一种针对蓝舌病毒两个不同基因片段的荧光定量PCR检测技术

目的:建立一种高灵敏度、高特异性的蓝舌病毒RNA荧光定量RT-PCR检测技术,能够检测不同血清型蓝舌病毒(BTV)。方法:应用改良的BTV双链RNA变性方法,针对BTV基因组片段1和5的相对保守序列设计2对特异性引物,建立了BTV荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行灵敏度、特异性、重复性评价。结果:该方法能检测11种不同血清型BTV,其灵敏度可达到10copies/μl;使用所设计引物的荧光定量PCR能特异地扩增BTV,其Ct值差异较小,并与阴性对照EHDV-5无交叉反应;重复检测CV值小于5%。结论:检测方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适用于BTV的快速检测和诊断。     

札如病毒实时荧光RT-PCR的建立与应用

目的 建立一种可快速、全面、准确检测人感染札如病毒的TaqMan探针荧光实时RT-PCR方法。方法 利用Bioedit2.0、MAGE6.0软件对可感染人的GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ基因群札如病毒进行保守序列比对,应用Primer6.0、Primer Express 3.0进行引物和TaqMan探针的设计与评价,分别设计了两套引物及TaqMan探针,克隆相应靶基因并构建阳性标准品,建立及优化一步法实时荧光RT-PCR反应体系,并进行灵敏度、特异度、临床标本验证试验。结果 根据基因序列比对分析,札如病毒ORF1与ORF2连接区具有相对高保守序列,针对GⅠ、GⅡ、GⅣ及GⅤ设计了一条共用的下游引物、以及两套上游引物和TaqMan探针,能覆盖当前GenBank可见的感染人的札如病毒基因型,在同一反应管中建立了同时检测札如病毒四个基因群的实时荧光RT-PCR,并可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ进行初步分型,对人柯萨奇病毒、诺如病毒、轮状病毒、腺病毒等非靶标病原体无扩增,仅对札如病毒有特异扩增,最低检测下限为10拷贝/反应。结论 本研究建立了札如病毒一步法实时荧光RT-PCR反应体系,可将GⅤ与GⅠ、GⅡ、GⅣ区分开来,为腹泻疫情防控和风险评估提供快速、准确的病原学依据。     

SAT法检测人巨细胞病毒pp67 mRNA在人类免疫缺陷病毒合并人巨细胞病毒感染患者临床诊疗中的价值探讨

目的 探讨实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing,SAT)检测人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)基质表层蛋白pp67(phosphoprotein67, pp67) mRNA在人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)合并HCMV感染患者临床诊疗中的价值。方法 利用SAT技术构建检测HCMV pp67 mRNA的方法,评估SAT法检测HCMV pp67 mRNA重复性、特异性以及检测下限;收集HIV阳性HCMV活动性感染患者69例、HIV阳性HCMV非活动性/潜伏感染154例、HIV阴性HCMV非活动性/潜伏感染 79例患者的血清、肺泡灌洗液、脑脊液等样本进行HCMV pp67 mRNA检测,评估特异度、灵敏度、正确率、阴性预测值、阳性预测值以及约登指数,评估HCMV pp67 mRNA在辨别HCMV活动性感染中的临床价值。结果 SAT法检测HCMV pp67 mRNA的精密度(变异系数<10%)可满足临床检测要求,与其他病原体无交叉反应,特异性良好,试剂检测下限为400 copies/mL;特异度87.55%,灵敏度60.87%,正确率81.46%,阴性预测值0.88,阳性预测值0.59以及约登指数0.48;SAT法检测HCMV pp67 mRNA结果阳性率与临床诊断结果差异无统计学意义(P=0.894)。结论 SAT法检测HCMV pp67 mRNA可用于HCMV活动性感染的辅助诊断。     

