ADAM17-shRNA 对MCF-7 乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用研究

目的 观察转染解聚素- 金属蛋白酶17- 短发夹RNA（ADAM17-shRNA）的MCF-7 乳腺癌 细胞在裸鼠体内的生长效果并探索其作用机制。方法 将30 只裸鼠随机分为转染组（接种转染ADAM17- shRNA 的MCF-7 乳腺癌细胞）、空载体组（接种转染shNC 的MCF-7 乳腺癌细胞）及对照组（接种正常 MCF-7 细胞）。分别在各组裸鼠右侧鼷部皮下种植细胞悬液0.2 ml/ 只,观察各组荷瘤裸鼠的生长状态、饮 食及体重变化。第28 天处死裸鼠并取出移植瘤。采用HE 染色观察组织学形态;Western blot 检测肿瘤局 部ADAM17、磷酸化表皮细胞生长因子受体(p-EGFR)、表皮细胞生长因子受体(EGFR)、磷酸化的蛋白激 酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK) 及细胞外调节蛋白激酶(ERK) 的 表达。结果 对照组、空载体组及转染组移植瘤最终体积分别为（639.821±15.429）、（643.350±15.543） 和（240.233±10.536）mm3,3 组不同时间点瘤体体积比较有差异（P <0.05）;不同组别瘤体体积比较有差 异（P <0.05）。HE 染色结果显示,移植瘤组织呈乳腺浸润性导管癌特征,对照组与空载体组无明显差异,转 染组较对照组、空载体组坏死多。转染组肿瘤组织中ADAM17、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK 及 p-ERK 的蛋白表达水平低于对照组和空载体组（P <0.05）。结论 ADAM17-shRNA 可有效抑制MCF-7 乳 腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长。EGFR-PI3K-Akt 和EGFR-MEK-ERK 信号传导通路参与ADAM17-shRNA 的抑制作用。     

Survivin-shRNA 对A431 皮肤鳞状细胞癌 抑制作用的实验研究

目的 观察Survivin-shRNA 对A431 皮肤鳞状细胞癌的作用效果，探讨核因子κB（NF-κB）在 Survivin-shRNA 对皮肤鳞状细胞癌（SCC）抑制作用中的分子生物学机制。方法 构建Survivin-shRNA 腺病 毒载体，筛选最佳干扰序列。将培养好的A431 细胞混悬液皮下接种于裸鼠，复制A431 裸鼠移植瘤模型，随机 分为空白对照组、阴性对照组、Survivin-shRNA 转染组和Res 阳性对照组，每组5 只，瘤内注射相应试剂，第 20 天处死所有裸鼠，取瘤组织分别测量瘤体积、瘤重，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率；HE 染色观察细胞形 态；TUNEL 检测细胞凋亡情况；Western blot 法测定Survivin、IκB、P65、P53、Caspase-3 蛋白的表达。结果 Survivin-shRNA 转染组或Res 阳性对照组的裸鼠移植瘤，瘤体积及瘤重降低，与空白对照组及阴性对照组比 较差异有统计学意义（P <0.05）；TUNEL 检测结果示Survivin-shRNA 转染组、Res 阳性对照组的裸鼠移植瘤， 细胞凋亡率增高，与空白对照组及阴性对照组比较差异有统计学意义（P <0.05）；Survivin-shRNA 转染组及 Res 阳性对照组可见肿瘤细胞较少，分布稀疏，有变性的液化坏死灶，癌细胞皱缩变圆，胞核固缩；SurvivinshRNA 转染组或Res 阳性对照组裸鼠移植瘤，Survivin、P65 蛋白的表达均降低，与空白组对照组及阴性对照组 比较，差异有统计学意义（P <0.05），IκB、P53、Caspase-3 蛋白表达增高，与空白对照组及阴性对照组比较， 差异有统计学意义（P <0.05）。结论 Survivin-shRNA 可以抑制皮肤鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的生长，其机制 之一可能是通过抑制NF-κB 信号通路，活化抑癌基因P 53，进而促进肿瘤细胞凋亡，抑制SCC 移植瘤的生长。     

