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相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 93 毫秒
1.
目的以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物。方法利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G。用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒。通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度。用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达。结果载体BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致。浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求。PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达。结论通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型。  相似文献   

2.
[目的]以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物.[方法]利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G.用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒.通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度.用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达.[结果]载体BamH I、EcoR I双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致.浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求.PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达.[结论]通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型.  相似文献   

3.
目的构建和筛选小鼠P4503A11基因miR RNAi慢病毒载体,建立CYP3A11基因knock-down小鼠。方法利用Ravi Sachidanandam's Lab的在线软件设计沉默小鼠P4503A11基因的miRNA所对应的shRNA序列,PCR扩增后克隆到PCI-GFP-MiR质粒中,其再与慢病毒载体FUW进行重组。将psPAX2和pMD2.G两个载体和FUW-GFP-MiR-shRNA重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒。用包装好的病毒液感染293FT细胞后,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定。将上述重组慢病毒载体分别转染FVB/N小鼠肝细胞,转染48h后,检测P4503A11基因mRNA表达水平的变化。选取干扰效果最好的FUW-GFP-MiR-shRNA1重组慢病毒载体进行制备基因knock-down小鼠模型。用显微注射法将浓缩的shRNA1病毒液注射至FVB/N小鼠12细胞期胚胎透明带下。将注射后发育至22细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠。在紫外光照射下利用滤光片观察GFP在小鼠活体内的表达水平。结果DNA测序结果显示3个重组慢病毒载体均与所设计的shRNA序列一致。检...  相似文献   

4.
目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只(R3和R4)鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只(R1、R2、R3、R4和R5)基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉(RNAi),并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。  相似文献   

5.
慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立   总被引:4,自引:4,他引:4  
目的 针对不同哺乳类细胞建立相应的慢病毒体外感染体系,以建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统.方法 按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染)、超速离心浓缩和保存等,随后用病毒上清或浓缩后的病毒感染293FT细胞.24~48 h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产:将携带EGFP基因的病毒上清或浓缩后的病毒分别加入内含293FT细胞、小鼠ES细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)或小鼠睾丸生殖细胞的培养板孔内,感染6~12 h后.用相应培养基替换感染液,数天后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功感染不同哺乳类细胞.结果 按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒(病毒上清或浓缩后的病毒)成功高效率感染293FT细胞、MEFs或小鼠睾丸生殖细胞;用浓缩后的病毒(携带EGFP基因)感染小鼠ES细胞.亦可获得EGFP阳性的ES细胞克隆.结论 熟练掌握了慢病毒包装、浓缩及鉴定等技术.同时针对不同哺乳类细胞建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外传递系统,这些为相关后续研究打下了良好的基础.  相似文献   

6.
目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型,并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法,把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠,经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。  相似文献   

7.
人NESG1基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的克隆人NESG1基因,构建与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体pGC-FU-NESG1-EGFP,包装慢病毒,感染293FT细胞并进行鉴定。方法以NESG1全长克隆为模板扩增其编码框序列,通过限制性内切酶AgeI酶切、T4 DNA连接酶连接,将NESG1插入慢病毒载体pGC-FU-EGFP,构建pGC-FU-NESG1-EGFP重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系293FT,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293FT细胞,荧光显微镜下观察感染效率,Western blot方法检测NESG1-EGFP融合蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体pGC-FU-NESG1-EGFP,三质粒共转染293FT细胞后可见大量绿色荧光;浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/ml;以复感染系数MOI为1感染293FT细胞,感染效率在90%以上。Western blot证实细胞表达NESG1。结论成功构建NESG1慢病毒表达载体,包装得到高滴度慢病毒,为后续感染鼻咽癌细胞,探索其在鼻咽癌发生和发展中的作用奠定了基础。  相似文献   

8.
目的 构建小鼠组蛋白H3 K27三甲基转移酶EZH2基因慢病毒载体及鉴定.方法 以携带EZH2 cDNA的PCMV-SPORT6载体为模板,自行设计携带有Kpnl和Xmal酶切位点的引物PCR扩增出目的基因编码序列,扩增产物用内切酶酶切后定向克隆到慢病毒载体PLenti-eGFP-NEO中,通过PCR、酶切及测序验证载体;将重组慢病毒载体和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE及pMD2G组成的四质粒系统,共转染293T细胞包装成慢病毒,收集含病毒颗粒的细胞上清液,浓缩和纯化后得到高效价的病毒液,转染293T细胞进行效价测定.结果 PCR扩增出约2241 bp的序列,构建的慢病毒载体测序结果与Genebank报道的目的基因序列一致;四质粒系统成功共转染入293T细胞中,在细胞中能够稳定表达,包装出了2.1×108TU/ml的病毒液.结论 成功构建了小鼠EZH2基因慢病毒载体,并得到2.1×108TU/ml高效价的病毒液.  相似文献   