诺如病毒遗传组I型TaqMan—MGB探针实时荧光RT-PCR的研究

目的建立诺如病毒遗传组I型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR快速、特异、灵敏的检测方法,为疾病预防控制提供可靠的依据。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅰ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立一步法实时荧光RT-PCR快速检测反应体系,优化反应条件,评价反应体系的灵敏度、特异性、重复性,并与常规RT-PCR比较。结果诺如病毒遗传组Ⅰ型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR检测时限短,仅1h就出结果,与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒、诺如病毒遗传组Ⅱ型无交叉反应,最低检出下限为100拷贝/反应,比常规RT-PCR灵敏100倍,5份浓度不同的诺如病毒遗传组Ⅰ型标本重复检测5次,平均Ct值变异系数范围为0.39%～1.02%。结论诺如病毒遗传组Ⅰ型TaqMan-MGB探针实时荧光RT-PCR快速、特异、灵敏、重复性好,可应用于突发公共卫生应急检测和诺如病毒遗传组Ⅰ型监测,提高快速检测能力。     

肠道病毒71型实时荧光RT-PCR检测方法的建立及临床评价

目的 利用实时荧光RT-PCR技术,并通过系统的分析性能和临床性能评价,建立一种早期快速检测肠道病毒71型(EV71)的方法.方法 根据EV71基因组中编码衣壳蛋白VP1基因保守区序列设计一对引物和一条荧光探针,利用实时荧光RT-PCR技术建立了检测EV71的方法,并对扩增产物进行分析,同时进行灵敏度、特异性、精密度评价.在此基础上利用不同标本类型共1104例临床样本对本方法和RT-PCR方法进行对比分析.结果 本方法可以特异性的检测EV71,而对种属相近的或引起症状相似的其他病毒均无交叉反应.本方法检测灵敏度达到9.22×102 PFU/ml,不同浓度样本的Ct值的变异系数在1.4%～2.9%之间.1104例临床样本的研究显示本方法与RT-PCR方法检测结果的总符合率达到96.74%,阳性样本的检出率要高于RT-PCR方法.结论 本方法检测EV71具有灵敏度高、特异性强、精密度高、快速简便的特点,并与RT-PCR方法具有很好的符合率,在手足口病的早期快速诊断和疫情监测方面具有很好的应用前景.     

TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法检测SIV/SHIV病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒的RNA拷贝数。方法利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对本室SIV/SHIV病毒RNA定量外标准品RS的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果该方法检测灵敏度可达4.60×101copies/μL,特异性及重复性良好,对同一样品进行16次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为0.066。结论TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒RNA载量。     

实时荧光定量RT-PCR方法在登革热小鼠模型中的评估及应用

目的评估登革病毒实时荧光定量RT-PCR方法,应用于登革热小鼠模型关键指标的检测。方法首先,选择合适的特异引物和探针,分子生物方法制备质粒标准品,优化PCR体系和反应条件;其次,评估该实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏性、特异性及稳定性;最后,验证该方法对登革病毒感染小鼠血清和组织样本的适用性。结果成功确定一步法实时荧光定量RT-PCR方法;该方法较为灵敏,最低检测线为49. 6 Copies/μL;方法特异性好,未见非特异性扩增;方法稳定性好,样本Ct值标准差均小于0. 5,且CV﹤5%;登革病毒感染小鼠模型样品的检测结果符合实验预期。结论该qRT-PCR方法可作为关键指标检测方法,用于登革热小鼠模型病毒的定量检测及评估。     

登革热病毒RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定登革热病毒(DV)及DV病毒的RNA拷贝数.方法 利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对登革热病毒RNA定量外标准品的定量分析,优化反应体系.检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性.结果 该方法检测灵敏度可达1×103 copies/mL,特异性及重复性良好,对同一样品进行5次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为O.792.结论 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定登革热病毒及DV RNA载量.     

