顺铂对豚鼠耳蜗毛细胞损害的形态及机理研究

目的：观察顺铂对豚鼠耳蜗毛细胞的损害，并阐述一氧化氮（nitric oxide,NO）在其耳毒性机制中的作用。方法：将20只豚鼠随机分成两组，试验组腹腔注射顺铂0．5ml，对照组给予同等量的生理盐水，5天后做听性脑干反应（auditory brainstem respones,ABR)测听，此后处死动物，取出耳蜗，应用免疫组化技术、光镜及扫描电镜观察耳蜗毛细胞的损害。结果：试验组动物测试ABR听阈明显提高，光镜下见耳蜗毛细胞明显变性，诱导型一氧化氮合酶阳性染色，电镜下见毛细胞的纤毛散乱、倒伏甚至散失。结论：顺铂对豚鼠耳蜗毛细胞有明显的损害作用，而O在其耳毒性机制中发挥着重要的作用。     

脑神经生长素防护顺铂致耳蜗螺旋神经节损伤的研究

目的探讨脑神经生长素 (cerebralnervegrowthfactor,CNG)作为防护药物拮抗顺铂致耳蜗螺旋神经节毒性作用。方法选 2 4只豚鼠 ,随机分为 3组 ,每组 8只。顺铂组连续 5d腹腔注射顺铂 2mg/(kg·d) ;CNG组在给予顺铂前 2d开始大腿内侧肌肉注射CNG 2mg/(kg·d) ;正常对照组连续 5d腹腔注射生理盐水 2mg/(kg·d) ;用药前后测试听性脑干反应 (auditorybrainstemresponse ,ABR)阈值 ,处死动物制作耳蜗标本 ,应用透射电镜观察并用免疫组化法测定诱导型一氧化氮合酶 (inducednitricoxidesynthase ,iNOS)的表达。结果顺铂组动物ABR听阈值显著升高 ,透射电镜下见螺旋神经节细胞的细胞器损伤严重 ,iNOS阳性染色 ,呈棕黄色。CNG组动物ABR阈值略有升高 ,但较顺铂组为低 (P <0 .0 1)。螺旋神经节细胞的细胞器损伤较轻 ,iNOS显色浅 ,呈浅黄色。结论CNG可减少耳蜗iNOS表达 ,保护耳蜗螺旋神经节 ,从而保护听力     

川芎嗪对顺铂所致耳蜗毒性保护作用的实验研究

目的 观察诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在川芎嗪(TMP)拮抗顺铂(CDDP)耳毒性中的表达情况,探讨顺铂耳毒性的致病机制及川芎嗪对顺铂耳毒性的防护作用.方法 选取50只健康豚鼠,随机分为对照组、顺铂组和中药组,各组动物均于用药前及停药后测试听觉脑干诱发电位(ABR),利用免疫组织化学方法测定各组耳蜗内iNOS的表达情况.结果 对照组ABR阈值(40.94±6.75)db,顺铂组ABR阈值为(76.26±4.54)db,中药组ABR阈值为(58.98±5.82)db,3组比较差异具有显著性(P<0.01);免疫组化结果显示iNOS在对照组不表达,顺铂组Corti氏器和螺旋神经节细胞胞浆内有强阳性表达,中药组有阳性表达,3组比较差异具有显著性(P<0.01).结论 川芎嗪可以通过抑制iNOS的表达来对抗顺铂的耳毒性.     

