云南小耳猪胰岛细胞的分离和纯化方法

目的探索云南小耳猪胰岛细胞分离和纯化的有效方法.方法采用胶原酶胰导管注射负荷技术,静止消化与物理消化相结合消化分离小耳猪胰腺;不连续密度梯度比重离心纯化,胰岛素释放试验检测胰岛细胞功能.结果胰岛收获量为（4580±257）IEQ/g胰腺,纯化后为（3660±449）IEQ/g胰腺,纯度为80%左右,胰岛素释放反应良好.结论采用本方法消化分离小耳猪胰岛,腱岛细胞产量、纯度较高,功能良好,为进一步成人胰岛细胞的分离纯化提供了实验依据.     

一种简单快速分离纯化小型猪胰岛的方法

目的 探索一种简单快速分离纯化小型猪胰岛的方法。 方法 摘取小型猪胰腺,经胰管插管后注入胶原酶V,用自制的半自动消化分离装置消化,胰腺消化物经自制的推进式离心管及单一密度（1.096g/ mL）的ficoll400纯化后行双硫腙（DTZ）染色,倒置显微镜下观察计数胰岛的数量及纯度,胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能。结果 纯化后平均每克小型猪的胰腺可以获得（2 645 ±234）个胰岛细胞当量（IEQ）,平均纯度为（74.2 ±5.1）%。纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时的胰岛素释放量为低糖时的3.14倍(P<0.01)。 结论 为小型猪胰岛细胞的研究建立了一种简单快速分离纯化胰岛的方法,纯化后的胰岛细胞功能良好。     

半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究

目的 探索用半自动胰腺消化系统建立大规模人胰岛细胞纯化的可靠方法.方法 使用自制的半自动人胰腺消化分离装置及胶原酶P进行人胰腺的消化分离,用COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoll纯化人胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能.结果 消化后平均每条胰腺可平均获得(38 6201±78 219)个胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均每条胰腺可获得231 420±28 054IEQ,平均每克胰腺组织可获得(3148±317)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(62.81±2.68)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的3.53倍(P≤0.001).结论 成功建立了半自动人胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的人胰岛细胞具有良好的生物活性.     

成人胰岛细胞的分离与纯化

目的 探讨体外分离与纯化成人胰岛细胞的方法与可行性,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞。方法获取的成人胰腺组织称重后,采用V型胶原酶消化法分离;再用Ficoll间断密度梯度离心纯化法纯化;在DTZ染色显微镜下,评价胰岛细胞的数量、纯度;并用体外培养、放射免疫测定胰岛素法鉴定胰岛细胞活性。结果成人胰腺经胶原酶消化分离后,胰岛平均收获量（3600±447）个／g胰腺;Ficoll间断密度梯度离心纯化后,胰岛平均收获量（2140±207）个／g胰腺,纯度〉70％;成人胰岛细胞培养2、4、6d后,测定其培养液中基础胰岛素浓度（mIU·L^-1·100^-1）分别为（3．302±1．63）、（3．504±1．10）、（2．921±1．13）。结论胶原酶消化法、Ficoll间断密度梯度离心纯化法分离纯化成人胰岛是有效的方法。     

成年猪胰岛的分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对成年猪胰岛的分离效果.方法采用胶原酶胰导管注射负荷技术,静止消化与物理消化相结合消化分离成年猪胰腺脾叶;不连续密度梯度比重离心纯化,胰岛素释放试验检测胰岛细胞功能.结果胰岛收获量为8339±2305胰岛数/g胰腺,纯化后胰岛数/g胰腺为4367±1876,纯度为85%,胰岛素释放反应良好.结论采用本方法消化分离成年猪胰岛,胰岛细胞产量、纯度较高,功能良好.     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的 探讨获得足够数量和较高纯度大鼠胰岛的分离和纯化方法.方法 采用V型胶原酶灌注消化法分离成年大鼠胰岛,Ficoll 400非连续密度梯度法纯化胰岛.双硫腙(DTZ)染色鉴定培养的胰岛细胞,锥虫蓝染色检测细胞活性.葡萄糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛细胞的功能.结果 分离纯化后大鼠胰岛平均收获量为(480±30)IEQ,纯度大于90%,活性大于90%.在低糖和高糖刺激下,胰岛素分泌量分别为(12.28±0.89)mIU/L、(19.01±1.49)mlU/L,二者相比较.差异有统计学意义(P<0.05),刺激指数为(1.55±0.01).结论 胶原酶V逆行灌注消化胰腺和Ficoll400非连续密度梯度纯化法,可获得高纯度高活率的大鼠胰岛.     