PAX2稳转细胞系构建及对细胞迁移和侵袭能力的作用研究

目的 探讨PAX2稳转细胞系构建及生物学作用。方法 选择处于对数生长期大鼠肾小管上皮细胞,实验分为稳转组、空载组、对照组。稳转组采用阳离子脂质体转导将pEGFP-PAX2转入大鼠肾小管上皮细胞,空载组采用同样方法配置空载质粒转染溶液,对照组不添加质粒转染溶液。经G418筛选,建立稳定转染细胞系。通过细胞划痕实验及Transwell实验检测PAX2稳转细胞系的细胞迁移率及细胞侵袭作用。结果 应用G418筛选14 d,稳转组大鼠肾小管上皮细胞有明显克隆长出,建立PAX2基因稳定转染肾小管上皮细胞系。稳转组在荧光显微镜下可见绿色荧光,基因融合表达获得成功。稳转组细胞PAX2条带密度与β-action吸光度比值为（1.00±0.04）,空载组为（0.83±0.03）,对照组为（0.85±0.04）,3组吸光度比值比较,差异有统计学意义（F=398.7,P＜0.05）;其中稳转组吸光度比值高于空载组和对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。细胞划痕后18 h,对照组、空载组和稳转组细胞迁移率分别为（39.34±5.34）%、（40.56±7.54）%和（83.72±7.12）%,3组细胞迁移率比较,差异有统计学意义（F=431.8,P＜0.05）;其中稳转组细胞迁移率高于对照组和空载组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。各组细胞培养48 h后,对照组、空载组和稳转组迁移细胞分别为（23.33±3.63）、（22.00±8.14）、（45.67±7.14）,3组迁移细胞数比较,差异有统计学意义（F=248.5,P＜0.05）;其中稳转组迁移细胞数高于对照组和空载组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 pEGFP-PAX2质粒成功转染大鼠肾小管上皮细胞,并成功筛选出高效稳定表达PAX2的稳转细胞系。PAX2稳转增加了肾小管上皮细胞的迁移及侵袭能力。     

POFUT1对人胃腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的抑制作用

目的探讨POFUT1对人胃腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的影响及其作用机制。方法制备人胃腺癌BGC823的POFUT1慢病毒低表达及对照组、过表达及对照组细胞模型,分别命名为shRNA-POFUT1-BGC82组、shRNA control-BGC823组、PLV-POFUT1-BGC823组及PLV control-BGC823组。采用皮下成瘤的方法,分别用这4组细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型（每组5只）,观察和测算肿瘤体积。30d后处死裸鼠并取瘤,采用免疫组化方法检测裸鼠瘤组织中VEGF和CD31的表达;Western印迹法检测裸鼠瘤组织中POFUT1和VEGF的表达。结果20只裸鼠全部成瘤,实验过程无死亡。与PLV control组相比,PLV-POFUT1组裸鼠肿瘤体积显著增加（P<0.05）;shRNA-POFUT1较shRNA control组裸鼠肿瘤体积明显偏小（P<0.05）。免疫组化结果显示,与PLV contro1组相比,PLV-POFUT1组瘤组织中VEGF和CD31表达显著增高（P<0.05）;与shRNA control组相比,shRNA-POFUT1组则明显降低(P<0.05)。与shRNA control组相比,shRNA-POFUT1组POFUT1和VEGF蛋白表达水平均显著下调;PLV-POFUT1组较PLV contro1组,其POFUT1和VEGF蛋白水平均显著增强（P<0.05）。结论过表达POFUT1可以显著促进裸鼠移植瘤的增殖和肿瘤微血管形成,低表达POFUT1可抑制裸鼠移植瘤的增殖和肿瘤微血管形成,表明POFUT1在人胃 腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成中起着重要的作用,其机制可能与VEGF密切相关。     