顺铂对豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞的影响

目的 观察顺铂对豚鼠听力的影响及豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell,SCG)毒性作用的关系.方法 将20只耳廓反应灵敏的豚鼠随机分成两组,实验组连续5 d腹腔内注射顺铂3 mg/(kg·d),对照组连续5 d腹腔内注射生理盐水3 mg/(kg·d),给药后11 d检查耳蜗电图,然后处死动物,制作耳蜗标本,其中实验组中4只4耳做透射电镜观察、6只12耳做吖啶橙荧光染色,观察耳蜗螺旋神经节细胞的变化.结果 实验组动物耳蜗神经复合动作电位(CAP)阈值明显提高,与对照组比较差异有显著性(P＜0.01);实验组潜伏期延长,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05).形态学检查见实验组髓鞘层变薄,结构稀疏,部分可见融合,细胞膜破裂,胞浆内线粒体结构模糊,粗面内织网脱颗粒,核内结构减少.结论 顺铂对豚鼠耳蜗螺旋神经节有明显的损害作用,是顺铂致耳毒性,引起听力下降的机制之一.     

顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞的损伤及凋亡作用

目的建立新生昆明小鼠离体顺铂耳毒性模型,研究顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞的损伤及凋亡作用。方法分离生后3d的昆明小鼠耳蜗基底膜,在含有1%牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基中进行培养。采用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色方法观察不同浓度顺铂对小鼠耳蜗毛细胞的损伤,同时应用Hoechst 33258染色技术检测耳蜗毛细胞的凋亡。结果不同浓度顺铂均可使小鼠耳蜗毛细胞发生凋亡的形态学变化。顺铂浓度为4mg·L-1时,耳蜗毛细胞缺失率和凋亡率明显增大,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。随着顺铂浓度的增高(8～64mg·L-1),耳蜗毛细胞缺失率和凋亡率亦显著增大,呈现明显的量效关系(P<0.01)。结论应用新生昆明小鼠能建立可靠的离体顺铂耳毒性模型;顺铂可导致耳蜗毛细胞凋亡,提示凋亡可能是顺铂耳毒性机制之一。     

硒拮抗顺铂耳毒性作用的扫描电镜观察

扫描电镜观察了联合应用硒和顺铂后大白鼠耳蜗毛细胞的形态变化。发现单用顺铂组耳蜗毛细胞大片坏死脱落,联合用药组仅在3回有少量毛细胞倒伏,而与给药先后顺序无关。提示联合用药可减轻顺铂的耳毒性。     

熊果酸对顺铂所致耳蜗氧化损伤的防护及机制研究

【立论依据】 顺铂是目前公认一线抗癌药物,被广泛用于治疗肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤。然而,顺铂能诱导耳蜗内TRPV1的高表达,进而促进ROS的过量生成并进一步引发脂质过氧化,最终使耳蜗细胞凋亡,导致听力丧失。已知熊果酸具有很强的抗氧化作用,可有效防护H₂O₂对HEI-OC1听觉细胞的破坏;并可有效抑制TRPV1的激活以发挥止咳作用。据此我们推测,熊果酸可通过抑制顺铂所致TRPV1的高表达、防止脂质过氧化,从而有效拮抗顺铂的耳毒性。 【设计思路】 应用免疫组化和免疫荧光染色、蛋白质印迹技术,结合听脑干反应(ABR)测试,研究熊果酸对顺铂所致耳蜗氧化损伤的防护作用及其机制;并选用人卵巢癌细胞株SKOV3进行体外培养,观察熊果酸对顺铂抗肿瘤作用的影响,为临床防护顺铂耳毒性提供新思路。 【实验内容】 (1)建立小鼠顺铂耳毒性模型,通过ABR测试和荧光标记,初步探明熊果酸对顺铂耳毒性的防护作用;并且选用SKOV3细胞株进行体外培养,观察熊果酸对顺铂抗肿瘤作用的影响,明确熊果酸的临床应用可行性。(2)建立小鼠顺铂耳毒性模型,应用ABR测试以评价听功能,免疫组化和免疫荧光染色、蛋白质印迹技术检测TRPV1、脂质过氧化产物4-HNE和caspase-3在耳蜗的表达,探讨熊果酸发挥防护作用的可能机制。 【材料】 成年BALB/c小鼠、人卵巢癌细胞株SKOV3、顺铂、熊果酸、抗TRPV1、4-HNE和caspase-3抗体、蛋白质印迹 检测相关试剂、细胞培养相关试剂等。 【可行性】 (1)本团队成员已熟练掌握本研究所需实验技术。(2)指导教师多年从事药物耳毒性机制与防护研究,可给予理论指导、仪器和技术支持。(3)预实验结果显示,熊果酸可有效拮抗顺铂的耳毒性,并且熊果酸不影响顺铂的抗肿瘤作用。 【创新性】 本研究首次阐明熊果酸可有效拮抗顺铂对小鼠耳蜗的氧化损伤,并进一步揭示了其发挥作用的可能机制,为临床防护顺铂耳毒性提供了实验依据。     

