDNA（＋）组按高、中、低病毒载量分组进行比较，各项指标均无统计学意义（P〉0．05）。但CD4^＋、CD4^＋／CD8^＋在数值上呈下降趋势，CD8^＋呈上升趋势。结论HBV感染后可导致乙肝病毒携带者细胞免疫功能降低，HBVDNA复制进一步加重紊乱。     

外周血CD4+淋巴细胞及Th1/Th2细胞因子变化与HIV/AIDS疾病发展的相关性

目的探讨CD4^＋细胞计数和Th1／Th2细胞因子与HIV／AIDS病程进展的相关性。方法利用流式细胞术及ELISA法检测15例HIV感染者和26例AIDS患者外周血CD4^＋细胞及Th1／Th2细胞因子水平。结果与正常组比较，AIDS组中CD4^＋细胞数与Th1细胞因子（IFN-γ）水平显著下降（P〈0．01），而Th2细胞因子（IL-4）水平显著升高（P〈0．01）。HIV组CD4^＋细胞数较正常组显著下降（P〈0．01）。Th1细胞因子（IFN-γ）与Th2细胞因子（IL-4）水平无显著性变化（P〉0．05）。随着AIDS病情的加重。Th1细胞因子水平降低与CD4^＋细胞绝对数降低呈显著正相关（P〈0．001），Th2细胞因子水平增高与CD4~细胞的绝对数降低呈显著负相关（P〈0．01）。结论人体感染HIV后，CD4^＋细胞计数和Th1／Th2细胞因子水平在评估AIDS的痰病严重程度中可作为一个重要指标。     

胸腺肽-α1对老年医院获得性肺炎患者免疫功能的影响

目的探讨胸腺肽-α1．对老年患者细胞免疫功能的影响及其对医院获得性肺炎（HAP）的预防作用。方法观察治疗组30例患者在应用胸腺肽-α1，治疗后1年内发生HAP的次数，以及采用流式细胞仪检测治疗前、后T细胞亚群的变化，并与对照组进行比较。结果治疗组在胸腺肽-α1。治疗前，外周血CD3^＋、CD4^＋’及CD4^＋／CD8^＋下降，CD8^＋升高，经胸腺肽-α1。治疗1年后外周血CD3^＋、CD4^＋及CD4^＋’／CD8^＋回升、而CD8^＋下降，而且HAP的发作次数较对照组明显减少。结论胸腺肽-α1，可改善老年患者的细胞免疫功能，减少HAP的发生。     

类风湿关节炎CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的表达及其与病情关系探讨

目的：研究类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（regulatory Tcells,Treg）表达水平特点,探讨CD4^＋CD25^＋Treg在RA发生发展中的作用。方法：采用流式细胞术检测25例初发RA早期患者和13例健康人外周血CD4^＋CD25^＋Treg数量,并探讨CD4^＋CD25^＋Treg与RA活动性指标之间的关系。结果：RA患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg数量为（1．50±0．68）％,显著低于健康对照组（2．40±1．08）％（P〈0．01）。表明初发RA早期CD4^＋CD25^＋Treg数量减少。RA患者CD4^＋CD25^＋Treg水平与白介素-17、类风湿因子呈负相关（r=-0．576和r=-0．454,均P〈0．05）,与血沉和C反应蛋白无相关性（P〉0．05）。结论：RA早期患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg表达水平下降,且与病情活动程度负相关,CD4^＋CD25^＋Treg数量的减少可能与RA的发生、发展有关。     

HCV感染者外周血CD4^＋T细胞计数与病毒载量的相关性分析

目的：通过分析HCV感染者CD4^＋T细胞计数与病毒裁量（HCVVL）的相关性,探讨HCV感染时病毒水平对机体免疫状况的影响。方法：采用流式细胞技术和荧光定量PCR技术,对64例HCV感染者外周血CD4^＋T细胞计数与HCV—RNA进行检测。结果：HCV—RNA阳性组与HCV—RNA阴性组间CD4^＋T细胞计数差异无显著性（P〉0．05）;HCV—RNA阳性组CD4^＋T细胞计数与病毒载量间无相关关系（r=-0．141,P=0．406）。结论：HCV感染是否影响患者的免疫功能有待进一步研究。     

