培元抗癌汤通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调节Lewis肺癌自噬抑制肿瘤生长和转移的实验研究

目的 观察培元抗癌汤对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及肿瘤肺转移的抑制作用,探讨培元抗癌汤对自噬及PI3K-AKT-mTOR信号通路的影响.方法 Lewis肺癌细胞接种在C57BL/6小鼠右腋皮下,制成Lewis肺癌荷瘤小鼠模型.将荷瘤小鼠随机分为模型组、顺铂组、培元抗癌汤组、培元抗癌汤-顺铂组,分别给予中药灌胃、顺铂腹腔注射,进行药物干预后,观察各组小鼠生存质量;观察肺转移灶、计算肺转移抑制率;称取各组荷瘤小鼠肿瘤的质量、计算抑瘤率;透射电镜观察自噬泡的形成;Western blot法检测肿瘤组织中自噬因子LC3 Ⅰ及LC3 Ⅱ蛋白的表达,检测肿瘤组织中PI3K、p-PI3 K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达.结果 模型组、顺铂组小鼠生存质量差,小鼠有聚集、毛发脱落、反应迟缓等现象,培元抗癌汤组、培元抗癌汤-顺铂组小鼠生存质量较好.与模型组比较,培元抗癌汤组、培元抗癌汤-顺铂组能明显抑制肺转移(P＜0.05),顺铂组有抑制肺转移趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05);培元抗癌汤-顺铂组肺转移抑制率则明显高于培元抗癌汤组.与模型组比较,顺铂组、培元抗癌汤组、培元抗癌汤-顺铂组能明显抑制肿瘤生长,差异有统计学意义(P＜0.05),顺铂组高于培元抗癌汤组(P＜0.05),培元抗癌汤-顺铂组明显高于培元抗癌汤组和顺铂组.与模型相比,顺铂组、培元抗癌汤组、培元抗癌汤-顺铂组自噬泡明显增多,提示自噬增强.各用药组肿瘤组织中LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ均明显高于模型组(P＜0.05);与培元抗癌汤组比较,顺铂组、培元抗癌汤-顺铂组的LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达更高(P＜0.05),而培元抗癌汤-顺铂组的LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达最高.与模型组比较,各用药组肿瘤组织中PI3K、AKT、mTOR的表达无明显差异(P＞0.05),各用药组肿瘤组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达均明显低于模型组(P＜0.05);与培元抗癌汤组比较,顺铂组、培元抗癌汤-顺铂组的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达更低(P＜0.05),而培元抗癌汤-顺铂组的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达最低.结论 培元抗癌汤能明显改善小鼠生存质量及抑制肿瘤生长及转移,其机制可能是抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路,增强肿瘤自噬.     

益肺散结方对肺纤维化大鼠模型自噬及PI3K-AKT-mTOR通路的影响

【摘要】 目的 探讨益肺散结方对肺纤维化（PF）大鼠肺组织中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素靶分子（mTOR）信号通路及自噬的影响。 方法 选取SD大鼠50只,随机选10只行气管插管术并注入生理盐水0.3 mL作为对照组,其余40只大鼠行气管插管并注入博莱霉素（BLM）5 mg/kg,0.3 mL,制备PF模型,造模成功后,随机分为模型组（PF组）、益肺散结方低（7.5 g/kg）、中（15 g/kg）、高（30 g/kg）剂量组,每组各10只。对照组、PF组经灌胃给予生理盐水,益肺散结方各剂量组灌胃给予相应剂量药物1次/d,共给药21 d。末次给药12 h 后,处死大鼠取肺组织;用苏木精-伊红染色（HE）观察肺组织病理形态;马松（Masson）染色法评估胶原增殖程度;羟脯氨酸试剂盒测定胶原蛋白含量;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR及自噬相关蛋白beclin-1、泛素和LC3结合蛋白p62（p62）、ɑ-平滑肌动蛋白（ɑ-SMA）、微管相关蛋白轻链3（LC3-Ⅱ）/LC3-Ⅰ表达水平。 结果 与对照组相比,PF组大鼠肺组织炎性细胞浸润及炎性程度评分、胶原增殖程度及评分、胶原蛋白含量、通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR相对表达水平、自噬相关蛋白ɑ-SMA和p62均升高（均P＜0.05）,自噬相关蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ均降低（均P＜0.05）。与PF组相比,益肺散结方高、中、低剂量组大鼠肺组织炎性细胞浸润及炎性程度评分、胶原增殖程度及评分、胶原蛋白含量、通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR相对表达水平、自噬相关蛋白ɑ-SMA和p62均降低（均P＜0.05）,自噬相关蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均升高（均P＜0.05）。 结论 益肺散结方可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路表达,提高肺组织细胞自噬活性,缓解肺纤维化进程。     

Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的探讨Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响。方法将小鼠胚胎成纤维前脂肪细胞3T3-L1诱导分化为成熟脂肪细胞,随机分为对照组、Adropin组、自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组。对照组细胞不予特殊处理,Adropin组细胞加入Adropin (终浓度为1 000 nmol·L-1),自噬激动剂组加入西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),Adropin+自噬激动剂组细胞加入Adropin(终浓度为1 000 nmol·L-1)和西罗莫司(终浓度为100 nmol·L-1),继续培养2 h;采用单丹磺酰尸胺染色检测各组细胞中自噬空泡情况,细胞免疫荧光染色法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)表达,采用Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62及PI3K/AKT通路蛋白PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)的表达。结果与对照组比较,Adropin组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。与对照组比较,自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。Adropin+自噬激动剂组与对照组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。与Adropin组比较,自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05)。与自噬激动剂组比较,Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P <0. 05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05)。4组细胞中PI3K、AKT蛋白相对表达量两两比较差异均无统计学意义(P> 0. 05)。结论 Adropin可抑制脂肪细胞自噬,其机制可能是通过激活PI3K/AKT通路而实现。     

槲皮素对小鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

目的:探讨槲皮素对小鼠肺缺血再灌损伤(LIRI)的保护作用及可能的机制.方法:将40只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、模型组、槲皮素低剂量(2.5 mg/kg)组、中剂量(5 mg/kg)组和高剂量(10 mg/kg)组,每组各8只.实验前5 d,槲皮素各剂量组小鼠灌胃给予相应剂量槲皮素,对照组和模型组小鼠灌胃给予等体积生理盐水;微血管钳闭塞左肺门肺血管建立LIRI小鼠模型;HE染色观察肺组织病理损伤;测量小鼠肺组织湿/干重比(W/D)值;酶联免疫吸附试验(ELISA)测量肺组织和血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量;蛋白免疫印迹检测肺组织中PI3K-AKT-NFKB信号相关蛋白的表达量.结果:与模型组比较,槲皮素呈剂量依赖性缓解LIRI引起的肺泡壁水肿、肺间质增厚、肺泡结构破坏和肺泡腔内大量炎性细胞浸润等病理变化,降低肺损伤评分(P＜0.05);ELISA结果显示,槲皮素呈剂量依赖性降低LIRI小鼠肺组织和血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量(P＜0.05);蛋白免疫印迹结果显示,槲皮素呈剂量依赖性降低小鼠肺组织中p-p65/p65、p-IKBα、p-AKT/AKT和p-PI3K蛋白表达量(P＜0.05).结论:槲皮素能有效改善小鼠LIRI,机制可能与抑制PI3K-AKT-NFκB信号通路有关.     

基于PI3K/AKT/HIF-1α信号通路研究易层敷贴缓解TGF-β1诱导的膝骨关节炎大鼠滑膜纤维化的机制

目的 探讨易层敷贴对膝骨关节炎(KOA)大鼠滑膜纤维化TGF-β1、α-SMA、COL1A1表达的影响以及对PI3K/AKT/HIF-1α信号通路的调控作用。方法 将30只SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组和易层组,膝关节腔注射200 ng转化生长因子-β1重组蛋白(TGF-β1)建立膝关节滑膜纤维化动物模型,2 d 1次,持续3次,造模14 d后给予易层敷贴外用治疗28 d后取滑膜组织。HE和Masson染色观察滑膜病理变化;免疫组化检测滑膜p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1的表达水平。提取雄性SD大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞(FLSs),以10 ng·mL^-1 TGF-β1诱导24 h建立KOA滑膜纤维化细胞模型,易层冻干粉干预24 h, Western blot检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1的蛋白表达,qPCR检测HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1 mRNA表达。结果 与空白组相比,模型组HE染色滑膜炎加重(P<0.01...     

