整合素β1基因剔降血管内皮细胞株的建立及其增殖活力研究

目的 构建人整合素(integrin)β1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体(pGenesil-integrinβ1),建立integrin β1剔降血管内皮细胞株,观察integrin β1对EA.hy926细胞株增殖的影响.方法 合成integrin β1 siRNA模板,经退火后插入到pGenesil-1荧光载体.阳性重组质粒经DoTAP转染至EA.hy926细胞中.蛋白印迹观察pGenesil-integrinβ1表达载体对目的蛋白integrin β1 表达的抑制效率,绘制转染基因前后细胞生长曲线.结果 经酶切、测序验证,pGenesil-integrinβ1重组质粒构建成功.转染细胞后,可明显抑制integrin β1的表达.整合素β1基因剔降血管内皮细胞株细胞增殖减慢,与EA.hy926细胞株相比,生长曲线右移.结论 成功构建了pGenesil-integrin β1 重组质粒,建立了integrin β1下调细胞株,下调integrin β1表达对血管内皮细胞增殖产生负调控作用.     

重组慢病毒载体介导HIV-1 Nef蛋白对原发性渗出性淋巴瘤细胞系和血管内皮细胞增殖作用影响的初探

目的:构建含有HIV-1负调控因子(Nef)基因的重组慢病毒表达载体,并检测Nef蛋白在人胚肾293T细胞、体腔渗出性淋巴瘤细胞BCBL-1和人血管内皮细胞EA.hy926中的表达情况及其对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。方法:从本实验室已构建好的含Nef基因的重组真核表达质粒pCI-neo-Nef中扩增出Nef基因,插入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs-Green中构建成pHAGE-Nef,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达并收集培养上清,此上清经0.45μm滤器过滤后即获得慢病毒悬液。梯度稀释法测定慢病毒滴度。将重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.hy926细胞,用Western blot检测Nef蛋白的表达。通过细胞增殖实验检测Nef蛋白对BCBL-1和EA.hy926细胞增殖的影响。结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建了含HIV-1 Nef基因的重组慢病毒表达载体,病毒滴度为1×107 TU/ml。以重组慢病毒分别感染293T、BCBL-1和EA.h...     

DEPP蛋白对血管内皮细胞的存活及基因表达的影响

目的:探讨孕酮诱导的蜕膜蛋白(decidual protein induced by progesterone,DEPP)在血管内皮细胞EA.hy926中的定位?对细胞存活及基因表达的影响?方法:构建表达人DEPP的重组腺病毒,测定病毒滴度并鉴定其表达的DEPP蛋白水平?用构建好的腺病毒感染EA.hy926内皮细胞,通过免疫荧光和Western blot确定DEPP蛋白在细胞中的定位?观察DEPP过表达对EA.hy926细胞存活的影响,用MTT法测定细胞的存活率,通过流式细胞仪检测EA.hy926细胞的坏死和凋亡情况?利用蛋白质芯片检测DEPP过表达时内皮细胞中血管发生相关基因表达水平的变化?结果:本研究成功构建了表达人DEPP蛋白的重组腺病毒?通过免疫荧光检测,发现DEPP蛋白呈全细胞分布?与过表达GFP的对照细胞相比,过表达DEPP时EA.hy926细胞明显皱缩?变圆,MTT检测显示细胞的存活率明显下降,流式细胞仪检测显示EA.hy926细胞感染腺病毒后细胞的坏死水平与对照组相比升高?蛋白质芯片检测发现,DEPP过表达导致内皮细胞中多种血管发生相关蛋白的水平发生明显改变?结论:DEPP蛋白的表达升高对血管内皮细胞有损伤作用,可能参与血管发生的调控过程?     

ZNF580过表达对内皮细胞血管内皮生长因子的表达及增殖能力的影响

【目的】研究人锌指蛋白新基因ZNF580过表达对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及增殖能力的变化,为探讨ZNF580基因功能提供科学依据。【方法】重组质粒pEGFP-ZNF580经LipofectamineTM2000脂质体转染法转染EA.hy926细胞,48h后荧光显微镜下观察ZNF580-EGFP在内皮细胞中的表达情况;应用半定量RT-PCR、Western blotting及ELISE法检测转染前后内皮细胞ZNF580和VEGFmRNA、蛋白表达的变化;运用MTT实验检测转染前后内皮细胞增殖能力的改变。【结果】荧光显微镜下示融合蛋白ZNF580-EGFP在EA.hy926细胞核中表达;ZNF580基因过表达后,内皮细胞VEGFmRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05),且其增殖能力显著升高(P<0.01)。【结论】ZNF580可以调控EA.hy926细胞VEGF的表达,且ZNF580在内皮细胞增殖过程中具有重要的调节作用。     

RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞系的建立

目的：构建RHBDF2基因过表达慢病毒载体,建立稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞,为RHBDF2基因过表达慢病毒载体的构建和稳定表达RHBDF2细胞的建立提供依据。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成引物,PCR扩增RHBDF2基因后通过Gateway克隆技术将目的基因克隆至入门载体,再亚克隆至慢病毒载体pLV[Exp]-EGFP,构建重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2;将慢病毒表达载体质粒pLV[Exp]-EGFP和重组慢病毒质粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2分别与慢病毒辅助包装质粒共转染HEK293T细胞,包装慢病毒并测定慢病毒滴度;将感染pLV[Exp]-EGFP-control的EA.hy926细胞作为对照组,感染pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2的EA.hy926细胞作为实验组,利用嘌呤霉素筛选出稳定表达RHBDF2的EA.hy926细胞;荧光定量PCR （qPCR）和Western blotting法检测对照组和实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切电泳和测序检测,实验组过表达慢病毒载体的基因序列与设计合成的序列完全一致;对照组包装的慢病毒滴度为1×10⁸ TU·mL^-1,实验组慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1;荧光显微镜下慢病毒成功感染EA.hy926细胞,感染率达95%以上;qPCR检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2 mRNA表达水平较对照组明显升高（P<0.01）;Western blotting法检测,实验组EA.hy926细胞中RHBDF2蛋白表达水平较对照组明显升高（P<0.05）。结论：成功构建RHBDF2过表达慢病毒载体,利用pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒建立了稳定上调RHBDF2表达的EA.hy926细胞系。     

含KSHV vIL-6基因重组分泌型表达载体的构建及其分泌蛋白对内皮细胞增殖和血管生成能力影响的初探

目的:构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-assoliated herpesvirus,KSHV)致瘤基因vIL-6的重组分泌型质粒.将其导入内皮细胞系EA.hy926中进行表达,并检测vIL-6对内皮细胞增殖和血管生成作用的影响.方法:根据本实验室先前构建的pvIL-6 F表达载体中的核酸...     

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。     

miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达

目的：构建微小RNA-186（miR-186）基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法：化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR （qPCR）法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平。结果：测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致。在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。FV040-control包装的慢病毒滴度为2×10⁸ TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×10⁸ TU·mL^-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95%;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低（P<0.01）。结论：成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株。     

bcl-2在氧化低密度脂蛋白诱导人血管内皮细胞凋亡中的作用

目的 观察氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)对人血管内皮细胞株EA.hy926凋亡的影响,并探讨bcl-2在其中的作用.方法 MTT法检测不同浓度的oxLDL(50、100、150、200 oe/m1)对细胞增殖能力的影响;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测不同浓度的oxLDL对细胞凋亡的影响;RT-PCR、Western blot和免疫荧光细胞化学法分别检测不同浓度的oxLDL对bcl-2 mRNA、蛋白表达及在细胞内表达的影响.结果 oxLDL对EA.hy926细胞形态有明显影响,并能明显抑制EA.hy926细胞增殖能力,抑制作用随处理浓度增加而增大,半数抑制浓度(IC50)约为100ug/ml;不同浓度的oxLDL处理细胞24 h后,与对照组比较,早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡细胞百分比均显著增加(P<0.05);oxLDL能够明显抑制细胞内bel-2 mRNA、蛋白表达及在细胞内的表达水平.结论 6cl-2基因在oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡中发挥重要作用,oxLDL可能通过下调bcl-2的表达促进血管内皮细胞凋亡.     

NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的 构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组慢病毒载体,转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3(HCCLM3),观察其转染效率及表达情况.方法 采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列(IRES)-EGFP中,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLemi6.3-NK4-IRES-EGFP共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度.以不同感染复数(MOI)的重组慢病毒感染293T细胞,筛选最适MOI,以最适MOI重组慢病毒感染HCCLM3细胞,观察转染效率.Western blot法测定细胞中NK4蛋白表达水平.结果 成功构建共表达NK4基因和EGFP基因的慢病毒载体pLenti6.3 -NK4 -IRES-EGFP,并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108 TU/mL.重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI为7.转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达,而未转染细胞中无NK4蛋白的表达.结论 成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体,有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白.     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

