人NT-3重组逆转录病毒载体及稳定包装细胞系的构建及鉴定

构建并鉴定携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系。方法 :用DNA重组技术将人NT - 3定向克隆入逆转录病毒载体 pLXSN ,并用限制性内切酶进行酶切鉴定 ;磷酸钙转染方法将重组的逆转录病毒转染入包装细胞系PA317,G4 18筛选建立稳定产病毒的细胞株。结果 :构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ切开 ,电泳分离显示两条阳性条带 ,分别出现于 0 .8kb和 5 .9kb处 ;重组载体转染包装细胞 ,经G4 18筛选 ,可形成抗性克隆 ,并测得病毒滴度为 4× 10 5cfu/ml,提示构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论 :构建携带人NT - 3基因的逆转录病毒载体可行 ,并且可望成为一种很好的对神经系统疾病进行基因治疗的方法。     

特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1 pSUPER retro RNAi系统的构建

目的 构建并筛选携带针对Epstein-Barr病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将60 bp能转录产生靶向LMP1小发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317,G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组逆转录病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7 167 bp和281 bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆.结论 特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建和筛选成功.     

葡萄糖转运蛋白-2逆转录病毒表达载体构建/包装及其鉴定

目的 构建葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为新型"人工胰岛β细胞"的构建奠定基础.方法 质粒pCB7/GLUT2经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序鉴定;转pL-GLUT2-SN至包装细胞系PA317,G418抗性筛选,检测上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞克隆行PCR及RT-PCR鉴定.结果 建立GLUT-2基因逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序证实目的基因插入位点及读码框架正确;所建稳定产毒细胞克隆PA317/GLUT2,其最高病毒滴度达7.1×105 CFU/ml,PCR及RT-PCR证实GLUT-2基因整合入其中并稳定表达.结论 成功构建GLUT-2基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为"人工胰岛β细胞"的构建奠定了基础.     

逆转录病毒载体介导HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

【目的】 探讨自杀基因抗肿瘤系统构建的方法。【方法】 用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN,并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定;用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67,通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人胃癌细胞,检测HSV1-tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。【结果】 经酶切鉴定和DNA序列测定,证明HSV1-tk基因成功定向插入到pLXSN载体中;重组病毒DNA转染包装细胞,筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67/tk,扩大培养,获取病毒滴度为4×10~4 cfu/mL的重组逆转录病毒培养液;感染胃癌细胞SGC-7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC-7901/tk。丙氧鸟苷(GCV)对SGC-7901/tk有明显杀伤作用,对SGC-7901无明显毒性,证明该病毒表达HSV1-tk基因,表达产物具有生物活性。【结论】 将HSV1-tk定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取表达HSV1-tk(基因的逆转录病毒,成功建立了肿瘤自杀基因治疗系统,这将为进一步研究中医药对自杀基因抗肿瘤的增效作用奠定基础。     

人NF-κB亚基p65、p5 0基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定

目的 构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、pS0基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株.方法 以ReCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、测序鉴定.将重组载体及空载体分别转染包装细胞系PT67,以G418或潮霉素筛选产毒细胞株.收集病毒悬液,测定病毒滴度,并瞬时感染NIH3T3细胞及人神经干细胞,72 h后分别采用RT-PCR和免疫细胞化学观察p65、p50的表达.结果 重组逆转录病毒载体pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、测序鉴定正确.将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,测定病毒滴度分别为4×105、6 × 105、2×105及1 × 105efu/ml.pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒悬液瞬时感染NIH3T3细胞72 h后,细胞p65、p50亚基mRNA的表达明显升高;瞬时感染人神经干细胞(hNSC)72 h后,部分细胞胞核呈p65和p50阳性染色.结论 成功构建了分别携带人p65、p50基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株.为探讨转NF-κB基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础.     

人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础.     

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的 利用siRNA表达载体法构建并筛选携带针对CD59基因pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆.方法 用DNA重组技术,将3条60 bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法转染包装细胞系Phoenix A,建立产生逆转录病毒的细胞克隆.结果 重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,表明包装成功.结论 特异性沉默CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础,可望为肿瘤治疗开辟新途径.     