离体培养时bFGF对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用

目的研究不同浓度的顺铂对耳蜗基底膜毛细胞的损伤、不同浓度的bFGF对顺铂耳蜗基底膜毛细胞损伤的保护作用以及caspase-9的表达。方法对耳蜗基底膜进行离体培养,用荧光染色方法对毛细胞数量和caspase-9的表达进行观察。结果在不同浓度中,15μg/ml顺铂对基底膜毛细胞损伤最大;bFGF浓度≥100 ng/ml时,对顺铂所致的基底膜毛细胞损伤具有良好的拮抗作用。结论顺铂对耳蜗基底膜上毛细胞的损伤具有剂量依赖性;bFGF拮抗顺铂所致的耳蜗基底膜毛细胞的损伤;caspase-9的表达与bFGF对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用相关。     

熊果酸对顺铂所致小鼠耳毒性的防护作用研究

目的研究熊果酸对顺铂所致小鼠耳毒性的防护作用。方法 40只健康成年BALB/c小鼠随机分成对照组(腹腔注射等量生理盐水)、顺铂组(腹腔注射顺铂4.5 mg/kg)、顺铂+熊果酸组(一侧腹腔注射顺铂4.5 mg/kg,同时对侧腹腔注射熊果酸80 mg/kg)和熊果酸组(腹腔注射熊果酸80 mg/kg),每组10只。各组动物均连续注射5 d,每天1次。应用听脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试,观察用药前后小鼠听功能的改变;并采用异硫氰酸四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate,TRITC)标记的鬼笔环肽荧光染色方法,观察小鼠耳蜗毛细胞的形态变化。结果顺铂组小鼠ABR阈移较对照组明显增大(P<0.05),并且耳蜗毛细胞破坏严重;而给予熊果酸可有效降低顺铂对小鼠耳蜗的破坏(P<0.05)。结论熊果酸可有效防护顺铂的耳毒性,改善听功能。     

顺铂耳蜗毒性作用机制的研究进展

顺铂主要用于治疗头颈部和泌尿生殖系统的恶性肿瘤，内耳毒性是其主要毒副作用之一，防治其毒性是耳鼻咽喉科研究领域的重要课题。目前研究表明，一氧化氮与顺铂耳蜗毒性密切相关。现将顺铂耳蜗毒性机制的研究进展综述如下。     

顺铂致大鼠肾皮质一氧化氮生成量增多及水飞蓟素-葡甲胺盐对其影响

少量多次给大鼠腹注顺铂（ＣＰ）及经口给予水飞蓟素葡甲胺盐（ＳＢＭＧ）预处理后给予ＣＰ,观察血尿素氮（ＢＵＮ）含量、肾皮质一氧化氮（ＮＯ）含量及一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性等指标的经时变化。结果发现,ＣＰ可诱导ＮＯＳ活性增高,ＮＯ生成量增多;ＣＰ所致的ＢＵＮ含量与ＮＯ含量的时相变化趋势基本一致,揭示ＮＯ可能在ＣＰ所致肾损害中起重要作用。ＳＢ可使ＢＵＮ含量与ＮＯ含量降至对照组水平,表明ＳＢ可有效地预防ＣＰ所致的肾损害,该预防作用可能与ＳＢ降低ＮＯ生成量有关     

Attenuation of cisplatin induced ototoxicity by sound preonditioning through NO pathway

