用原代细胞培养和人全基因表达谱芯片筛选鼻咽癌差异表达基因

目的 利用细胞的原代培养技术及人全基因表达谱芯片技术初步筛选出鼻咽癌差异表达基因,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因.方法 分别用1例鼻咽癌细胞株C666及5例鼻咽癌培养出的原代细胞和3例鼻咽正常上皮的原代细胞,进行基因表达谱分析,并以荧光定量PCR及免疫组织化学验证芯片结果.结果 原代培养的鼻咽癌细胞和鼻咽正常上皮细胞通过细胞角蛋白的免疫细胞化学染色、EBER1原位杂交和EBV-DNA荧光定量PCR证实;鼻咽癌原代细胞和鼻咽正常上皮原代细胞的基因表达谱有显著差异;4例以上共同表达的差异基因有493个,包括上调基因264个,下调基因229个.荧光定量PCR及免疫组织化学结果和芯片结果一致.结论 用原代培养细胞及人类全基因组基因芯片构建基因表达谱能够准确、高效地筛选出鼻咽癌相关的差异表达基因,该基因表达谱的建立为研究鼻咽癌分子生物学机制、鼻咽癌的分子分型和分子诊断提供了重要的分子依据.     

基因芯片技术筛选血管瘤发生相关基因

目的:利用基因芯片技术寻找血管瘤与正常组织之间差异表达的基因,初步探索血管瘤的发生机制。方法:将14112条cDNA用点样仪点在特制玻片上制备成表达谱芯片,将来自同一患儿的血管瘤组织和正常组织的mRNA分别逆转录为cDNA,标记Cy3和Cy5两种荧光,制备成cDNA探针,与表达谱芯片杂交,通过计算机扫描、数据处理筛选出差异表达的基因。结果:血管瘤组织与正常组织共有249个差异表达基因,其中下调基因122个,上调基因127个。上调基因主要与细胞增生、血管形成、免疫细胞的黏附、细胞周期相关蛋白等有关;下调基因主要与细胞凋亡、肿瘤抑制等有关。结论:细胞增生相关基因的上调与凋亡相关基因的下调,导致细胞增生与凋亡失调,可能是引起血管瘤发病的原因。     

白血病原代骨髓基质细胞诱导Jurkat细胞基因差异表达研究

目的研究白血病骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)诱导Jurkat细胞相关基因表达的变化.方法采用Percoll体外分离正常人、初治急性白血病患者BMSCs;采用抑制性消减杂交技术建立白血病BMSCs诱导Jur-kat细胞差异表达基因的cDNA文库;并对差异表达的基因进行初步鉴定与分析.结果成功地建立了白血病BMSCs诱导的Jurkat细胞上调和下调差异表达基因的cDNA文库;初步筛选克隆到30个上调差异表达基因和22个下调差异表达基因cDNA片段;这些基因功能主要与细胞周期调控、细胞凋亡、细胞能量代谢有关.结论白血病BMSCs能诱导Jurkat细胞基因发生差异表达.     

人鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达分析

目的 用cDNA微阵列膜比较鼻咽癌组织及正常组织的基因表达谱,研究鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达,为进一步探讨差异表达基因的调控机制奠定基础.方法 24例鼻咽癌组织总RNA和正常对照总RNA(24例正常鼻咽组织RNA等质量混合)分别经逆转录探针标记与微阵列膜杂交.然后用Pathway4.0软件分析杂交结果,并用RT-PCR反应验证微阵列杂交结果.结果 在1625个鼻咽癌差异表达基因中,共有转录因子相关基因35个,12个基因表达上调,23个基因表达下调.结论 在鼻咽癌组织中,多个转录因子相关基因的表达水平发生了变化,这些转录因子在鼻咽癌组织的基因表达调控中发挥重要作用.     

利用RNA干扰技术研究PTX1在鼻咽癌中的功能

目的: 探讨位于鼻咽癌高频扩增区 12p12-p11的PTX1基因在鼻咽癌中的表达及生物学功能.方法:用RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测PTX1在36例鼻咽癌及8例慢性鼻咽炎中的表达.构建发夹状pSUPER-shPTX1干扰载体,转染鼻咽癌细胞系6-10B.mRNA水平检测PTX1基因的干扰效果,采用细胞周期及细胞凋亡检测PTX1被干扰后对鼻咽癌细胞6-10B细胞生物学特性的影响.结果:RT-PCR和荧光定量RT-PCR显示PTX1在鼻咽癌中高表达(P＜0.05).RNA干扰PTX1能抑制鼻咽癌细胞系的细胞增殖,诱导凋亡.结论: RNAi对 PTX1的表达阻断改变了鼻咽癌细胞系6-10B的生物学特性,提示鼻咽癌12p12-p11扩增区获得的PTX1基因可能通过促进细胞的增殖和减少凋亡双途径来参与鼻咽癌的发生发展.     

肝细胞癌中抑制细胞凋亡相关基因的差异表达

目的:研究肝癌细胞系的基因表达概况,筛选表达差异的抑制细胞凋亡相关基因,探索肝细胞癌发生发展机制及肝细胞癌治疗的新靶点?方法:通过基因芯片技术检测肝癌细胞系bel－7402?hep－3b与胎儿肝细胞的全基因组序列,筛选表达差异的抑制细胞凋亡相关基因,采用rt－pcr?免疫组化对部分差异表达基因进行了验证?结果:在检测的54 614个探针组中,bel－7402?hep－3b两株肝癌细胞与胎儿肝脏细胞相比表达共同上调2倍及2倍以上的有1 452个基因;表达下调2倍及2倍以上的有2 054个基因?与抑制细胞凋亡相关表达上调的基因有12个,选取2个基因进行rt－pcr?免疫组化验证,结果与基因芯片结论基本一致?结论:肝细胞癌中有众多的抑制细胞凋亡基因表达增高,通过影响tnf通路?bcl－2蛋白等多种方式共同抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖?对这些基因的研究有助于阐明肝细胞癌发生发展机制,为肝细胞癌的治疗提供新的靶点?     