麦门冬汤对肺纤维化大鼠肺功能及内质网应激作用的影响

目的探讨麦门冬汤改善博来霉素所致肺纤维化模型大鼠肺功能及内质网应激(ERS)作用的相关机制。方法健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、麦门冬汤1组(麦门冬与大枣质量比4∶1)、麦门冬汤2组(麦门冬与大枣质量比20∶1),经气管插管雾化注射博来霉素建立肺纤维化大鼠模型。造模后第14天每日早晚2次灌胃麦门冬汤,连续给药20 d。观察大鼠一般情况,通过HE和Masson染色观察肺组织的病理变化,检测大鼠用力肺活量(FVC)、0.4秒率(FEV0.4/FVC)、质量FVC、吸气阻力(Ri)、呼气阻力(Re)、肺顺应性(Cydn),并用Western blot和免疫组织化学染色分析肺组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达情况。结果与正常组相比,模型组FVC降低、0.4秒率升高、质量FVC下降、Cydn降低;与模型组相比,麦门冬汤1组和麦门冬汤2组FVC升高、0.4秒率降低,麦门冬汤2组质量FVC回升,麦门冬汤1组和麦门冬汤2组Cydn升高。病理可见模型组大鼠的肺组织实变区内慢性炎性细胞浸润,大量胶原沉积,高表达的GRP78和CHOP蛋白主要定位于空泡化的Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡs)。麦门冬汤2组大鼠炎症缓解,胶原沉积减少,肺组织中GRP78和CHOP蛋白的表达均减少。结论麦门冬汤能够明显改善大鼠肺功能,减少肺间质胶原沉积,可能与调节纤维化肺组织实变区内AECⅡs的GRP78和CHOP蛋白表达,缓解ERS压力,恢复AECⅡs的正常功能有关。     

右美托咪定对脂多糖致小鼠急性 肺损伤及肺泡巨噬细胞自噬的 影响

目的 探讨右美托咪定（Dex）对脂多糖（LPS）致小鼠急性肺损伤及肺泡巨噬细胞自噬的影响。 方法 将30只雄性 C57BL/6小鼠按随机数字表法分为对照组（Con 组）、LPS 组、Dex+LPS 组,每组各10 只。LPS 组小鼠和Dex+LPS组小鼠腹腔注射 LPS 10 mg/kg,Con组小鼠腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液;其中Dex+LPS组小鼠注射LPS前30 min,腹腔注射Dex 50 μg/kg,同时 Con 组和 LPS 组小鼠注射等量 0.9%氯化钠注射液。观察小鼠造模后 24 h 状态,行小鼠脓毒症评分（MSS）,ELISA 法检测血清 TNF-α和IL-6水平,HE染色法观察肺组织病理变化,Western blot法检测小鼠肺组织中微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅰ和Ⅱ蛋白表 达情况,计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。免疫荧光检测肺组织中LC3B、CD68表达情况,并计算LC3B与CD68共定位荧光面积/CD68荧 光面积。 结果 MSS评分提示LPS组和Dex+LPS组小鼠脓毒症造模成功。与Con组小鼠比较,LPS组小鼠的血清TNF-α和IL-6 水平、肺损伤评分、肺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,LC3B与CD68共定位荧光面积/CD68荧光面积增加（均P＜0.01）;与LPS组小 鼠比较,Dex+LPS组小鼠的血清TNF-α和IL-6水平、肺损伤评分、肺组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,LC3B与CD68共定位荧光面 积/CD68荧光面积减少（均P＜0.05）。 结论 Dex能保护LPS致小鼠急性肺损伤,减轻炎症反应,下调自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值,抑制LPS导致肺组织中肺泡巨噬细胞自噬的过度激活。     