9.
目的 构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础.方法 设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析.MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度.结果 成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/mL.结论 本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础.  相似文献   

10.
目的 构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况.方法 采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLemi6.3-NK4-IRES-EGFP共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度.以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选最适MOI,以最适MOI重组慢病毒感染HCCLM3细胞,观察转染效率.Western blot法测定细胞中NK4蛋白表达水平.结果 成功构建共表达NK4基因和EGFP基因的慢病毒载体pLenti6.3 -NK4 -IRES-EGFP,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL.重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI为7.转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达,而未转染细胞中无NK4蛋白的表达.结论 成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体,有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白.  相似文献   

11.
目的 构建Purα基因过表达以及SiRNA慢病毒表达载体,通过包装病毒,以用于神经系统细胞感染及原代培养神经元的基因操作.方法 1)过表达载体的构建:本实验使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体,PCR扩增Purα全长基因,然后亚克隆到pCDH载体相应的多克隆位点之中,进行酶切和测序鉴定;2)ShRNA慢病毒表达载体的构建:根据shRNA的特征,设计shR-NA的DNA序列以及其反向互补序列,然后合成并克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro的相应位点中.3)慢病毒包装和滴度测定:将克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA载体和病毒包装质粒pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr按相应的比例转染到293FT细胞中,48h后收集上清液,纯化、浓缩,进行滴度测定.结果 测序结果证实所插入片段相位正确,转染后通过RT-PCR和Western blot证实过表达组Purα基因表达增高,而沉寂组的Purα表达抑制,达到实验设计要求,可以用于实验研究.结论 利用本方法可以快速地进行目的基因的基因操作,省时、节约,与同类型的方法比较,具有较大的优越性,可以在实验中推广应用.  相似文献   

12.
构建大鼠凝集素养氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)RNA干扰慢病毒表达载体并观察LOX-1在氧化应激诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法 设计针对大鼠LOX-1的shRNA序列,将shRNA序列插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒载体中,构建慢病毒载体pLL3.7-LOX1。慢病毒载体及包装载体dR8.9、VSVG共转染293FT细胞包装慢病毒。慢病毒侵染H9C2大鼠心肌细胞,RT-PCR鉴定对LOX-1抑制效率,CCK-8、Hochest33258染色检测LOX-1对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果 通过双酶切鉴定,证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,抑制LOX-1能抑制H2O2诱导的细胞活力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较均有统计学意义(P<0.01)。结论 成功构建靶向大鼠LOX-1基因RNAi慢病毒载体,LOX-1激活可能在H2O2诱导心肌细胞凋亡中发挥重要作用。  相似文献   

13.
目的:包装5种携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组逆转录病毒,筛选肝细胞靶向性好的病毒载体。方法:在前期构建的融合表达质粒基础上,构建4种新的表达质粒,采用脂质体法将这5种质粒分别与质粒pL-EGFP共转染已稳定表达Gag-Pol蛋白的NIH3T3包装细胞系中,48h后收获病毒上清,分别感染肝源性HepG2215细胞及非肝源性293T细胞,48 h后提取细胞总RNA,荧光定量PCR比较重组病毒的靶向性。结果:酶切鉴定结果表明4种新的表达质粒构建成功,包装的病毒滴度约为105cfu/ml,以pcDNA3.1(-)-envm-preS1-S2质粒包装的病毒有较好的肝细胞靶向性。 结论:包装的肝细胞靶向性好的重组逆转录病毒载体,为包装携带HDV核酶的病毒载体以及HDV核酶抑制乙型肝炎病毒复制表达的研究奠定了基础。  相似文献   

14.
目的:构建心脏阿霉素反应蛋白(CARP)基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素(ADR)心肌病中的作用及机制奠定基础。方法:将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA(shRNA)序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果:基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍(P=0.01),shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%(P=0.02)。结论:成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。  相似文献   

15.
目的构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro重组。重组质粒转化DH5α感受态细胞。菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序无误后,质粒共转染293FT细胞制备慢病毒。Real-time定量PCR法检测病毒滴度。Western blot检测TRADD-GFP-FLAG融合蛋白的表达。MTT法检测TRADD基因慢病毒对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。结果菌落PCR扩增产物经凝胶电泳,阳性克隆得到1 200 bp片段,基因测序显示重组质粒中TRADD序列与GenBank中序列一致。包装产生的慢病毒转染293 FT细胞48 h后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度为3.22×108IU/ml,Western blot检测到融合蛋白TRADD-GFP-FLAG在293FT细胞中获得有效表达,MTT法证实该融合蛋白具有生物活性,能有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖。结论成功构建并包装了pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro慢病毒表达载体,其可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。  相似文献   