益气消癥法中药含药血清对人脐静脉内皮细胞株细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的:观察益气消癥法中药含药血清对人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)增殖、迁移及凋亡的影响,了解其抑制子宫肌瘤血管生成的途径。方法:将体外培养的EA.hy926细胞,分为正常组、E2组、E2加ICI组、E2加中药高、中、低剂量组,采用MTT法、划痕法、流式细胞术检测细胞的增殖、迁移及凋亡率。结果:益气消癥法中药对经E2处理的EA.hy926细胞增殖和迁移具有抑制作用、对其凋亡具有促进作用,与E2组比较有显著差异(P<0.01),作用效果呈剂量相关性。结论:雌激素可促进EA.hy926细胞的增殖迁移,抑制其凋亡;益气消癥法中药能够抑制雌激素介导的EA.hy926细胞的增殖和迁移,促进其凋亡,干预血管生成是其治疗子宫肌瘤的作用机制之一。     

丹参酮ⅡA磺酸钠对PM2.5染毒血管内皮细胞的保护作用

目的 观察丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对PM2.5引起的血管内皮细胞EA.hy926损伤的保护作用.方法 取对数生长期EA.hy926细胞分为对照组、100 μg/mL PM2.5组及STS干预组(先给予12.5、25、50 μg/mL STS干预后再加入100 μg/mL PM2.5).24 h后CCK8法测定细胞的存活率,荧光标记法检测细胞内氧自由基生成情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测凋亡蛋白酶Caspase-9和Caspase-3的表达变化.结果 PM2.5对EA.hy926细胞有明显的毒性,可以导致细胞内氧自由基生成增多,并引起Caspase-9和Caspase-3活化造成细胞凋亡,与对照组比较差异有统计学意义;STS可以抑制PM2.5对EA.hy926细胞的毒性,降低胞内活性氧(ROS)生成及Caspase-9和Caspase-3的活化,减少细胞凋亡数目,与PM2.5组比较差异有统计学意义.结论 丹参酮ⅡA磺酸钠可以减少PM2.5引起的血管内皮细胞凋亡,其保护作用可能与抑制氧自由基生成有关.     

稳定表达人GM-CSF和IL-4 EA.hy926细胞株建立及对DC诱导作用

目的获得分别能稳定表达人白细胞介素4(IL-4)和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的内皮细胞株,并用于树突状细胞(DC)的体外诱导培养。方法构建重组的慢病毒表达载体,在293T细胞中进行慢病毒的包装,用获得的高滴度的慢病毒感染内皮细胞EA.hy926细胞株,建立能够高效、稳定表达IL-4和GM-CSF的EA.hy926细胞株。结果 EA.hy926细胞株感染效率达90%以上,长期传代仍能保持较高阳性率。RT-PCR在mRNA水平上检测目的基因有表达;ELISA和Western方法证实感染后细胞IL-4、GM-CSF在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的80倍和143倍。感染后细胞的生长状态良好,能够长期在体外进行传代培养,可以用于DC诱导实验。结论构建的细胞系可以稳定表达细胞因子IL-4和GM-CSF。     

聚桂醇体外杀伤人脐静脉内皮细胞的实验研究

目的 探讨聚桂醇对体外人脐静脉内皮细胞的杀伤作用.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞融合细胞株EA.hy926,采用CCK8检测不同浓度的聚桂醇对EA.hy926细胞株的杀伤率.结果 不同浓度的聚桂醇对EA.hy926细胞均具有显著杀伤作用,且药物浓度与细胞杀伤率呈正相关.其杀伤率为50%及90%时的药物浓度分别为32 μg/ml 和521 μg/ml.结论 聚桂醇注射液对EA.hy926细胞具有明显杀伤作用且药物浓度与细胞杀伤率呈正相关.     

含人SOX18基因真核表达载体的构建及其重组蛋白诱导血管内皮细胞增殖的研究

目的：构建含人SOX（SRY related high mobility group box）18的重组表达质粒,并研究其对血管内皮细胞增殖能力的影响。方法：通过RT?PCR技术从血管内皮细胞中扩增SOX18编码基因序列,将其插入真核表达载体pSecTag?2B构建重组表达质粒pST?SOX18,分别转染人胚肾上皮细胞HEK293T和血管内皮细胞,通过免疫印迹技术检测SOX18的蛋白表达情况;进一步通过CCK?8实验检测SOX18对血管内皮细胞增殖能力的影响。结果：成功构建重组质粒pST?SOX18,重组蛋白能够在HEK293T和血管内皮细胞中表达;SOX18的过表达促使血管内皮细胞合成血管内皮生长因子（VEGF）,促进血管内皮细胞增殖。结论：SOX18重组蛋白能够促进血管内皮细胞增殖。     