基于PI3 K/AKT/mTOR信号通路研究补肾法对体外培养小鼠卵母细胞成熟的促进作用

目的 研究补肾法对体外培养小鼠卵母细胞成熟的促进作用及其与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路的关系.方法 给6～8周龄雌性大鼠灌服补肾调经Ⅲ号方制备含药血清.将3～4周龄雌性小鼠随机分为A、B组,A组灌胃蒸馏水,B组序贯灌胃补肾调经系列方(Ⅱ号方和Ⅲ号方),各灌胃12 d.第11天腹腔注射孕马血清促性腺激素(5 IU/只),48 h后剥离卵巢,取出卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养.将A组COCs分为空白对照组和抑制剂组(25μmol/L LY294002),B组分为补肾组(10％补肾调经Ⅲ号方含药血清)和补肾加抑制剂组(10％补肾调经Ⅲ号方含药血清+25μmol/L LY294002).体外培养18 h后,在显微镜下统计各组第一极体排出量并计算排出率.收集COCs,RT-PCR法检测各组COCs中Bcl-2、Bax、PI3 K、AKT、mTOR mRNA的表达,免疫荧光染色法检测各组COCs中Bcl-2、Bax、PI3 K、AKT、mTOR、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白表达.结果 第一极体排出率补肾组高于空白对照组(P<0.05),抑制剂组低于空白对照组(P<0.05),补肾加抑制剂组低于补肾组(P<0.05).RT-PCR结果显示,与空白对照组比较,补肾组COCs中Bcl-2、PI3 K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均升高(P<0.05),Bax mRNA表达降低(P<0.05);抑制剂组COCs中Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均下降(P<0.05),Bax mRNA表达升高(P<0.05).与补肾组比较,补肾加抑制剂组COCs中Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均降低(P<0.05),Bax mRNA表达升高(P<0.05).免疫荧光染色结果显示,各组间PI3 K、AKT、mTOR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,补肾组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3 K/PI3 K、p-AKT/AKT升高(P<0.05),Bax蛋白表达降低(P<0.05);抑制剂组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.05).与补肾组比较,补肾加抑制剂组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3 K/PI3 K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.05).结论 补肾调经系列方可通过调控PI3 K/AKT/mTOR信号通路、上调Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表达的比值、抑制COCs凋亡从而促进小鼠卵母细胞成熟.     

五参顺脉胶囊通过自噬改善心肌缺血再灌注损伤

目的探讨自噬在五参顺脉胶囊改善大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法建立心肌缺血再灌注损伤模型,随机法,将其分为假手术组、模型组、五参顺脉胶囊组、自噬抑制剂组(五参顺脉胶囊+LY294002)每组15只。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)浓度2 ,3 ,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测定心肌梗死体积,原位末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡,电镜下计数大鼠心肌细胞自噬体数量,Western blot检测总PI3K、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其磷酸化蛋白表达,自噬标记物微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度、心肌梗死区比例、凋亡指数、自噬体数量、心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、caspase3、Bax增加(P0.05),心肌组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、Bcl2水平降低(P0.05);与模型组比较,五参顺脉胶囊组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度、心肌梗死区比例、凋亡指数、自噬体数量、心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、caspase3、Bax降低(P0.05),心肌组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、Bcl2水平增加(P0.05);与五参顺脉胶囊组比较,自噬抑制剂组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度、心肌梗死区比例、凋亡指数、自噬体数量、心肌组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、caspase3、Bax增加(P0.05),心肌组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、Bcl2水平降低(P0.05)。结论五参顺脉胶囊抑制心肌细胞过度自噬对心肌缺血再灌注损伤大鼠发挥保护作用。     

白细胞介素25在哮喘小鼠肺组织中的表达及其对气道重塑的影响

目的 研究白细胞介素(IL)-25在哮喘小鼠肺组织内表达及其对气道重塑的影响.方法 选取郑州大学基础医学院饲养的90只雌性BALB/C小鼠作为实验对象,分为对照组、实验组各45只.对照组雾化吸入生理盐水,实验组雾化吸入鸡卵清蛋白(OVA)溶液制备动物哮喘模型;采用酶联免疫吸附法测定血清、肺泡灌洗液内IL-25、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)浓度;采用蛋白质印迹法、免疫组织化学法检测肺组织内IL-25、α-SMA;RT-PCR检测IL-25 mRNA表达水平.结果 对照组小鼠血清、肺泡灌洗液内IL-25、α-SMA水平均低于实验组,肺组织内IL-25 mRNA也低于实验组(P＜0.05).免疫组织化学法检测:实验组小鼠肺组织内IL-25、α-SMA水平均呈高表达,对照组小鼠肺组织内IL-25、α-SMA几乎无表达.蛋白质印迹法检测:实验组小鼠肺组织内IL-25、α-SMA水平明显高于对照组(P＜0.05).相关性分析显示,实验组内IL-25、α-SMA呈正相关(r=0.751,P＜0.05).结论 IL-25、α-SMA在哮喘小鼠肺组织中呈相对高表达,可能促进哮喘小鼠产生气道重塑.     