Objective：To explore the protective effect of sound preconditioning against ototoxicity induced by cisplatin and its possible mechanism with respect to the nitric oxide （NO） pathway. Methods： Albino guinea pigs were divided into silent control, CDDP,sound preconditioning and sound preconditioning＋CDDP groups. The animals of the CDDP group were injected with cisplatin intravenously 8 mg/kg b.w. The animals in the sound preconditioning were exposed to white noise at 85dB SPL, 5h/d, for 10 d （sound preconditioning）. The animals in the sound preconditioning＋CDDP group were treated with sound preconditioning first and then administrated with cisplatin intravenously 8 mg/kg b.w. Hearing thresholds of auditory brainstem responses （ABRs） of all animals were measured to evaluate hearing function. Hair cell loss was estimated via surface preparation. Cochlear tissue was assayed for measurement of NO level and immunohistochemistry method was used for inducible nitric oxide synthase （iNOS） analysis. Results： There was no significant difference between the silent control and sound preconditioning animals with respect to either functional or histological measures. Among the animals in the CDDP group, there was a significant elevation of threshold at the high test frequencies after administration compared with the silent control group （P〈0. 05）. Morphological examination showed that there was obvious loss of the OHC, especially in the third row of the basal turn. The NO level and immunoreactivity to iNOS in this group were higher and more intensive than those of the silent control group （P〈0. 05）. The ABR thresholds in the sound preconditioning ＋ CDDP group were much lower than those of the CDDP group （P〈0.05）. Slight sporadic loss of OHC was found in this group. The immunoreactivity to iNOS and the level of NO in cochlea decreased significantly compared with the CDDP group （P〈 0. 05）. Conclusion： It is suggested that sound preconditioning, to some extent, provides protective effect against ototoxicity of cisplatin. The excess synthesis of NO induced by the over-expressed of iNOS may be involved in the CDDP induced ototoxicity. The possible mechanism is related to suppression of the NO pathway.     

顺铂致豚鼠耳毒性作用中细胞凋亡及caspase-3表达的研究

目的：通过顺铂（CDDP）致豚鼠耳毒性作用中细胞凋亡及caspase-3表达的观察,探讨CDDP致耳毒性的作用机制。方法：实验组和对照组豚鼠各10只,前者以CDDP 2.0 mg/（kg.d）连续腹腔注射6 d,后者以等量生理盐水替代。通过ABR测试用药前后豚鼠听力的变化,应用TUNEL法检测耳蜗凋亡细胞,免疫组化法检测caspase-3在耳蜗中的表达。结果：实验组耳蜗凋亡细胞明显增多,caspase-3的表达亦明显增强。结论：caspase-3介导的信号传导机制,可能参与了CDDP所致的耳蜗细胞凋亡过程,导致耳毒性的发生。     

银杏叶提取物对顺铂耳毒性保护作用的实验研究

目的　研究银杏叶提取物对顺铂所致耳毒性的拮抗作用。方法　运用杂色健康豚鼠 2 7只 ,随机分为三组 ,I组为生理盐水组 (saline) ;II组为顺铂 (CDDP)组 ,造成损伤模型 ;III组为银杏叶提取物 (Egb +CD DP)组 ,通过观测 3组豚鼠不同时期脑干反应 (ABR)阈值的改变 ,耳蜗铺片外毛细胞形态学的改变及外毛细胞损伤率的比较。结果　银杏叶提取物可以减轻耳蜗外毛细胞的损伤率 (P <0 0 0 5 ) ,降低CDDP所致的听阈升高。结论　Egb对顺铂所致的耳毒性具有拮抗作用。     