联合转染Survivin和Bcl-2反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用

目的探讨联合转染Survivin和Bcl-2反义寡核苷酸（AsODN）对裸鼠胆囊癌生长抑制作用。方法建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型,选择36只裸鼠随机分为3组：对照组、正义寡核苷酸（sODN）组和AsODN组,裸鼠瘤体内分别注射PBS、Survivin和Bcl-2sODN、Survivin和Bcl-2AsODN,12d后处死裸鼠,测量瘤体体积及质量,计算抑瘤率;苏木精-伊红染色观察瘤体组织学变化;免疫组织化学方法检测Survivin及Bcl-2蛋白的表达。结果AsODN组裸鼠瘤体平均体积显著低于对照组、sODN组（F=24.469,q=8.802、7.569,P〈0.01）,其体积抑瘤率为55.53%,sODN组为9.90%;AsODN组裸鼠瘤体平均质量显著低于对照组、sODN组（F=25.376,q=3.168、20.737,P〈0.01）,其质量抑瘤率为56.24%,sODN组为8.47%。AsODN组瘤体中可见大量的凋亡细胞。免疫组化证实AsODN组Survivin表达明显降低,同sODN组相比差异有显著意义（F=15.103,q=5.883、7.191,P〈0.01）;Bcl-2表达亦明显降低,同sODN组相比差异有显著性（F=6.632,q=4.793、4.030,P〈0.05）。结论联合转染Survivin和Bcl-2AsODN可下调Survivin和Bcl-2表达,诱发细胞凋亡,从而抑制裸鼠胆囊癌种植瘤的生长。     

RNAi沉默Survivin基因抑制人鼻咽癌细胞生长

目的观察RNA干扰沉默Survivin基因对人鼻咽癌CNE2细胞在体内外生长的抑制作用。方法将Survivin特异性shRNA表达载体pGenesil-1-survivin经Lipofectamine。”2000介导转染人鼻咽癌CNE2细胞,经G418筛选获得稳定转染的CNE2细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞转染效率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot分别检测Survivin基因mRNA和蛋白表达水平;噻唑蓝（MTF）法检测细胞增殖能力的变化。以稳定转染细胞建立裸鼠荷瘤模型,观测瘤体积的变化,绘制移植瘤生长曲线。结果流式细胞仪检测pGenesil-1-survivin细胞转染百分率为（87．13±2．21）％;RT．PCR和Westernblot结果显示,pGenesil-1-survivin组对人鼻咽癌CNE2细胞SurvivinmRNA和蛋白的抑制率分别为64．55％和51．24％,均较随机序列构建载体的阴性对照（pGenesil-1-NC）组和空白对照组明显下调（均P〈0．05）;MTT结果显示,pGenesil-1-survivin组细胞增殖能力明显较pGenesil-1-NC组和空白对照组降低（均P〈0．05）;体内实验表明,pGenesil-1-survivin组较pGenesil-1-NC组和空白对照组能有效抑制BALB／C裸鼠人鼻咽癌的生长（均P〈0．05）。结论沉默Survivin基因可以有效抑制人鼻咽癌CNE2细胞在体内外的增殖,Survivin基因有望成为鼻咽癌基因治疗的有效靶点。     

非小细胞肺癌中FHIT蛋白的表达及其与Survivin和Ezrin蛋白表达的关系

目的：研究FHIT蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其与Survivin和Ezrin蛋白表达的关系,探讨其在NSCLC病变中的作用及其临床意义。方法：应用组织芯片技术结合免疫组化法检测60例NSCLC组织、54例肺良性病变组织中FHIT、Survivin和Ezrin蛋白的表达。结果：FHIT蛋白在NSCLC中的阳性表达率为51.7%（31/60）,显著低于肺良性病变的87.0%（47/54）（P〈0.01）;FHIT的表达与性别、淋巴结转移及组织学类型相关（P〈0.05）,与患者的年龄、肿瘤大小、临床分期、肿瘤细胞的分化程度无关（P〉0.05）;NSCLC组织中FHIT表达与Survivin和Ezrin表达呈显著负相关（r=-0.636,P〈0.01;r=-0.714,P〈0.01）,而Survivin和Ezrin表达无相关关系（r=0.157,P〉0.05）。结论：NSCLC中FHIT失表达,Survivin和Ezrin高表达,FHIT、Survivin和Ezrin在NSCLC的发生、发展中相互作用,联合检测FHIT、Survivin和Ezrin的表达有助于判断肺癌的预后。     

