胎儿皮肤培养法的改进——118例胎儿皮肤细胞培养结果分析

<正> 自1898年Ljungren创始皮肤器官的培养及1931年Chlopin进行胎儿皮肤器官培养以来,Lewis于1949年方开始成人皮肤细胞培养。Tjio于1958年首次从皮肤成纤维细胞观察染色体。胎儿皮肤成纤维细胞培养和染色体的制备国内外虽已报道,但均不多,缺乏系统的观察资料。我们于1981年2～5月取胎儿皮肤118份标本进行细胞培养和染色体分析,作了系统的观察,发现孕早期染色体畸变率为1％,它为将来产前诊断,开展胎儿皮肤活检提供了可靠的诊断手段。本实验在培养方法上还作了一些改进,从而缩短了培养时间,并保证了染色体的收获。     

Joseph病黄氏家系患者的细胞遗传学研究

本文对Joseph病黄氏家系的系谱分析表明,该家系属常染色体显性遗传。对典型Joseph病患者及可疑者共6人作了外周血淋巴细胞染色体核型分析。其中病情严重者2人作了皮肤成纤维细胞离体培养及染色体核型分析。患者两种不同细胞的染色体均未见到异常,表明该病可能为基因型遗传病。     

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

皮肤成纤维细胞中Dystrophin基因的表达研究

目的研究皮肤成纤维细胞中Dystrophin mRNA和Dystrophin蛋白的表达。方法组织块法体外培养正常鼠皮肤成纤维细胞,通过RT—PCR和Western blotting技术分别检测皮肤成纤维细胞中Dystrophin mRNA及Dystrophin蛋白的表达。结果Dystrophin mRNA和Dystrophin蛋白在培养的皮肤成纤维细胞中均无表达。结论皮肤成纤维细胞可作为细胞间遗传物质转移的供体细胞。     

衰老皮肤表皮细胞和成纤维细胞生长动力学研究

为了研究衰老表皮细胞和成纤维细胞生长动力学方面的变化，应用细胞培养和流式细胞仪染色体分析技术研究衰老皮肤与小儿皮脸表皮细胞及真皮成纤维细胞的生长曲线，分裂指数，生长周期各期细胞比例等特点，动态观察衰老细胞生长动力学方面的变化，结果发现衰老皮肤的表皮细胞和真皮成纤维细胞Ｇ０－Ｇ１其细胞比例较低，合成期细胞仅占５－６％，而小儿表皮细胞和成纤维细胞Ｇ０－Ｇ１期细胞占６％，合成期细胞占１３～１４％，这说明     

瘢痕成纤细胞整合素表达实验研究

目的：了解在体外培养的瘢痛及正常皮肤来源的成纤维细胞整合素表达情况。方法：应用β１及α１￣α４整合素单克隆抗体对成纤维细胞进行整合素原侠ＥＬＩＳＡ检测，观察不同培养时期瘢痛成纤维细胞的β１及α１￣α４整合素表达水平，辅以正常皮肤成纤维对细胞做对照。结果：培养的瘢痛成纤维细胞整合素各亚型表达均明显高于同期培养的正常皮肤成纤维细胞表达水平（Ｐ〈０．０１）；细胞经较长时间培养后，整合素的表达均有所下降，     

人皮肤成纤维细胞原代培养及增殖能力研究

目的探索和建立永生化的人皮肤成纤维细胞,为皮肤成纤维细胞在临床医学上的应用提供可靠的科学依据。方法胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定成纤维细胞生长周期及细胞增殖指数。结果不同代次原代及冻存复苏后的人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强。结论人皮肤成纤维细胞在增殖能力上完全可以作为体细胞基因治疗的靶细胞,而且是未来最有希望的永生化基因治疗细胞之一。     

病理性瘢痕和正常皮肤来源成纤维细胞CD90、α-SMA表达的研究

目的检测体外培养的病理性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中CD90、α-SMA表达情况,并分析二者的相关性。方法取手术切除的瘢痕疙瘩4例、增生性瘢痕12例、正常皮肤（瘢痕边缘）16例,每组标本中选取特异性较强的组织块各3例,原代培养不同组织来源的成纤维细胞,取第3代细胞制成细胞爬片,免疫荧光双重标记（CD90和α-SMA）细胞,通过计算每系成纤维细胞CD90、α-SMA的荧光值,检测成纤维细胞中CD90、α-SMA的表达情况,并分析CD90和α-SMA表达的关系。结果增生性瘢痕来源成纤维细胞的CD90表达强于正常皮肤的成纤维细胞（P〈0.05）,瘢痕疙瘩来源成纤维细胞的CD90表达和正常皮肤的表达无差异（P〉0.05）;增生性瘢痕与其周围皮肤、瘢痕疙瘩与其周围正常皮肤来源成纤维细胞的α-SMA表达均无差异（P〉0.05）;在同一细胞内CD90和α-SMA具有共区域和共趋势表达的特点。结论增生性瘢痕来源的成纤维细胞存在CD90多量表达的特异表型,瘢痕成纤维细胞CD90和α-SMA有共区域表达的特点和一致的表达趋势,二者可能有一定的协同关系。     