推进式离心管结合单密度梯度法快速纯化大鼠胰岛

目的 探索用简化的单一密度梯度法建立快速纯化大鼠胰岛细胞的方法.方法 用胶原酶P消化分离SD大鼠胰腺,采用自制的推进式离心管以及单一密度(1.090 g/cm3)的HCA-Ficoll-400密度梯度液来纯化大鼠胰岛细胞.通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的功能.结果 纯化后平均每条SD大鼠胰腺可获得(731±89)个胰岛细胞当量(IEQ),平均纯度为(73.2±9.4)%.平均活率为(92.8±2.4)%.纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖时胰岛素的释放量为低糖时的3.54±O.79倍(P＜o.001).结论 为各种胰岛细胞的实验研究建立了快速分离纯化胰岛细胞的方法,纯化的胰岛细胞功能良好.     

家兔胰岛的分离纯化研究

目的探讨家兔胰岛分离、纯化的方法及其计数和活性的测定。方法选用日本大耳自家兔。予V型胶原酶于38℃内水浴外消化。采用Ficoll 400不连续密度梯度离心法对胰岛进行纯化,并对获得的胰岛进行DTZ染色计数。同时计算胰岛当量（IEQ）数。予台盼蓝染色法分析胰岛活性。结果DTZ染色纯化前每只家兔胰腺收获胰岛细胞数为15046±2733。IEQ数为：4635±554;化后胰岛数量为：5300±609,IEQ数为：1213±218;胰岛细胞活率〉90％,胰岛纯度为〉60％。结论家兔胰腺消化分离后得到胰岛的数量和IEQ均较多,且动物来源广泛、实验成本较低,预示其在胰岛移植中可作为胰岛来源。     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的优化胰岛细胞分离纯化的方法,提高胰岛产量、纯度和功能。方法本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化分离成年大鼠胰岛,葡聚糖离心纯化,获得胰岛细胞,进行记数和功能鉴定。结果纯化后胰岛收获量为7021±861IEQ/胰腺(IEQ=胰岛当量,一个胰岛当量为一个150μm直径的胰岛),纯度达86%;胰岛形态结构完整,胰岛素释放试验显示胰岛细胞功能良好。结论细节优化可以显著提高胶原酶消化、葡聚糖不连续梯度离心分离胰岛的效率。     

成人胰岛细胞的分离纯化与应用

目的 探讨成人胰岛细胞分离纯化技术,为胰岛细胞移植治疗1型糖尿病提供大量高质量的胰岛细胞.方法 使用LiberaseHI复合胶原酶和改良的Recordi自动胰岛细胞分离技术分离胰岛,采用COBE2991细胞淘洗仪连续密度梯度离心纯化胰岛细胞,用DTZ和AO-PI染色显微镜下评价胰岛细胞的数量、纯度和活性.结果 该组研究共分离30例胰腺的胰岛,获得胰岛细胞数量平均为(316626±191972)IEQ,平均每克胰腺收获胰岛细胞3389 IEQ,收获的胰岛纯度平均为(74.70±7.84)%,活度平均为(94.10±2.19)%,胰岛细胞刺激指数平均为(3.68±0.58).在此基础上,成功实施7人12次的成人胰岛细胞移植.结论 成功建立了改良的Recordi自动胰岛分离技术,获得大量高纯度有活性的胰岛细胞,为开展胰岛细胞临床移植提供了保障.     

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.     

糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立

目的：建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型及探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用.方法：（1）体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶联合淋巴细胞分离液的方法来分离纯化胰岛,人工挑取胰岛细胞并收集胰腺外分泌细胞.链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB/C小鼠成为糖尿病小鼠.单纯移植组（n=10）每只小鼠于左肾被膜上极移植胰岛细胞250个,共同移植组（n =10）每只小鼠于左肾被膜上下极同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞,持续观测血糖及生命体征变化,1个月后切除左肾并继续检测血糖.（2）体外实验：利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,利用台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的活性,以及用葡萄糖刺激胰岛素释放实验来检测胰岛功能.结果：（1）胰岛移植后,单纯移植组及共同移植组血糖均逐步降至正常,共同移植组较单纯移植组血糖恢复正常时间延迟,移植术后第2,3,4,5天,单纯移植组受鼠血糖低于共同移植组,差异有统计学意义（P＜0.05）.切除两组受鼠左肾3d后,两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.（2）每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=2.90）.结论：（1）成功建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型.（2）胰腺外分泌细胞与胰岛细胞同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间.     