16.
目的 构建表达小鼠动力蛋白激活蛋白1 (dynactin-1)特异性shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠足细胞dynactin-1的敲低效果.方法 针对小鼠dynactin-1 mRNA序列,设计合成3种shRNA,克隆到入门质粒pENTR/pTER中,再利用LR反应重组到pLenti X2 Puro慢病毒目的质粒,经过酶切测序鉴定后,将慢病毒质粒和包装质粒共转染293FT细胞,包装得到病毒颗粒.各组shRNA病毒载体转染小鼠足细胞后,用嘌呤霉素抗性筛选细胞,利用蛋白质印迹法检测各组细胞中dynactin-1蛋白的表达水平.结果 构建的各组shRNA入门质粒和慢病毒载体经酶切及测序鉴定正确;慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,制备病毒颗粒,转染小鼠足细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达shRNA的足细胞系;蛋白质印迹检测结果表明转染dynactin-1-shRNA组的dynactin-1蛋白表达降低.结论 构建的小鼠dynactin-1-shRNA慢病毒载体能有效降低小鼠足细胞中dynactin-1蛋白表达,为进一步研究dynactin-1在足细胞中的功能奠定了基础.  相似文献   

17.
目的:通过重组慢病毒感染,建立iRhom2及其突变基因的Vero细胞稳定细胞表达系,用于iRhom2的功能研究。方法:将iRhom2 及其突变基因克隆到慢病毒载体Lenti-OE-Flag,构建重组慢病毒载体Lenti-OE-iRhom2和Lenti-OE-iRhom2mut,将重组质粒瞬时转染HEK-293T包装细胞,获得重组慢病毒。将重组病毒感染Vero细胞,利用puromycin进行加压筛选,获得二者的重组表达细胞系。 结果:构建了iRhom2及其突变基因的逆转录病毒载体,并获得了重组逆转录病毒病毒,并利用该病毒获得了二者的稳定表达细胞系Western-blot实验证实,二者能够在Vero细胞内稳定表达。结论:利用重组逆转录病毒感染,成功获得了iRhom2及其突变系的Vero细胞稳定表达株,为进一步研究iRhom2的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。  相似文献   

18.
目的 构建mCD99L2(mouse CD99 antigen-like 2)基因RNA干扰慢病毒表达载体,检测其对293FT细胞的感染效率.方法 应用基因工程技术,首先设计并合成4对siRNA序列,退火、酶切并连接于慢病毒表达载体SD1259,构建携带针对目的 基因mCD99L2的siRNA慢病毒穿梭质粒表达载体(其中包括1条阴性对照序列);然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293FT细胞,转染48 h后收集上清离心过滤,浓缩病毒,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果 构建3个携带针对目的 基因mCD99L2的siRNA慢病毒穿梭质粒表达载体和1个阴性对照质粒,经测序鉴定正确;共转染293FT细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×107/ml,适合感染目的 细胞.结论 应用基因工程技术成功构建了mCD99L2基因RNA干扰慢病毒表达载体,为进一步构建类人霍奇金淋巴瘤可视化细胞模型及动物模型奠定了基础.  相似文献   

19.
shRNAmir慢病毒载体沉默鼻咽癌细胞中环氧合酶-2的表达   总被引:2,自引:1,他引:1  
目的 构建基于miR-155结构的shRNAmir慢病毒表达载体,在鼻咽癌细胞中沉默COX-2基因的表达,探索全新的COX-2抑制方法.方法 转染小干扰RNA(siRNA),筛选出沉默COX-2表达的RNA干扰序列,以该序列替换miR-155前体序列中的双链部分作为anti-COX-2 shRNAmir转录模板,构建pLVTHM/shRNAmir慢病毒质粒表达载体,利用293FT细胞包装pLVTHM/anti-COX-2 shRNAmir慢病毒.感染鼻咽癌C666-1细胞后,通过流式分选,建立anti-COX-2 shRNAmir稳定表达,COX-2基因沉默的亚系.结果 设计合成的anti-COX-2a siRNA能够使COX-2 mRNA表达下降90%以上,根据其序列构建的plVTHM/sbRNLAmir质粒载体测序无误,pLVTHM/anti-COX-2 shRNAmir慢病毒感染C666-1细胞后,分选出亚系C666-1经反复传代仍可保持COX-2基因沉默的表型.结论 pLVTHM/shRNAmir慢病毒载体能够转录出基于miR-155结构的shRNAmir,沉默鼻咽癌细胞COX-2的表达,为探索更加高效安全的COX-2抑制剂奠定基础,也为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新手段.  相似文献   

20.
目的 构建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤Mel-RM细胞增殖及迁移的影响.方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体pBS-hU6-1连接,将连接后的载体与FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,再用包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR法检测miR-149表达水平.同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力.结果 成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确.在荧光显微镜下观察到转染后的297T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010 TU/L.将病毒感染Mel-RM细胞显示可有效降低miR-149的表达水平(P<0.05).MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P<0.05).细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P <0.001).结论 成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移.并为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据.  相似文献   

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