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织自噬相关蛋白的变化

目的研究在慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)大鼠肺组织中自噬相关蛋白的变化。方法单纯烟熏法构建慢阻肺大鼠动物模型,采用Real time PCR,Western blot技术检测检测大鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR及自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1、P62、Atg7、Atg12的mRNA及蛋白表达,探讨在慢阻肺大鼠肺组织中自噬水平及自噬相关蛋白的变化。用LC3B免疫组化比较COPD组与正常大鼠间自噬水平的变化。结果 Real time PCR分析结果显示,与正常组相比,慢阻肺组大鼠肺组织中自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12的mRNA表达显著增高(P0.05,其中Beclin1、Atg5两组比较P0.01)。Atg7的mRNA表达在慢阻肺组与正常组之间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot分析结果显示,慢阻肺组大鼠肺组织中PI3K蛋白、p-AKT/AKT及p-m TOR/m TOR蛋白表达显著降低(P0.05)。自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1蛋白表达增高(P0.05,其中LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5两组比较P0.01)。P62蛋白表达显著下降(P0.01)。LC3B免疫组化显示,慢阻肺组LC3B表达高于正常组。结论烟熏12周的慢阻肺大鼠与正常组相比,自噬通路上游蛋白PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR的表达降低,自噬蛋白表达增加,自噬水平增加。     

RSV诱导哮喘小鼠树突细胞自噬机制及五虎汤的干预作用

目的研究PI3K/Akt/mTOR信号通路对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)诱导哮喘小鼠树突细胞(dendritic cells,DC)自噬的调控机制及五虎汤的干预作用。方法用RSV滴鼻联合雾化鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)激发的方法制备哮喘小鼠模型,造模后的小鼠分为模型组、五虎汤低剂量组、五虎汤中剂量组、五虎汤高剂量组、地塞米松组、雷帕霉素组、氯喹组,每组10只,并设空白组(10只)对照。实验结束后PAS、Masson染色观察评价肺组织病变情况,并计算气道黏液储备指数与胶原沉积指数;电镜观察自噬小体;Western blot检测DC自噬相关蛋白及对PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键蛋白PI3K、p-Akt、p-mTOR表达的影响。结果气道反应性结果显示造模成功。病理染色显示模型组小鼠气道黏液储备指数与胶原沉积指数较空白组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,五虎汤各剂量组及其他药物组哮喘小鼠气道黏液储备指数与胶原沉积指数降低,差异有统计学意义(P<0.01)。电镜下观察小鼠肺组织自噬小体显示模型组相较于空白组中自噬小体数量明显增加,各治疗组的自噬小体较模型组增加。Western blot显示,自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在五虎汤各剂量组以及雷帕霉素组中的表达显著增高,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01);氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平较模型组降低(P<0.01);地塞米松组与模型组比较,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平相对表达无统计学差异(P>0.05);通路关键蛋白表达水平显示,五虎汤各剂量组及雷帕霉素组中PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表达水平与模型组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论RSV诱导哮喘小鼠树突细胞自噬水平上升,PI3K/Akt/mTOR信号通路被活化,五虎汤通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,进一步上调树突细胞的自噬,减轻气道重塑。     

树突棘及突触发育障碍诱发自闭症小鼠核心症状的机制

目的 探讨前额叶皮层（PFC）树突棘及突触发育障碍,诱发自闭症（ASD）小鼠核心症状的机制。方法 将C57小鼠按照完全随机设计,分为正常对照组（CON组）,ASD模型组（VPA组）,溶剂对照组（DMSO组）和Wortmannin抑制剂组（Wortmannin组）,10只/组。旷场实验,青年玩耍实验和三箱社交实验评价小鼠的ASD样行为;高尔基染色观察小鼠PFC树突棘密度的变化;Western blot检测小鼠PFC信号通路相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR以及突触相关蛋白PSD95、p-Syn、Syn的表达;免疫荧光染色观察PSD95、p-Syn的变化。结果 与CON组相比,VPA组小鼠出现了ASD样表型,PFC总的、成熟型树突棘密度减少（P<0.05）,未成熟型树突棘密度增加（P<0.01）,信号通路相关蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR表达上调（P<0.05）,突触相关蛋白PSD95和p-Syn/Syn表达下调（P<0.01或P<0.001）。Wortmannin能改善小鼠ASD样表型,改善树突棘发育,下调PI3K/Akt/mTOR信号通路及上调突触相关蛋白的表达。结论 PI3K/Akt/mTOR信号通路的过度激活和突触相关蛋白PSD95、p-Syn表达降低可能导致VPA诱导的ASD小鼠PFC树突棘损伤和突触发育障碍,最终导致ASD样表型。     

