PSNAV2-CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达

目的 构建含人结缔组织生长因子（CTGF）的腺相关病毒（AAV）表达载体,并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达。方法 以含有人CTGF基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板,应用PCR克隆出CTGF基因,采用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上构建重组质粒pSNAV2-CTGF。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。结果 成功构建完全正确的CTGF基因序列的AAV表达载体pSNAV2-CTGF,将其转染HEK293细胞后,免疫荧光检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性。结论 成功构建了真核表达载体pSNAV2-CTGF,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的CTGF蛋白。     

人基质金属蛋白酶组织抑制剂1腺相关病毒表达质粒的构建及检测

目的构建含人基质金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinases1，TIMPl）的腺相关病毒（adenoassociatedvirus，AAV）表达质粒并观察其在人胚肾293（HEK293）细胞中的表达，为进一步逆转椎间盘退变提供依据。方法以含有人TIMP1基因序列的质粒pBLAST49-hTIMP1为模板，通过PCR的方法扩增出TIMP1基因，再采用分子克隆的方法，把TIMP1克隆到AAV表达质粒pSNAV2．0构建重组质粒pSNAV2-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞，用免疫荧光和Westernblot的方法对重组质粒的表达进行研究，ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的TIMP1基因序列的AAV表达质粒pSNAVz-TIMP1。体外成功转染入HEK293细胞，免疫荧光、Westernblot及ELISA的结果表明重组质粒能够高表达TIMP1蛋白。结论成功构建了表达TIMP1的重组质粒pSNAV2-TIMP1，并证实在蛋白质水平获得了表达，为进一步逆转椎间盘退变研究奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子腺相关病毒包装质粒pSNAV-hVEGF165的构建及在HEK293细胞的表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）腺相关病毒（adenoassociated virus，AAV）表达载体包装质粒pSNAV-VEGF165，并体外检测pSNAV-VEGF165表达和生物学活性。方法采用分子克隆技术，从pcDNA3（＋）-VEGF165质粒获得VEGF165cDNA，并克隆至AAV包装质粒pSNAV上，构建pSNAV-VEGF165的AAV重组质粒，经酶切及测序鉴定正确，用脂质体介导pSNAV-VEGF165转染HEK293细胞和血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC），荧光免疫组化方法检测VEGF165蛋白，并用MTT法测定VEGF165对VEC增殖的影响。结果经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-VEGF165构建成功，荧光免疫组化显示VEGF165蛋白的表达，对照组未见VEGF165蛋白的表达，MTT法显示VEGF165蛋白对VEC增殖有促进作用。结论构建的AAV包装质粒pSNAV-VEGF165在体外具有生物学活性，可作为AAV-VEGF165表达载体的包装质粒。     

人趋化因子受体CCR6的克隆、表达及其功能分析

目的构建人趋化因子受体6（CCR6）cDNA序列的真核表达载体．并在HEK293细胞中表达．为研究CCR6生物学功能和筛选CCR6拮抗剂奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人扁桃体克隆CCR6受体的DNA片段．并将该片段插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6；将该质粒pcDNA3、1（＋）-CCR6转染HEK293细胞．用流式细胞术检测转染pcDNA3．1（＋）-CCR6质粒的HEK293细胞；采用体外趋化实验、钙流实验，验证转染pcDNA3.1（-）．CCR6质粒的HEK293细胞表面表达的CCR6的生物学活性。结果经RT-PCR获得了编码人CCR6受体的DNA片段．构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-CCR6：转染HEK293细胞．经流式细胞仪检测、趋化实验、钙流实验证实．表达CCR6的HEK293细胞具有趋化因子受体CCR6的生物学活性。结论重组人趋化因子受体CCR6克隆成功．并在HEK293细胞中获得了表达．为研究CCR6的生物学功能及筛选CCR6拮抗剂奠定了基础。     

人脂联素受体1和2的真核表达

目的 扩增和表达人脂联素受体1（AdipoR1）和人脂联素受体2（AdipoR2）基因。方法 利用RT-PCR方法扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA。将AdipoR1和AdipoR2的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1。重组质粒转染HEK293细胞。通过免疫荧光技术标记HEK293细胞的AdipoR1和AdipoR2融合蛋白，共聚焦显微镜观察AdipoR1和AdipoR2在细胞中的定位。结果 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-adipoR1和pcDNA3．1-adipoR2．重组质粒转染HEK293细胞后。定位于HEK293细胞膜上。结论 AdipoR1和AdipoR2重组质粒的构建和在HEK293细胞中的成功表达。为进一步研究其与胰岛素抵抗的关系创造了条件。     

重组共表达载体pSNAV2.0 HSV1tkIREShIL1Ra的构建及其在滑膜细胞中的表达

   目的引入内部核糖体进入位点（IRES）,构建HSV1 tk与hIL 1Ra双基因共表达AAV重组载体并检测其在滑膜细胞中的表达。方法PCR扩增HSV1 tk、IRES及hIL 1Ra基因片段,分别与pMD18 T simple载体连接,测序后,hIL 1Ra与HSV1 tk先后插入pMD IRES,构建重组质粒pMD HSV1 tk IRES hIL 1Ra,酶切出HSV1 tk IRES hIL 1Ra片段,克隆至AAV载体质粒pSNAV2.0上,构建成重组共表达质粒pSNAV2.0 HSV1 tk IRES hIL 1Ra,酶切鉴定后,用脂质体转染上述质粒至原代骨关节炎（OA）滑膜细胞,RT PCR法鉴定共表达质粒在滑膜细胞中的表达。结果酶切鉴定证实重组共表达质粒构建正确;RT PCR检测到转染后的OA滑膜细胞中表达HSV1 tk与hIL 1Ra。结论成功构建了重组共表达质粒pSNAV2.0 HSV1 tk IRES hIL 1Ra;重组质粒转染OA滑膜细胞后,能表达HSV1 tk与hIL 1Ra。这为OA的基因治疗研究提供了理论依据。     