TNF—α对鼻咽癌放射增敏的体内实验研究

目的探讨TNF—α对鼻咽癌放射敏感性的影响。方法裸鼠体内移植瘤实验观察CNE-2Z、H5、S1放射后的体内增殖能力,采用HE染色观察各组裸鼠移植瘤组织坏死程度、核分裂指数、肺转移率和淋巴结转移率,免疫组织化学染色和图像分析法检测不同方法处理的s1裸鼠移植瘤组织中Caspase-3和Survivin的表达。结果鼻咽癌细胞CNE-2Z存在放射敏感性异质性,S1细胞是具有放射抵抗潜能的亚克隆株。TNF-α联合放射治疗对s1裸鼠移植瘤生长有明显抑制作用（P〈0．01）,TNF—α联合放射治疗组中瘤组织坏死程度、核分裂指数、肺转移率和淋巴结转移率与生理盐水联合放射治疗组比无明显差异（P〉0．05）。TNF—α联合放射治疗组S1裸鼠体内移植瘤细胞核中Caspase-3表达高于单独TNF—α处理组（P〈0．05）;各组S1裸鼠移植瘤细胞浆中Caspase-3及Survivin的表达无明显差异（P〉0．05）。结论TNF—α联合放射治疗可能通过影响胞核中Caspase-3表达抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长。     

短发夹RNA沉默hTERT基因抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的实验研究

目的研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹RNA（shRNA）对裸鼠人脑胶质瘤中hTERT基因表达的抑制作用,以及影响肿瘤增殖并诱导细胞凋亡的作用,为脑胶质瘤的基因治疗探讨新的依据。方法体外培养人脑胶质瘤U251细胞株,建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型。将成功造模的36只裸鼠随机分为3组（每组12只）。hTERT shRNA组肿瘤体内原位注射hTERT质粒shRNA（pshRNA）20μg＋脂质体60μl＋PBS;PBS组肿瘤体内原位注射PBS 150μl;空质粒组肿瘤体内原位注射空质粒20μg＋脂质体60μl＋PBS。观察肿瘤生长情况。苏木精-伊红染色观察肿瘤组织的病理改变,Western blot检测hTERT蛋白的表达,钙依赖性磷脂结合蛋白V＋碘化丙啶双染流式细胞仪测凋亡率。结果成功建立稳定的裸鼠U251细胞皮下移植瘤模型。治疗5周后hTERT shRNA组肿瘤体积较PBS组和空质粒组明显缩小,抑瘤率为58.2%;病理学检查hTERT shRNA组肿瘤生长受到抑制,肿瘤细胞散在稀疏,可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡;Western blot示hTERT shRNA组hTERT蛋白表达受抑制;流式细胞仪检测hTERT shRNA组肿瘤细胞凋亡率明显高于PBS组和空质粒组（P〈0.01）。结论hTERT shRNA可在裸鼠移植瘤体内有效发挥作用,抑制人端粒酶逆转录酶蛋白在体内表达,从而能有效抑制裸鼠胶质瘤增殖生长,促进肿瘤细胞凋亡。     