转录因子T-bet/GATA-3诱导哮喘模型中α-SMA和Ⅰ型胶原高表达的实验研究

目的观察大鼠肺转录因子T细胞表达的T盒(T-bet)/GATA连接蛋白-3 (GATA3)对肺支气管α-平滑肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原的调解作用,探讨其比率与哮喘早期气道重塑的关系。方法将大鼠随机分为OVA组即哮喘模型组、生理盐水组、空白对照组。采用实时定量-聚合酶链反应法检测大鼠肺组织中T-bet mRNA和GATA-3 mRNA表达,免疫印迹法检测大鼠肺组织中T-bet和GATA-3蛋白表达;免疫组化法测定大鼠肺组织中α-SMA表达水平,酶联免疫吸附法测定成纤维细胞（LF）中Ⅰ型胶原表达强度;比较T-bet/GATA-3与α-SMA和Ⅰ型胶原的关系。结果OVA组大鼠肺组织中T-bet mRNA和蛋白表达强度均较生理盐水组和空白对照组显著减弱;而OVA组GATA 3 mRNA和蛋白表达强度较其余两组显著增强;T-bet/GATA-3比率较其余两组显著减弱;OVA组肺组织α-SMA和LF中Ⅰ型胶原含量较其余两组显著增强;T-bet/GATA-3比率与α-SMA和Ⅰ型胶原均成负相关。结论 T-bet/GATA-3比率与哮喘早期气道重塑的指标α-平滑肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原等呈线性负相关,T-bet/GATA-3失衡可能是哮喘早期气道重塑的重要原因之一。     

硫化氢中毒对大鼠肺钠水主动转运功能的影响

目的:观察硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)中毒对大鼠肺钠水主动转运功能的影响,并探讨其机制?方法:SD大鼠充分暴露于亚致命浓度(300 ppm)的H2S气体3 h,分别于暴露后6?12?24 h检测大鼠肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance,AFC)和肺干湿比,光镜下观察肺组织HE染色,透射电镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞的改变,real-time PCR检测肺组织α-上皮钠通道(epithelial sodium channel,ENaC)mRNA的表达,Western blot检测肺组织α-ENaC以及ERK1/2的蛋白表达?结果:SD大鼠暴露于H2S后,与对照组比较,AFC明显下降,在暴露后6 h最低;肺含水量在暴露后6 h最高,并在12 h恢复至正常水平;光镜下,暴露后24 h大鼠肺组织出现明显损伤性改变;大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞在暴露后出现线粒体脊断裂?板层小体崩解;大鼠肺组织中α-ENaC mRNA 在暴露后6 h表达增多,在12 h恢复至正常水平;α-ENaC的蛋白表达与对照组相比,则在暴露后6 h明显降低;大鼠肺组织ERK1/2磷酸化水平在暴露后6 h显著增高?结论:硫化氢中毒降低了大鼠AFC,其机制可能是下调了α-ENaC的表达,并且ERK1/2信号通路的激活可能参与了整个损伤过程?     

槲皮素对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞AKT/mTOR信号通路及自噬的影响

目的：分析槲皮素对人脐静脉内皮细胞自噬和增殖的影响,探讨其与AKT/mTOR信号通路调控的关系及机制。方法：培养人脐静脉内皮细胞,MTT法检测细胞活力,MDC染色法检测自噬泡水平,Western印迹检测自噬相关蛋白水平,运用3-MA研究槲皮素对自噬和细胞增殖的影响。结果：槲皮素能增加人脐静脉内皮细胞活力(P<0.01),上调细胞中MDC染色标记的荧光颗粒,并伴随浓度的上调明显增加(P<0.01),能促进脐静脉内皮细胞中自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平表达(P<0.01),降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.01)。与槲皮素组比较,槲皮素+3-MA组细胞活力和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均明显降低(P<0.05),p-mTOR/mTOR明显增加(P<0.05)。结论：槲皮素可通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬来调控脐静脉内皮细胞增殖。     