复合培养人工皮移植12例疗效观察

目的 在体外培养表皮细胞及成纤维细胞并与人工真皮复合培养,用以修复患者皮肤缺损创面.方法 从12例皮肤缺损患者体表切取皮肤标本,分离成单个表皮细胞和小块真皮组织进行体外培养、增殖,将收获的表皮细胞和成纤维细胞与人工真皮复合培养,形成人工皮,移植于患者皮肤缺损创面.结果 复合培养人工皮能存活,形成皮肤替代物,皮肤缺损创面得以修复.结论 复合培养人工皮能在新鲜创面上存活,形成皮肤替代物,性质比单纯培养表皮细胞膜片移植效果好,比自体皮片扩增速度快.     

大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

目的建立大鼠乳鼠背部皮肤组织和尾尖部皮肤组织成纤维细胞的体外培养方法,并比较二者的区别。方法分别取大鼠乳鼠的背部和尾尖部皮肤组织,利用组织贴块法分离和培养皮肤成纤维细胞,用酶消化法进行细胞传代培养,采用梯度温度冻存细胞。倒置显微镜下观察成纤维细胞的形态,用细胞骨架波形蛋白抗体进行鉴定。结果光学显微镜下3~5 d可见细胞从组织块游出,7 d细胞数量增多,10 d可贴满培养瓶壁;且大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞波形蛋白表达均为阳性。结论大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞的生物特点无差别,均可作为皮肤成纤维细胞的取材部位。     

体外培养皮肤成纤维细胞中铜含量的测定——肝豆状核变性研究的新途径

肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration,HLD)是一种铜代谢紊乱而引起的常染色体隐性遗传的疾病。本病最基本的生化缺陷尚不清楚。为了开展本病发病机理方面的研究工作,我们应用皮肤成纤维细胞离体培养的方法建立了病人的细胞模型,并应用阳极溶出伏安法测定了培养细胞中的铜含量。测定结果表明7例HLD患者培养细胞内铜的平均含量约为对照组的三倍。证实了本病铜积聚的遗传特征在离体培养的皮肤成纤维细胞中也得到表现,因而为研究HLD的发病机理开辟了一条新的研究途径。     

人皮肤成纤维细胞原代培养中组织块法及其注意事项

0引言 成纤维细胞是皮肤组织受损后的主要修复细胞.正常情况下,其处于相对静止状态,当皮肤受损或发生某些病变时,成纤维细胞表现为增生活跃和代谢旺盛[1].近年来,国内已有一些科研单位开展皮肤成纤维细胞的培养技术,以获得在体外稳定生长的正常皮肤成纤维细胞,从而为自体皮肤成纤维细胞的基因治疗和相关疾病的研究提供充足、可靠的靶细胞[2].国内各实验室在进行成纤维细胞原代培养时方法不一,多以组织块法和酶消化法为主.我们通过应用组织块法进行皮肤成纤维细胞原代培养而获得大量稳定细胞,并总结出皮肤成纤维细胞原代培养中组织块方法的注意事项,为今后进行细胞培养起到了一定的指导作用.     

人皮肤瘢痕成纤维细胞原代培养及其生长曲线的研究

目的 建立可靠的人皮肤瘢痕成纤维细胞培养方法,探索细胞的生长规律,为皮肤瘢痕体外研究提供平台.方法 采用组织块贴壁法原代培养瘢痕成纤维细胞,波形蛋白免疫细胞化学法鉴定成纤维细胞,CCK-8测定细胞生长曲线.结果 人皮肤瘢痕原代成纤维细胞培养成功,细胞形态为长梭形,波形蛋白表达阳性,16～18天可传第1代,以后每7～8天可传1代,传代后5～6天时为活跃期,第7天进入停滞期.结论 培养出的人皮肤瘢痕成纤维细胞在传代后第5～6天最适于于体外实验研究.     