HOXA4调控Wnt/β-cateni n信号通路对裸鼠移植胶质瘤的抑制作用

目的：建立人胶质瘤荷瘤裸鼠模型,探讨HOXA4对胶质瘤U251细胞体内生长的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及其机制。方法：采用慢病毒转染,建立胶质瘤U251细胞稳转同源异型盒基因A4（HOXA4） siRNA细胞系（si-HOXA4）和稳转空载体阴性对照U251细胞系（si-NC）。取对数生长期U251、si-NC和si-HOXA4细胞接种于BALB/c裸鼠颈背部皮下,建立荷瘤裸鼠模型,命名为对照组、si-NC组和si-HOXA4组。观察各组裸鼠成瘤情况并绘制肿瘤生长曲线;培养21 d处死裸鼠后剥离肿瘤组织,测量肿瘤体积和质量;qRT-PCR法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、CTNNB1和Gsk3β mRNA相对表达量;免疫组织化学（IHC）法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、β-catenin、Gsk3β、CyclinD1和P53蛋白表达水平。结果：si-HOXA4组裸鼠肿瘤体积和质量小于si-NC组和对照组（P<0.05）;si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中HOXA4 mRNA相对表达量和HOXA4蛋白表达水平低于其他2组（P<0.05）;与si-NC组和对照组比较,si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中CTNNB1 mRNA相对表达量降低（P<0.05）,β-catenin和CyclinD1蛋白表达水平亦降低（P<0.05）,但Gsk3β和P53蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：抑制人胶质瘤U251细胞HOXA4表达可在体内通过Wnt/β-catenin信号通路调控CyclinD1和P53蛋白的表达,从而抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长。     

靶向Notch1基因的siRNA对裸鼠人肝细胞癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Notch1基因在人肝细胞癌HepG2细胞裸鼠移植瘤中的作用。方法于裸鼠腋下接种0.2×108/mL的HepG2细胞悬液,建立人肝细胞癌裸鼠移植瘤模型,将其分为3组:未处理组(接种PBS悬浮的未转染细胞)、空载体转染组(接种空载体转染的细胞)和Notch1转染组(接种靶向Notch1基因的siRNA转染的细胞)。连续2周观察转染荷瘤裸鼠的生长情况,采用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)研究肿瘤组织中的细胞凋亡,利用R T-PCR和蛋白质印迹技术检测肿瘤组织中Notch1、bcl-2和bax mR NA和蛋白的表达。结果 Notch1 siRNA转染组中肿瘤的生长明显受到抑制,其肿瘤的重量为(0.685±0.138)g,显著低于未处理组(2.896±0.513)g和空载体转染组(2.776±0.623)g(F=29.672,均P<0.01)。TUNEL结果表明,Notch1 siR NA转染组每500个细胞中凋亡的细胞数为(91±3),明显高于未处理组(10±3)和空载体转染组(11±2)中细胞凋亡的数目(P<0.05);此外,RT-PCR和Western印迹结果表明Notch1 siRNA转染组中裸鼠肿瘤组织Notch1和bcl-2 mRNA和蛋白表达均显著下降,而bax的表达显著上升,3组间比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论降低Notch1基因的表达能抑制人肝细胞癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生长,诱导HepG2细胞凋亡,后者可能与bax表达的上升和bcl-2表达的下调相关。     

膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立

目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础.方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3),分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F.稳转后用含400 μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较.结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好.pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.318 6 vs 0.798 7,0.824 3,P<0.05),而后二者间无统计学差异.结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础.     