七氟烷预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤肺组织细胞自噬水平的影响

目的 探讨七氟烷预处理对大鼠肺缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)肺组织中细胞自噬的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠75只,采用开胸夹闭左肺门建立IRI模型,将75只大鼠编号后按随机数字表法分为5组:假手术组(Sham),缺血再灌注组(I/R),七氟烷预处理组(SEVO),LY294002组(LY)及七氟烷预处理+LY294002组(PI3K抑制剂)(SEVO+LY),各15只.缺血1h,再灌注120 min后处死各组大鼠,取出肺组织,检测大鼠肺组织湿/干重比(W/D),Western blot法测定肺组织Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及p-PI3K表达.结果 与Sham组比较,I/R组肺组织发生严重水肿(P＜0.05),且肺组织细胞自噬水平增加,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达上调(P＜0.05);与I/R组比较,SEVO组肺水肿明显减轻(P＜0.05),Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达下调,而p-PI3K表达增加(P＜0.05),LY组与I/R组比较差异没有统计学意义(P＞0.05);与SEVO组比较,SEVO+ LY组中肺水肿明显加重,Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达上调而p-PI3K表达下调(P＜0.05).结论 七氟烷预处理通过激活PI3K信号转导通路,恢复LIRI期间细胞自噬流,减少自噬性细胞死亡从而对肺缺血再灌注损伤起保护作用.     

宫内致敏及生后高氧暴露对新生小鼠TGF-β1及α-SMA表达的影响

目的观察宫内炎性致敏及生后高氧暴露新生小鼠转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)在新生鼠肺组织的表达情况,探讨支气管肺发育不良(Bronchop-ulmonary dysplasia,BPD)发病机制。方法新生小鼠按照随机数字表法分为LPS组+空气组、LPS+高氧组、生理盐水+空气对照组、生理盐水+高氧组,应用HE染色、放射性肺泡计数(RAC)、免疫组织化学、免疫荧光化学和荧光定量PCR技术,讨论生后第1、3、7、10、14天肺组织的病理改变,检测TGF-β1、α-SMA蛋白和基因mRNA表达水平。结果LPS+高氧组和生理盐水+高氧组出现肺发育障碍,肺泡逐渐融合,RAC逐渐降低,与生理盐水+高氧组比较,LPS+高氧组降低明显(P<0.05)。②LPS+高氧组和生理盐水+高氧组第3天后肺组织TGF-β1蛋白表达明显高于LPS组+空气组和生理盐水+空气组(P=0.000),随着暴露时间的延长进行性增高。③LPS+高氧组和生理盐水+高氧组7d后肺组织α-SMA蛋白表达明显高于LPS组+空...     

血管紧张素-(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导的肾小管上皮细胞E-cadherin、α-SMA表达的影响

目的探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)E-cadherin,α-SMA表达的影响。方法体外培养NRK52E细胞,经Ang-(1-7)和AngⅡ(终浓度均为10~(-6)mol/L)干预24、48、72、96 h后,应用细胞免疫化学法检测E-cadherin、α-SMA蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR(RTPCR)检测细胞中E-cadherin和α-SMA mRNA表达水平的变化。结果 AngⅡ作用96 h后,E-cadherin蛋白及E-cadherinmRNA表达显著减弱(P<0.05),α-SMA蛋白及α-SMA mRNA表达显著增强(P<0.05);同时加入Ang-(1-7)后,与AngⅡ组比较,E-cadherin蛋白及E-cadherin mRNA的表达增强(P<0.05),α-SMA蛋白及α-SMA mRNA表达减弱(P<0.05)。结论 Ang-(1-7)能够抑制AngⅡ诱导的α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达。     

养正消积胶囊通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用研究

目的:探讨养正消积胶囊通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肺腺癌细胞凋亡和自噬的作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台对养正消积胶囊重要的4个组分进行分析，筛选有效化合物及与肺腺癌相关基因，并对作用通路进行预测；使用DMSO法对养正消积胶囊成分进行提取后标记为DME25,取对数生长期肺腺癌A549细胞，依据不同DME25浓度分为空白对照组、DME25高(1∶200)、中(1∶1 000)、低浓度组(1∶5 000)。经药物干预48 h后，Western blot法检测细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平变化。结果:与正常对照组相比，DME25低、中、高浓度组中A549细胞增殖能力、迁移、侵袭能力减弱，凋亡率均增高，且呈剂量依赖性。Western blot结果显示，A549细胞经DME25干预24 h后，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达水平升高，同时促进LC3I向ILC3II转化(P<0.01)。与对照组对比，经DME25干预的各组A549细胞中的p-PI3K、p-AKT及p-mTOR蛋白含量均降低，加入PI3K激活...