三种消化酶分离胰岛对移植胰岛存活的影响

目的 比较三种消化酶分离胰岛的效率和质量及对移植胰岛存活的影响,为临床胰岛移植消化酶的选取提供参考.方法 相同条件下采用Liberase TL(A1组)、Collagenase P(B1组)和Collagenase V(C1组)(n=35)消化酶消化小鼠胰腺,Ficoll-400密度梯度纯化获得胰岛;DTZ染色观察胰岛细胞形态,并计算IEQ(直径＞150 μm的胰岛细胞团定义为1个IEQ)和纯度;锥虫蓝染色检测胰岛细胞成活率.C57BL/6糖尿病(DM)小鼠作为受体分为A2、B2和C2三组(n=7),采用同基因胰岛肾被膜下移植,监测术后血糖浓度变化;于移植成功后15 d切取移植物,HE染色观察组织学变化.结果 3种消化酶分离C57BL/6小鼠胰腺可获得的IEQ、胰岛纯度和胰岛细胞成活率均为A1组＞B1组＞C1组,三组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).每只受体小鼠移植(900±30)个IEQ胰岛;移植前各组小鼠血糖浓度比较差异均无统计学意义(P＞0.05);植术后第2天血糖浓度达最低值,第3天有一个短暂的回升,随后达到一个相对较平稳的状态,至第13天血糖浓度依次为A2组＜B2组＜C2组,组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).HE染色显示A2组胰岛形态完整,胞质、胞核区分明显,存活状态良好,炎症浸润不明显;B2组呈圆形或椭圆形,胞质淡染,多核,炎症细胞浸润较A2组多;C2组炎症细胞浸润明显,伴胰岛破坏,形态欠规则.结论 与Collagenase P和Collagenase V比较,Liberase TL消化小鼠胰腺可提高胰岛细胞团的收获量、活性和功能.     

简便快速的胰腺组织块H．E染色法

目的：探讨更好的显示胰腺组织块H.E加快染色速度的有效方法。方法：快速的胰腺组织块H.E染色法显示胰岛细胞并与常规苏木精-伊红染色法以及Mallory三色染色法比较。结果：胰腺细胞显示效果良好,微波辐射明显促进了组织块染色。结论：组织块使用微波辐射促进胰腺组织H.E染色,是显示胰腺的良好方法,且简便可行。     

人及猪,豚鼠,兔胰岛细胞对人工ICA反应的研究

本实验用猪、豚鼠、家兔胰腺抗原与Ｏ型血人胰腺作为抗原相对照，以ＡＢＣ法检测１７例ＩＤＤＭ，２０例ＮＩＤＤ，２０例非糖尿病患病血清胰岛细胞抗体（ＩＣＡ）。结果显示４种胰腺作为抗原均对人ＩＣＡ有抗原抗体结合反应，组间反应阳性一率差异无显著性，表明猪、豚鼠、家兔的胰腺比喻和为抗原可以替代人胰腺，用于以ＡＢＣ法检测ＩＣＡ，由此无种族特异性。     

链脲佐菌素诱导糖尿病恒河猴胰岛细胞数量的变化

目的观察链脲佐菌素(STZ)诱导恒河猴糖尿病动物模型胰岛细胞数量变化和激素表达情况。方法健康恒河猴5只,小剂量(30 mg/kg)多次静脉注射STZ,濒死状态时将动物安乐死。取胰腺制成石蜡切片,用免疫组化染色法显示胰岛A、B、D和PP细胞,并对结果进行图像分析和统计学处理。结果与对照组比较,模型组B细胞数量减少,胰岛素表达降低(P0.01)。A细胞增生,胰高血糖素表达增加(P0.01)。PP细胞增生,胰多肽表达增加(P0.05)。D细胞数量与对照组比较无显著性差异。结论恒河猴糖尿病动物模型胰岛各种细胞的数量和激素表达情况与人类糖尿病类似。     

人胰腺癌组织胚胰腺泡蛋白表达的免疫组织化学研究

用ＡＢＣ免疫组织化学法，以单克隆抗体Ｊ２８检测胰腺癌等组织的胚胰腺泡蛋白（ＦＡＰ）。结果：正常胰腺（５例）基本无ＦＡＰ表达；慢性胰腺炎阳性率为６０．００％（６／１０），强度为＋－＋＋，胚胎胰腺６例中全部为阳性强度＋＋－ⅢⅠ；胰腺癌阳性率为７３．６８％（１４／１９），强度为＋－ⅢⅠ；而肝胰壶腹癌（１例）、胰岛细胞瘤（１例）及胰腺转移性腺癌（５例）无ＦＡＰ表达。胰腺癌ＦＡＰ表达强度较慢性胰腺炎强。本研     

成人胰腺干细胞分离、培养及鉴定

目的：从成人胰腺组织中分离并鉴定胰腺干细胞。方法：利用含bFGF的有血清培养基分离、培养出具有高度增殖能力的细胞群，采用RT－PCR技术检测其Nestin mRNA及Insulin mRNA表达情况。同时诱导定向分化，观察其分化后的状态。结果：从成人胰腺组织中分离出的条索状细胞具有高度增殖能力，其Nestin mRNA表达阳性，而胰岛素Insulin mRNA表达阴性，分化后的细胞形成胰岛细胞团样结构。结论：本研究得到的细胞具有高度增殖能力和分化成胰岛细胞的潜能，是来源于胰腺的胰腺干细胞。