丙型肝炎病毒NS4B调控肝细胞凋亡的相关机制研究

目的：研究HCV—NS4B对肝细胞Caspase-3及Survivin表达的影响,探讨HCV—NS4B对肝细胞凋亡的影响及相关机制。方法：通过转染丙型肝炎病毒非结构蛋白4B（HCV—NS4B）至L02肝细胞中,设置三组细胞（空白对照组、空白载体PCXN2组、PCXN2-NS4B组）,利用流式细胞仪检测各组Caspase-3的表达情况,免疫组化方法观察三组中Survivin的表达情况。结果：PcxN2-Ns4B转染入LO2细胞并有稳定表达,流式细胞术检测各组Caspase-3的表达情况：空白对照组、转染PCXN2组及PCXN2-NS4B组均有Caspase-3表达,分别为：（23．45±1．57）％、（23．17±1．79）％及（4．34±0．59）％,空白对照组、转染PCXN2两组差异无统计学意义（P〉0．05）,而空白对照组、转染PCXN2组与PCXN2-NS4B组间比较差异有统计学意义（P〈0．01）。免疫组化方法检测Survivin的表达情况：空白对照组阳性表达率为25％,PCXN2组表达率为16．67％,PCXN2-NS4B组表达率为75％,空白对照组、转染PCXN2两组差异无统计学意义（P〉0．05）,而空白对照组、转染PCXN2组与PCXN2-NS4B组间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：①NS4B转染入肝细胞后有稳定表达;②NS4B可抑制Caspase-3表达、促进Survjvin的表达;③HCV～NS4B可能抑制Caspase-3表达、促进Survivin的表达而抑制肝细胞凋亡。     

ZIC1基因转染联合姜黄素对人乳腺癌细胞生物学行为的影响

［摘要］目的: 探讨ZIC1基因转染联合姜黄素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法: 将慢病毒载体pLV Zic1 PGK Puro稳定转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过蛋白质印迹法检测转染后MDA-MB-231细胞ZIC1蛋白的表达水平。通过MTT法检测抑制率在50％左右的姜黄素浓度,并作为后续实验的标准加药浓度。以ZIC1空载不加姜黄素为对照组,空载加姜黄素、转染不加姜黄素及转染加姜黄素为实验组,以MTT法检测ZIC1、姜黄素及ZIC1联合姜黄素对MDA-MB-231细胞黏附的影响;用划痕实验检测各组细胞的迁移能力;用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。结果： 乳腺癌细胞转染ZIC1质粒后,ZIC1蛋白呈阳性表达,而转染空载体细胞中ZIC1蛋白表达阴性。细胞增殖抑制率在50％左右的姜黄素浓度为5 mg/L,以此作为标准加药浓度。与对照组比较,转染组、姜黄素组及转染联合姜黄素组乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖受到明显抑制,凋亡率明显增高(均P＜0.05)。其中,ZIC1转染联合姜黄素对细胞增殖的抑制及凋亡诱导作用更明显(P＜0.05)。结论： ZIC1基因与姜黄素对乳腺癌的抑制存在协同作用。     

Bcl-2短发夹状RNA增强甲氨喋呤对人淋巴瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:观察Bcl-2短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)与甲氨喋呤(methotrexate,MTX)联用后对人淋巴瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:45只裸鼠注射Raji细胞悬液制备裸鼠人淋巴瘤模型,将聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)与Bcl-2 shRNA载体质粒(本实验室制备)的混合物及MTX直接注入肿瘤内,观察Bcl-2 shRNA及联合MTX对肿瘤生长的影响。在用药21 d后无痛处死动物,分离皮下肿瘤,称重,计算抑瘤率;H-E染色观察肿瘤组织的病理形态;以RT-PCR法检测Bcl-2 mRNA在肿瘤内的表达情况。结果:Bcl-2 shRNA与MTX联用组移植瘤的生长最慢,与单用Bcl-2 shRNA和MTX相比差异有统计学意义(P<0.05)。处理结束后剥离瘤块,Bcl-2 shRNA组瘤质量与阴性shRNA组、空质粒组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Bcl-2 shRNA与MTX联用对裸鼠移植瘤生长的抑制率最高,高于Bcl-2 shRNA和MTX的单用组(P<0.05)。H-E染色可见使用Bcl-2 shRNA组及MTX组出现明显的凋亡和组织坏死。瘤组织的单细胞悬液经RT-PCR检测显示Bcl-2 mRNA表达在Bcl-2 shRNA组均显著下降(P<0.05),而对照组则无明显变化。结论:Bcl-2 shRNA可增强MTX对人淋巴瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用。     