病毒含量不同的慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞亚群比较

[目的]研究慢性乙型肝炎患者外周血乙肝病毒量与外周血T淋巴细胞亚群变化的关系,探讨患者体内病毒含量与患者免疫功能状态的关系。[方法]用流式细胞仪检测60例慢性乙型肝炎患者和15名体检的健康人外周血T淋巴细胞亚群CD3^＋,CD4^＋,CD8^＋及CD4^＋／CD8^＋,荧光定量PCR法检测血清HBV-DNA。[结果]慢性乙肝患者CD4^＋,CD4^＋／CD8^＋下降,CD8^＋升高。高病毒量的患者比低病毒量患者T淋巴细胞亚群变化更明显。从HBV-DNA阴性组、低病毒量组到高病毒量组随病毒量增加,CD4^＋细胞减少,而CD8^＋升高,CD4^＋／CD8^＋下降。HBV—DNA阴性组,低病毒量组患者CD3^＋,CD4^＋,CD8^＋及CD4^＋／CD8^＋数值与正常对照比较无显著差异。[结论]高病毒量的患者比低病毒量患者T淋巴细胞亚群变化更明显。HBV-DNA阴性组,低病毒量患者CD4^＋,CD8^＋,CD4^＋／CD8^＋,与正常对照比较数量无显著差异,提示细胞功能低下。     

贫血患者外周血CD55+和CD59+细胞检测及临床意义

目的检测贫血患者外周血中红细胞和中性粒细胞膜糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接的补体调节蛋白CD55和CD59表达情况，探讨其临床意义。方法用流式细胞仪，采用直接荧光素标记的CD55和CD59单克隆抗体，测定50例健康人、18例阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）、9例再生障碍性贫血-阵发性睡眠性血红蛋白尿综合症（AA-PNH综合征）、27例再生障碍性贫血（AA）、11例巨幼细胞性贫血、8例缺铁性贫血患者外周血中红细胞和中性粒细胞膜CD55^＋和CD59^＋表达的百分率。结果外周血中红细胞和中性粒细胞膜CD55^＋和CD59^＋的百分率健康人均〉95%，PNH患者在25％～94．8％之间。巨幼细胞性贫血、缺铁性贫血患者外周血中红细胞和中性粒细胞膜CD55^＋和CD59^＋可为正常或有程度不同的CD55^＋和CD59^＋细胞缺失。结论红细胞和中性粒细胞GPI锚相关蛋白CD55^＋和CD59^＋的缺陷与PNH密切相关，利用流式细胞术同时检测外周血中红细胞和中性粒细胞膜CD55^＋和CD59^＋是目前诊断PNH最可靠、最敏感的方法，是临床鉴别诊断PNH和其它贫血性疾病的较好方法。     

安徽阜阳既往献血人群HIV-1感染者基因变异特征的研究

目的研究安徽省阜阳市既往献血人群中HIV-1感染者体内病毒流行株的亚型及序列变异特征。方法用巢式聚合酶链反应（nested-PCR）对HIV-1外膜蛋白（env）基因和核心蛋白（gag）基因进行扩增,获得244例患者的env基因V3-C3及其邻近区域序列和245例患者的gag基因区序列,应用MEGA软件进行分析,同时结合患者的疾病进展阶段进行相关性研究。结果系统进化树显示安徽省阜阳市患者体内HIV病毒的env和gag区序列属泰国B亚型;env和gag区的组内基因距离分别为9．11％和3．59％;按CD4细胞绝对计数分层,随CD4细胞绝对计数降低,env、Gag组内基因距离明显升高;随病毒载量水平增加,各组基因距离有增大的趋势,且差异均有统计学意义（P〈0．001）。env区V3环序列13份长期不进展者7份顶端四肽为GPGQ,53份缓慢进展者33份顶端四肽为GPGR,两者间差异有统计学意义（P=0．038）。结论安徽省阜阳市既往献血人群HIV-1感染者体内的病毒流行株是B′亚型。CD4和病毒载量作为疾病进程不同阶段的指标,与病毒变异有相关性,即随CD4降低、病毒载量升高病毒组内基因距离增大。HIV B′亚型V3环顶端四肽随疾病进展由GPGQ为主变为GPGR为主。     

凉山彝族自治州HIV流行毒株基因亚型分析

目的对16例来自凉山彝族自治州的HIV感染者进行亚型分析,监测该地区感染人群HIV毒株的流行情况。方法从16例HIV-1抗体阳性样本中分离外周血单核细胞（PBMC）,从PBMC中提取基因组DNA,直接进行巢式PCR扩增HIVenv基因c2～v5区及gag基因p17～p24区,对PCR产物进行核苷酸序列测定和分析,确定基因亚型。结果 16例样本全部为BC重组亚型,env基因的基因距离较gag基因远,gag基因在进化上与CRF07-BC更为接近。结论凉山彝族自治州的HIV流行毒株主要为CRF07-BC。