平阳霉素对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的作用及其机制

目的:观察平阳霉素(PYM)对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的作用及可能机制。方法:采用甲基三氯硅烷(MTS)比色法检测PYM对EA.hy926细胞体外生长的作用;流式细胞术测定PYM作用细胞24h后细胞凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达、线粒体膜电位的变化;免疫印迹(Western-blot)法检测PYM对EA.hy926细胞中Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平的影响。结果:PYM可明显抑制EA.hy926细胞的增殖,且生长抑制率具有浓度时间依赖性;流式细胞术检测结果显示PYM各浓度作用24h后,细胞凋亡百分率随药物浓度增加而增高,活化Caspase-3表达在PYM各浓度组均增强,线粒体膜电位在各浓度组均下降;Western-blot法检测结果显示PYM作用EA.hy926细胞后,Caspase-8、Caspase-9蛋白均可出现明显的剪切带。结论:PYM能抑制EA.hy926细胞的增殖,这种抑制作用是可通过诱导细胞凋亡实现的,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9参与了PYM诱导EA.hy926细胞凋亡的过程。     

HHV-8 K13基因编码蛋白在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞系中的表达及其对细胞增殖影响的初探

目的:研究人类疱疹病毒8型(HHV-8)K13(v-FLIP)基因编码蛋白分别在人血管内皮细胞和前列腺癌细胞中的表达及其对上述两种细胞增殖能力的影响.方法:将PEF-K13-Flag-IRES/Pure重组质粒瞬时转染人血管内皮细胞系EA.HY926细胞和前列腺癌细胞系PC-3细胞,采用Western blot方法检测...     

人参皂苷Rg3和PEG-PLGA-Rg3纳米微粒对人血管内皮细胞侵袭和微管形成能力的影响

目的 观察人参皂苷Rg3(Rg3)和PEG-PLGA-Rg3纳米缓释微粒(Rg3-N)在体外对人血管内皮细胞侵袭和微管形成能力的影响,并比较两者之间的差异.方法 选用EA.hy926人血管内皮细胞株,通过transwell法、tube formation法观察Rg3和Rg3-N对其侵袭和微管形成能力的影响,比较两者作用的差异,并通过实时定量PCR法、Western blot法检测E-钙黏素(E-cad)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)等相关基因和蛋白表达来探索其内在分子机制.结果 Rg3和Rg3-N处理可使EA.hy926细胞的侵袭能力和微管形成能力显著下降(P ＜0.05);Rg3和Rg3-N处理后VEGF的蛋白和基因表达未受明显影响,MMP-9和E-cad的表达显著降低,各组均未检测到HIF-1α蛋白的表达.结论 Rg3和Rg3-N可抑制内皮细胞的侵袭能力和微管形成能力,这些作用可能是通过抑制E-cad和MMP-9的表达来实现的;PEG-PLGA纳米载体包埋Rg3能提高其在体外抗EA.hy926细胞侵袭和微管形成的能力.     

基于斑马鱼和EA.hy926细胞模型评价活血化瘀方的促血管新生作用

目的:评价活血化瘀方(SE)的促血管新生作用,并探讨其可能的作用机制。方法:选择转基因斑马鱼幼鱼及内皮细胞系EA.hy926细胞株为模型,按空白对照组、模型组、活血化瘀方不同剂量组进行分组和给药干预。在荧光显微镜下观察正常斑马鱼胚胎培养液中空白对照组及活血化瘀方组肠下静脉血管(SIVs)的生长状况;用VEGF受体抑制剂(VRI)诱导斑马鱼血管损伤,观察各组斑马鱼节间血管(ISVs)生长情况;采用VRI抑制内皮细胞系EA.hy926增殖模型,用MTT法评价活血化瘀方各组对细胞增殖的促进作用;用Real-time PCR法,检测各组斑马鱼体内血管内皮生长因子受体(VEGFR)基因(flt1、kdr、kdrl)的表达情况。结果:在正常斑马鱼模型上,活血化瘀方可明显促进斑马鱼SIVs出芽;在VRI诱导的斑马鱼血管损伤模型上,活血化瘀方各剂量组能够明显抑制斑马鱼ISVs的损伤,其血管生长指数与模型组比较差异均有统计学意义(P0.001);在EA.hy926细胞模型上,活血化瘀方各剂量组可明显促进内皮细胞的增殖。Real-time PCR结果表明,模型组VRI显著抑制了斑马鱼体内VEGF受体基因flt1、kdr、kdrl的表达,而活血化瘀方各剂量组的表达量均明显增高,并呈现一定的剂量依赖关系。结论:活血化瘀方在内皮细胞模型、正常斑马鱼模型和VRI诱导的斑马鱼血管损伤模型上均具有促血管新生作用,其机制可能与其上调VEGF受体flt1、kdr、kdrl基因的表达有关。