E74样因子5过表达抑制结肠癌细胞生物学行为的体内外实验研究

  目的  探讨E74样因子5（ELF5）过表达对结直肠癌细胞的生长和侵袭能力以及裸鼠成瘤的影响。  方法  人结直肠癌SW480和 HT-29细胞分为5组:LV-GFP组,转染空载体LV-GFP慢病毒;LV-ELF5组,转染重组LV-ELF5慢病毒;shRNA-NC组,转染空载体shRNA-NC慢病毒;shRNA-ELF5组,转染重组shRNA-ELF5慢病毒;对照组,未转染任何载体。转染72 h后,取含有慢病毒的细胞上清液,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组细胞中ELF5 的mRNA表达水平;Western blot检测ELF5、凋亡相关的cleaved Caspase-3/Caspase-3和cleaved Caspase-9/Caspase-9、侵袭相关的E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达水平;CCK-8检测细胞活力;克隆形成实验检测克隆形成率;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞侵袭;TUNEL实验检测组织中细胞凋亡; 免疫组化检测组织中E-cadherin、N-cadherin的表达。 将20只BALB/c裸鼠分为4组,每组5只:LV-GFP组、shRNA-NC组、LV-ELF5组、shRNA-ELF5组,于裸鼠皮下注射含重组慢病毒的SW480细胞上清液,构建裸鼠成瘤模型,监测移植瘤体积变化。第30天取裸鼠移植瘤组织,测量肿瘤质量,Western blot检测移植瘤ELF5蛋白的表达,TUNEL染色检测移植瘤凋亡,免疫组化检测移植瘤中N-cadherin阳性表达。  结果  与对照组细胞比较,两个细胞系LV-GFP组和shRNA-NC组细胞的各指标差异无统计学意义。Western blot结果与RT-qPCR结果表明,两个细胞系LV-ELF5组的ELF5 mRNA和蛋白水平均上调（P<0.05,与LV-GFP组比较）,shRNA-ELF5组的ELF5 mRNA和蛋白水平均下调（P<0.05,与shRNA-NC组比较）,ELF5过表达体系和干扰体系构建成功。与LV-GFP组比较,LV-ELF5组降低了细胞活力和克隆形成率（P<0.05）,促进SW480细胞凋亡,并上调cleaved Caspase-3/Caspase-3和cleaved Caspase-9/Caspase-9蛋白表达（P<0.05）,抑制细胞侵袭,并上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin蛋白表达（P<0.05）;ELF5干扰后,细胞的上述表现呈相反趋势（P<0.05,shRNA-ELF5组与shRNA-NC组比较）。体内实验结果表明,ELF5过表达缩小裸鼠肿瘤体积和降低肿瘤质量（P<0.05）,促进组织中细胞凋亡（P<0.05）,ELF5蛋白表达增加,抑制N-cadherin蛋白表达（P< 0.05）。当EFL5表达抑制,上述实验结果呈相反趋势。  结论  体内外实验表明ELF5过表达可促进结直肠癌细胞凋亡,抑制结直肠癌细胞的生长和侵袭。     

腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达治疗人肺腺癌的实验研究

目的:构建针对人血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体pAd-Easy/VEGF,应用RNA干扰的方法,观察其在体内和体外对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:应用PCR构建RNA干扰pAd-Easy/VEGF腺病毒载体,并利用该线性化质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGF的腺病毒转染A549细胞.荧光显微镜和流式细胞仪观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGF mRNA的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:pAd-Easy/VEGF重组质粒经测序证实已把预设人VEGF基因RNA干扰的siRNA模板序列插入载体.转染重组腺病毒及空病毒24 h后流式细胞术测得转染效率分别为100%、99.7%.pAd-Easy/VEGF组VEGF表达水平较生理盐水对照组明显降低.pAd-Easy/VEGF组细胞生长明显减缓.pAd-Easy/VEGF治疗组肿瘤体积和质量明显小于对照组(P＜0.01).结论: pAd-Easy/VEGF介导的VEGF shRNA能有效抑制A549细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长.