正常人皮肤成纤维细胞不同培养条件下的生物学特性

目的 观察成纤维细胞在不同培养条件下生长,增殖,代谢及蛋白质合成等情况,探讨成纤维细胞的最佳培养模型。方法 将正常皮肤中的成纤维细胞（NsFb）分离出来并进行原代及继代培养,之后建立不同的成纤维细胞培养系统,分别利用绘制细胞生长曲线,^3H-胸腺嘧啶（^3H-TdR）掺入及^3H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖,DNA代谢及胶原合成等情况,研究细胞在不同条件下的生物学特性。结果 成纤维细胞在单层及纤维蛋白胶中培养时细胞的增殖,代谢及蛋白质合成等生物学功能均明显强于两种胶原凝胶中培养时的情况。结论 以纤维蛋白胶为支架的三维培养系统能更好地模拟生理条件下创面愈合时成纤维细胞的生物学特性。     

PGA支架上人与猪皮肤成纤维细胞增殖和基质分泌的比较

目的对人与猪皮肤成纤维细胞作为肌腱组织工程种子细胞,进行可行性比较。方法酶消化法获取人与猪皮肤成纤维细胞,培养扩增,取第2代细胞,以1×106/mL的细胞密度接种至聚羟基乙酸(PGA)圆柱形支架上体外培养。通过大体、组织学及增殖曲线观察,羟脯氨酸定量测定以及免疫组化检测,比较两种细胞在PGA支架的黏附、增殖及基质分泌能力。结果组织学及三维增殖曲线观察结果显示,与猪皮肤成纤维细胞比较,人皮肤成纤维细胞与支架的黏附能力及细胞增殖能力良好;接种后第6天和第12天,HE染色可见人皮肤成纤维细胞-PGA复合物有连续的基质形成,两者羟脯氨酸含量分别为(2.23±0.25)μg/mgprotvs(1.07±0.18)μg/mgprot和(3.72±0.39)μg/mgprotvs(0.27±0.04)μg/mgprot,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫组化结果显示,接种后第12天,两种复合物的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均呈阳性。结论与猪皮肤成纤维细胞相比,人皮肤成纤维细胞更有希望作为肌腱组织工程的种子细胞。     

PGA支架上人与猪皮肤成纤维细胞增殖和基质分泌的比较

目的 对人与猪皮肤成纤维细胞作为肌腱组织工程种子细胞,进行可行性比较.方法 酶消化法获取人与猪皮肤成纤维细胞,培养扩增,取第2代细胞,以1×106/mL的细胞密度接种至聚羟基乙酸(PGA)圆柱形支架上体外培养.通过大体、组织学及增殖曲线观察,羟脯氨酸定量测定以及免疫组化检测,比较两种细胞在PGA支架的黏附、增殖及基质分泌能力.结果 组织学及三维增殖曲线观察结果显示,与猪皮肤成纤维细胞比较,人皮肤成纤维细胞与支架的黏附能力及细胞增殖能力良好;接种后第6天和第12天,HE染色可见人皮肤成纤维细胞-PGA复合物有连续的基质形成,两者羟脯氨酸含量分别为(2.23±0.25)μg/mgprot vs(1.07±0.18)μg/mgprot和(3.72±0.39)μg/mgprot vs(0.27±0.04)μg/mgprot,差异具有统计学意义(P＜0.05);免疫组化结果显示,接种后第12天,两种复合物的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均呈阳性.结论 与猪皮肤成纤维细胞相比,人皮肤成纤维细胞更有希望作为肌腱组织工程的种子细胞.     

Joseph病黄氏家系患者皮肤成纤维细胞组织化学研究

本文用细胞化学方法,对Joseph病黄氏家系患者(2例)的皮肤成纤维细胞的DNA、糖原、脂类的含量和SDH、LDH、GDH、ACPase及过氧化物酶的活性进行了观察和显微分光光度计定量测定。并与非神经性疾患患者(1例)对照,发现①Joseph病组培养的皮肤成纤维细胞的DNA含量、GDH和过氧化物酶的活性明显低于对照组;②Joseph病组皮肤成纤维细胞的LDH、ACPase活性及糖原的含量显著高于对照组。此外,也看到少量中性脂肪小滴存在于1例Joseph病患者培养的皮肤成纤维细胞质里。本结果表明上述变化可能与Joseph病的病理发生有关。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的 探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法.方法 采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶I联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代.并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色.结果 倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性.结论 建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞.     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

甘油单油酸酯液晶载体材料的体外毒性研究

目的：评价立方液晶载体材料甘油单油酸酯（glycerol monoolein,GMO）的细胞毒性。方法：体外培养大鼠皮肤成纤维细胞,以MTT法及琼脂覆盖法评价立方液晶对大鼠皮肤成纤维细胞的细胞毒性分级情况。结果：甘油单油酸酯对大鼠皮肤成纤维细胞的细胞活力无明显影响,毒性分级为0级。结论：甘油单油酸酯无潜在的细胞毒性,是一种生物相容性良好的载体材料。