NO含量和NOS活性在兔软骨终板退变过程中的变化

目的 研究一氧化氮(NO)和一氧化氮合成酶( NOS)在软骨终板退变中的作用。方法 将24只新西兰白兔分为实验组(n=12)和对照组(n=12),实验组通过切除兔腰椎棘上、棘间韧带,咬除部分关节突关节,分离椎旁肌造成腰椎软骨终板退变模型,分别于术后12、24、36周对腰椎摄X线片,并检测不同时间段的软骨终板中NO含量和NOS活性。结果 X线片示软骨终板随时间的延长而逐渐钙化,且实验组较对照组钙化明显;实验组各组的NO含量及NOS活性较对照组增多(P<0.05),而24周与36周实验组间NO含量及NOS活性差异不明显(P>0.05)。结论 NO和NOS在软骨终板退变过程中,其含量相应增加,提示NO可能在软骨终板退变的形成和发展中起重要作用。     

声振白蛋白和H2O2对家兔视网膜一氧化氮合成酶的影响

目的探讨声学造影剂声振白蛋白和H2O2对家兔视网膜一氧化氮合成酶（NOS）的影响。方法经兔颈动脉注射声学造影剂（声振白蛋白和H2O2）,应用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADPH）,观察注射声学造影剂后兔视网膜一氧化氮合成酶的变化。结果应用积分光密度法测定,正常组1．53±0．15,H2O2组3．48±0．37,声振白蛋白组2．82±0．24,H2O2组、白蛋白组染色强度明显高于正常组（P〈0．01）。结论声学造影声振白蛋白和H2O2对家兔视网膜一氧化氮合成酶有明显影响。     

急性血糖波动对心肌细胞内氧化应激的影响

目的:探讨急性血糖波动对心肌细胞内谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)、NO水平及iNOS表达的影响。方法:以间断静脉输注50%葡萄糖注射液48h的方法,建立急性血糖波动和高血糖动物模型。采用比色法检测心肌匀浆中(GSH-PX)、NO的水平;免疫组化的方法检测心肌细胞浆中iNOS表达。结果:急性血糖波动组心肌细胞中GSH-Px水平显著减低,NO水平及iNOS表达均显著升高。结论:急性血糖波动能导致机体的氧化应激水平明显升高,从而损伤心肌。     

中药对一氧化氮合酶/一氧化氮系统调节作用的研究进展

一氧化氮(nitric oxide,NO)是人体重要的信使分子,由内皮型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、神经元型一氧化氮合酶和诱导型一氧化氮合酶催化而成,合成后的一氧化氮迅速跨膜扩散释放,对免疫系统、神经系统等许多生理系统具有重要调节功能。血管系统的内源性一氧化氮可增强血管系统功能、舒张血管、增强血管内皮细胞存活、抑制血小板积聚和抑制白细胞浸润。然而,病理情况下一氧化氮过量产生可能通过细胞毒性作用与细胞抑制作用导致组织损伤。本文从中药调节NOS/NO系统介导相关疾病出发,综述了近五年有关中药调节NOS/NO系统及相关通路作用的研究,以期为相关疾病治疗提供新的线索或参考,为临床合理、有效用药提供科学依据。     

血清一氧化氮变化对豚鼠庆大霉素耳毒性作用影响的实验研究

目的:探讨豚鼠血清一氧化氮变化在药物性耳聋过程中的作用机制. 方法:24只健康豚鼠随机均分为正常组、庆大霉素组、庆大霉素加L.精氨酸(全程)组和庆大霉素加L一精氨酸(半程)组.观察各种豚鼠血清中一氧化氮、听觉脑干反应、内耳外毛细胞的形态学变化. 结果:庆大霉素组血清中一氧化氮与正常组差异无统计学意义(P＞0.05);L-精氨酸全程组和半程组治疗后血清中一氧化氮高于正常组和庆大霉素组(P＜0.05～P＜0.01).L一精氨酸组ABR反应阈较庆大霉素组降低(P＜0.05).L-精氨酸组内耳外毛细胞仅有散在损失. 结论:一氧化氮一定量升高对内耳毛细胞有细胞毒性作用,进一步升高则对外毛细胞有保护作用.L-精氨酸治疗能降低ABR阈值,减少外毛细胞损害,对耳蜗有保护作用.