BD MAX全自动工作站在肠道病毒检测中的优势

目的 比较常规检测方法与BD MAX全自动工作站在手足口病病原学检测中的差异,探讨应用BD MAX全自动工作站检测肠道病毒的可行性。 方法 收集2017年1月—2020年9月昆明市临床诊断为手足口病病例的标本,随机选择136份,以实验室常规采用的实时荧光PCR检测方法和BD MAX全自动工作站方法,对结果进行Cohen′s kappa一致性分析;用无酶水对检测试剂盒提供的U/CA16/EV71假病毒阳性对照做10倍梯度稀释,记录各稀释度检测结果;随机取两份阳性标本,分别用两种方法平行重复检测10次,计算 Ct值的平均值和变异系数,进行重复性分析。 结果 两种方法对肠道病毒U/CA16/EV71的检测结果一致性好,Cohen′s kappa值为0.889,95%置信区间（95%CI）为0.803~0.976;两种方法检测CA16的敏感性一致,常规方法检测EV71和U的敏感性略高于BD MAX方法;在CA16标本的检测中,常规检测方法变异系数CV（通用型）=1.07%、 CV CA16=0.62%,BD MAX方法CV（通用型）=1.63%、CV CA16=2.19%;在EV71标本的检测中,常规检测方法变异系数CV（通用型）=1.28%、 CV EV71=1.20%,BD MAX方法CV（通用型）=2.37%、CV EV71=1.73%。 结论 BD MAX全自动工作站检测结果较为准确,敏感性、重复性好,人工操作少,便于标准化推广,且耗时短,在小批量标本的病原检测及暴发疫情或应急检测中具备较好优势。     

实时逆转录聚合酶链反应定量检测人 TNF-αmRNA的表达

目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达 TNF-α mRNA 的方法。方法根据 Gene Bank 中 TNF-α mRNA 序列和 MGB 探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物和探针,优化实验条件,建立定量检测人 TNF-α mRNA 的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后进行 TNF-α表达检测。结果本法灵敏度为10~3拷贝/毫升、线性检测范围达6个数量级(10~3～10~9拷贝/毫升);特异性好,PCR 产物电泳后无非特异性条带产生,非目的扩增产物用本法进行检测,均无荧光信号响应;以 Ct 值计算变异系数(CV 值),批内批间 CV值均小于5%;10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后 TNF-α mRNA 的平均含量分别为10~(4.15±0.49)和10~(5.19±0.43)拷贝/毫升。结论Taqman-MGB 实时荧光 RT-PCR 定量检测人 TNF-α mRNA 表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值。     

实时荧光PCR定量检测粪便中Akkermansia muciniphila方法研究

目的 建立实时荧光PCR定量检测粪便中Akkermansia muciniphila （A. muciniphila）的方法,为A. muciniphila的定量检测及深入研究提供技术支持。 方法 建立SYBR Green Ⅰ 荧光PCR 定量检测A. muciniphila的方法,利用A. muciniphila标准品制备标准曲线,评价该方法的灵敏度、特异性、抗干扰性及重复性,并对30例人粪便样本进行检测。 结果 标准曲线线性关系良好（R2=0.999）;方法灵敏度可达到1.0×102CFU/mL;该方法可特异性扩增A. muciniphila,不受其他肠道细菌的影响;组内和组间重复性较好,Ct值的变异系数均小于2%;30例人粪便样品中A. muciniphila阳性率为73%,Ct值为17.40～31.77。 结论 本研究建立的实时荧光PCR定量检测粪便中A. muciniphila的方法简便、快速、经济,且具有良好的灵敏度、特异性、抗干扰性和重复性,适用于实际粪便样品的检测。     

新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒的制备及应用

目的 开发一种新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒,分析新型冠状病毒中和抗体在新冠疫苗效果监测中的临床应用价值。 方法 表达纯化SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD结构域和人ACE2蛋白,将RBD蛋白偶联HRP、ACE2蛋白偶联生物素(Bio),制备新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒;收集15例注射新冠疫苗志愿者血清,检测新冠疫苗注射前后机体中和抗体水平。 结果 注射新冠疫苗前SARS-CoV-2中和抗体阳性率为0.00%,第1、2、3针新冠疫苗注射后11~15 d,阳性率分别为13.33%、93.33%、100.00%,第2针注射后第180~190 d,阳性率降低到33.33%;性能检测分析显示,最低检出限为0.06 μg/mL,批内CV<5%,批间CV<10%,线性检测范围为0.030~3.125 μg/mL,分析灵敏度验证值为0.040 μg/mL,与微量细胞中和试验进行对比,确认与其具有高度一致性。 结论 新型冠状病毒中和抗体酶联免疫检测试剂盒性能评价良好,检测方法具有快速、方便、易操作等特点,可以用于评估新冠疫苗的保护效果。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测流感病毒H1、H3亚型的研究

目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测流感病毒H1、H3亚型的方法.方法 根据H1、H3亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立优化反应体系后,将荧光定量RT-PCR的产物采用10倍稀释法,即107～100 copies/μl,再次用荧光定量PCR方法检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性.结果 H1和H3亚型流感病毒的检测灵敏度为102 copies/μl,扩增效率分别为101.35％和113.28％,标准曲线相关系数大于99％,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H1、H3亚型流感病毒.     