大鼠前脑啡肽原基因逆转录病毒表达载体及产毒细胞系的建立

目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系.方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、Cla Ⅰ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK.然后用脂质体法将该载体转染PT67细胞,G418筛选,并进行滴度测定.结果与结论:成功地构建了pLNCX2-pENK载体,获得8×108CFU/L的产毒细胞系.成功建立了携带pENK的高滴度逆转录病毒产毒细胞系.     

逆转录病毒介导的SHP-1基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的 构建逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1.获取重组逆转录病毒.并将SHP-1基因转导入乳腺癌MDA-MB-231细胞株.方法 采用RT-PCR方法从高表达SHP-1的人乳腺癌细胞株MCF-7中克隆出SHP-1基因全长cDNA,构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1,通过脂质体介导将其转染入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231.采用Western blotting方法检测SHP-1基因在MDA-MB-231细胞中的表达情况.结果 成功构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1,转染包装细胞PT67,筛选出对G418具有稳定抗性的克隆PT67/SHP-1,获取重组逆转录病毒上清液,并感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231.从蛋白水平证实,感染后的MDA-MB-231有SHP-1基因的表达.结论 将SHP-1基因定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取重组逆转录病毒,感染MDA-MB-231细胞得到稳定表达SHP-1基因MDA-MB-231/SHP-1,为进一步研究奠定了基础.     

抗精子抗体和抗子宫内膜抗体与不孕及流产的关系

目的　探讨抗精子抗体（ＡｓＡｂ）与抗子宫内膜抗体（ＥＭＡｂ）在不孕、流产中的作用及二者关系,进一步 揭示不孕、流产的病因。方法　采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测３４５例不孕、流产妇女血清中的ＡｓＡｂ与 ＥＭＡｂ,按ＡｓＡｂ检测结果分阳性组和阴性组,比较两组ＥＭＡｂ阳性率的差异。结果　原发不孕及自然流产妇女中, ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率高达１６．６７％和１９．５１％,而ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率高达４３．６４％和４２．８６％,显著高于 ＡｓＡｂ（－）组（Ｐ＜０．０１,Ｐ＜０．０５）。继发不孕妇女中ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率为１８．１８％,ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率 为３２．２％,二者无显著性差异（０．０１＞Ｐ＞０．０５）。结论原发不孕及自然流产妇女中因个体免疫反应差异使某些 人易对体内、外物质发生免疫反应而产生抗体,从而导致不孕或流产。     

水疗联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响

目的探讨新生儿游泳联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响。方法将经阴道顺产分娩的正常新生儿100例随机分为两组，观察组（水疗联合抚触组）50例，对照组（单纯沫浴组）50例。①测定两组10日、28日的体重、身长、上臂围；②观察记录胎便转黄时间，测定皿清胆红素；③记录24h睡眠时间。结果两组新生儿10日、28日体重、身长、上臂同增长有显著差异（P〈0．05），两组新生儿5日时，胎便转黄时间及黄疸指数比较均有显著性差异（P〈0．01），两组睡眠时间比较有统计学意义（P〈0．05），两组并发症比较无统计学意义（P〉0．05）。结论新生儿水疗联合抚触可促进新生儿的生长发育，能加速胎粪的早排出，减轻生理性黄疸程度，有效地降低新生儿高胆红素血症的发病率，提高睡眠质量。     

气血与足月妊娠分娩关系的探讨

论述足月妊娠分娩的发动和维持依靠气的推动、温煦、气化、固摄功能和血的营养、濡润功能。顺利分娩既要气血充足，还要气顺血和。临床研究结果表明调补气血，是促进产程，预防难产的重要手段。实验研究结果阐明调补气血中药加强产力、促进产程主要是从改善产妇全身情况，提高机体抗应激、抗疲劳、耐缺氧能力，即所谓使产妇气血充足调和，充分发挥气血在分娩过程中的生理作用。     

亚硝基脲类和亚硝基硫脲类的理化性质及致突变能力

本题选择N,N′-二甲基亚硝基脲(DMNU),N,N′-二乙基亚硝基脲(DENU),及其类似物N,N′-二甲基亚硝基硫脲(DMNTU)、N,N′-二乙基亚硝基硫脲(DENTU)为代表,测定了这些化合物的水解反应速度、脂溶性(HPLC的logk′值)、水解产物和致突变能力。证明了硫脲的脂溶性大于脲的脂溶性。DMNTU对TA100菌株的致突变能力最强,其它较弱。