人β3肾上腺素受体真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR的构建及表达

目的构建人β3肾上腺素受体(β3-AR)的真核表达质粒pcDNA3.1( )-β3-AR,并通过脂质体介导转染HEK293细胞使之表达该受体蛋白。方法以pENTR_ADRB3-Stop质粒为模板,采用PCR法扩增出人β3-AR cDNA,将其插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建成真核表达质粒pcDNA3.1( )-β3-AR。将该质粒转染HEK293真核细胞,通过RT-PCR检测β3-AR mRNA在HEK293细胞内的表达,通过免疫荧光法检测β3-AR蛋白在HEK293细胞中的表达。结果酶切和DNA测序鉴定均证实重组质粒含有人β3-AR编码区全长。在转染重组质粒pcDNA3.1( )-β3-AR的HEK293细胞中检测到了β3-AR基因的转录和翻译产物。结论通过基因工程方法成功构建了β3-AR的真核表达质粒pcDNA3.1( )-β-AR,为进一步建立β-AR的稳定表达细胞株,用于筛选高效、高选择性β-AR激动剂奠定了基础。     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究

目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础.方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用SalⅠ和BglⅡ双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中.用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定.分别将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺相关病毒(rAAV2GFP)及rAAV2ANG-1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究.结果:测序证实ANG-1与GenBank提供的原始序列完全一致.重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致,在新的重组质粒中,ANG-1有一套CMV启动子和PolyA终止子系统.293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×1011v.g/ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG-1.1×106v.g/ml rAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55%左右的细胞有明显的荧光.结论:ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础.     

NOD小鼠CD8α+抗原基因克隆载体的构建及其相关蛋白在树突状细胞中的表达

目的：构建NOD小鼠CD8α⁺抗原基因重组慢病毒载体,探讨其在树突状细胞（DCs）中的表达,阐明1型糖尿病（T1DM）的发病机理。方法：设计CD8α+基因特异性引物,从NOD小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增CD8α⁺基因,与质粒载体pCDF1-MCS2-EF1-COPGFP进行连接重组,经过转化、筛选、鉴定和序列测定后,应用Western blotting法检测CD8α⁺基因的表达。应用Nanofectin脂质体转染试剂将含有目的基因的质粒转染HEK293细胞,进行重组慢病毒载体包装,将包装后的重组慢病毒颗粒感染DCs,采用Western blotting法检测CD8α⁺蛋白的表达。结果：成功构建了NOD小鼠CD8α⁺抗原基因的重组质粒载体,重组表达载体经转染HEK293细胞获得了重组病毒的原液,重组病毒扩增后感染DCs,免疫荧光下可见DCs内含有绿色荧光蛋白(GFP)表达。结论：NOD小鼠CD8α⁺抗原基因重组病毒载体构建成功,且有相关蛋白表达。
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转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响.方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到AD...     

促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体, 观察MyD88siRNA对树突状细胞中MyD88蛋白表达的影响。方法 将合成的MyD88RNAi片段与质粒载体连接, 转化进化学感受态的大肠杆菌, 然后进行菌落PCR鉴定、阳性克隆测序及质粒的抽提;然后转染HEK293细胞, 将获得的重组腺病毒进行两轮扩增后进行纯化;用终点稀释法测定腺病毒滴度;Western blot检测MyD88siRNA对树突状细胞中MyD88蛋白表达的作用。结果 阳性克隆PCR鉴定与理论条带一致, 测序鉴定通过, 腺病毒载体转染树突状细胞, Western blot检测显示干扰组MyD88蛋白表达降低。结论 成功构建恒河猴MyD88基因沉默siRNA腺病毒载体, MyD88siRNA对恒河猴树突状细胞中的MyD88蛋白表达具有抑制作用。     

逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体的构建与鉴定

目的构建逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体,并在HEK293细胞株中观察其基因沉默效果。方法PCR方法扩增人U6启动子,下游引入核酸内切酶位点BamHI、SalI,反向插入质粒Pmscv/Hyg的3′端LTR上游。扩增EGFP基因,插入载体Pmscv/Hyg的多克隆位点。合成干扰P53基因表达的寡核苷酸序列,退火复性后插入U6启动子下游BamHI、SalI酶切位点间。重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转染病毒包装细胞PT67,产生具有一次感染能力的病毒颗粒。病毒上清感染靶细胞HEK293,经潮霉素筛选,RT-PCR和western blot检测靶基因P53表达情况。结果质粒酶切及DNA测序表明成功构建重组病毒载体,并在PT67细胞中包装成具有一次感染能力的逆转录病毒。经Hygromycin筛选,HEK293细胞中P53蛋白和mRNA表达显著下调。结论成功构建以Pmscv/Hyg为基础的RNA干扰表达载体,重组载体包装出的逆转录病毒可有效介导基因沉默。