基于锥板磁珠法的全自动凝血分析仪应用评价

目的评价Destiny Max全自动凝血分析仪的性能。方法结合全自动凝血分析仪国家行业标准检测Destiny Max全自动凝血分析仪的精密度、线性范围、携带污染率、可比性、抗干扰能力以及Fbg检出限值。结果批内精密度PT、INR、aPTT、Fbg、TT、D二聚体正常质控CV值分别为：1.61、1.98、1.91、1.48、1.15、12.76;异常质控CV值分别为：0.90、1.20、0.44、3.70、0.31、5.41;批间精密度正常质控CV值分别为：1.54、1.98、1.77、0.89、1.15、15.90;批间精密度异常质控CV值分别为：0.52、0.80、0.40、2.75、0.53、5.25。Fbg试剂携带污染率为1.08%;PT、INR、aPTT、Fbg、TT测定结果在与法国STA-R凝血分析仪器上密切相关,r值分别为：0.995、0.995、0.947、0.962、0.984,D二聚体与法国STA-R的D二聚体相比阳性符合率96.9%;在抗干扰能力上不受黄疸、乳糜、溶血、混浊等光学干扰物对检测的干扰;线性范围较宽。结论 Destiny Max全自动凝血分析仪各项性能精确,机器结构严谨,设计合理,测试速度较快,操作简便。可以对临床血液分析做出快速准确的报告。     

海南省2019年9例登革病毒的鉴定及E基因序列分析

目的 对2019年海南省暴发的16例疑似登革热（dengue fever, DF）患者血清标本进行调查研究,从分子水平对登革病毒（Dengue virus, DENV）的E基因进行分析,对此次登革病毒进行鉴定,并对登革热的防控给出可行性意见。方法 对患者血清进行核酸检测、分型,将登革病毒阳性标本进行分离及核酸检测,利用实时荧光定量PCR技术对病毒进行分型,通过RT-PCR扩增E基因片段RT-PCR产物经过琼脂凝胶电泳成像系统观察条带结果,根据条带的有无判断阴性或阳性,根据条带的大小判断登革病毒的型别,得到9条DENV-1型E基因序列,基因测序之后与2019年中国其他省、国外选取的共11条DENV-1型E基因序列进行比较中,通过MEGA7.0.26软件从分子水平进行同源性比较以及系统进化树构建。结果 通过血清学鉴定结果以及实时荧光定量PCR技术检测得出的Ct值,可知研究的16份患者血清中,有9份经过鉴定为DENV-1型,7例为阴性结果。系统进化树表明,2019年海南9例DENV-1病例与参考序列MK517727 Guangzhou 2019、MK517719 Guangzhou 2019、MK517720 Guangzhou 2019同源性最高为99.73%~99.80%,与3株作为参考序列的外源株,序列相似度都相对较低,结果可靠。结论 得到的E基因长度为1 485 bp,2019年海南省9株DENV-1型为输入型流行株,根据进化树亲缘性分析,此次海南DENV-1病例与广州省的登革病例同源性最高。     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

实时荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体方法的建立

目的建立检测贝氏柯克斯体的Real-Time PCR方法。方法根据贝氏柯克斯体特有的htpAB基因相关重复序列（IS1111a）进行PCR扩增片断485bp,以克隆的IS1111a基因片断作标准DNA模板,建立Real-Time PCR检测方法。结果建立的Real-Time PCR标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0.999）;重复性测试Ct变异系数CV≤6.1%;其灵敏性约为普通PCR的10倍;以其它相关立克次体和病原菌DNA为模板应用于该方法,结果均为阴性。结论所建立的Real-Time PCR方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性,可代替普通PCR用于贝氏柯克斯体的感染早期的快速定性、定量检测。     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)核酸的荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)和表面抗原(WHsAg)的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5’端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。