补肾及健脾复方对皮质酮大鼠T细胞凋亡信号相关基因群调控模式的对比研究

目的:探讨补肾及健脾复方对皮质酮大鼠T细胞凋亡信号相关基因表达的调控模式.方法:采用TUNEL标记的流式细胞技术,对皮质酮大鼠模型及各治疗组激活诱导的T细胞凋亡进行定量分析;采用荧光实时定量PCR技术对各组大鼠T细胞凋亡信号相关基因群mRNA表达水平进行定量与比较;采用分光光度法检测caspase-8、caspase-3的活性.结果:(1)与正常组相比,模型组T细胞凋亡百分率明显增高;右归饮组及补肾益寿胶囊组T细胞凋亡百分率与皮质酮模型组相比明显降低;四君子汤与模型组相比T细胞凋亡百分率无显著性差异.(2)模型组促凋亡的Fas、FasL、TNR1、Bax基因表达上调,抗凋亡的TNFR2、Bcl-2、cIAP1、cIAP2基因表达下调;两个补肾复方均可下调FasL、TNFR1 mRNA表达水平,并可上调Bcl-2、cIAPl、cIAP2 mRNA表达水平;四君子汤仅对Bcl-2,cIAP2 mRNA表达水平有显著上调作用.(3)模型组caspase-8、caspase-3活性显著增高,两个补肾复方均可降低caspase-8、caspase-3的活性,四君子汤对caspase-8、caspase-3的活性无显著下调作用.结论:两个补肾复方下调促凋亡基因FasL、TNFR1的转录,上调抗凋亡基因Bcl-2、cIAPl、cIAP2的转录,并且降低caspase-8、caspase-3的活性,从而降低皮质酮大鼠过度的T细胞凋亡,是补肾法特有的对皮质酮大鼠T细胞凋亡相关基因群的调控模式.     

间质蛋白Periostin高表达对鼻咽癌6-10B细胞凋亡的影响及可能机制

目的探讨间质蛋白Periostin高表达对鼻咽癌6-10B细胞凋亡的影响及其可能机制。方法流式细胞术及Western blot技术检测Periostin高表达前后6-10B细胞凋亡率的变化及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、P53和p-Akt的表达；用稳定转染POSTN的6-10B细胞(6-10B POSTN细胞)及对照组6-10B系列细胞的培养上清,分别刺激6-10B细胞,检测刺激前后6-10B细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、P53和p-Akt的表达。将人P53 shRNA干扰载体转染到6-10B、6-10B-GFP和6-10B-POSTN细胞中,流式细胞术检测干扰P53后细胞的凋亡率。结果与对照组比较,Periostin高表达后6-10B细胞凋亡率明显升高,Bax和P53蛋白表达上调,Bcl-2的表达差异无显著性,但Bax/Bcl-2比值显著升高,p-Akt蛋白表达显著下调。Periostin高表达的6-10B细胞培养上清培养6-10B后,凋亡率较对照组显著升高。下调6-10B细胞中P53基因后,6-10B细胞的凋亡率较对照组无明显改变,而Periostin高表达的6-10B细胞的凋亡率较对照组显著升高。结论Periostin蛋白的表达上调可以促进鼻咽癌细胞的凋亡；其促凋亡机制与鼻咽癌组织中P53蛋白表达上调无关。     

补肾生精丸对生精细胞损伤模型大鼠生精细胞凋亡与Bcl-2、Bax、Fas、FasL表达的影响

目的 观察补肾生精丸对腺嘌呤所致生精细胞损伤模型大鼠生精细胞凋亡的影响及凋亡相关基因的调控情况.方法 SD大鼠40只随机分为4组:正常组、模型组、中药治疗组(补肾生精丸组)、中药对照组(五子衍宗丸组).以腺嘌呤灌胃诱发生精细胞损伤肾阳虚模型,用TUNEL法检测各组大鼠睾丸组织生精细胞的凋亡情况;用免疫组化的方法检测Bcl-2、Bax、Fas及FasL的表达.结果 补肾生精丸能够抑制大鼠睾丸曲细精管生精细胞的凋亡,上调抑制凋亡基因Bcl-2的表达,下调促凋亡基因Bax、Fas、FasL的表达,与模型组比较有统计学意义(P<0.01).结论 补肾生精丸对腺嘌呤致生精细胞损伤模型大鼠生精细胞的凋亡有一定的抑制作用,其作用可能与该药调控Bcl-2、Bax、Fas、FasL的表达有关.     

多个GEO芯片联合分析筛选鼻咽癌易感基因

目的：筛选鼻咽癌的关键基因，探讨鼻咽癌发病机制。方法：从公共基因芯片数据库（GEO）搜索有关鼻咽癌表达的数据，联合R语言分析鼻咽癌组织与正常鼻咽组织差异表达的基因；利用基因本体（GO）数据库和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路数据库对差异表达的基因进行富集和功能注释。基于STRING数据库及Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络，分析其关键基因簇及网络节点。结果：共纳入3套鼻咽癌基因芯片数据，选出在≥3个数据集中有交集的差异表达基因116个，其中上调基因69个，下调基因47个。差异表达基因GO富集分析发现细胞分裂异常、蛋白结合改变，纺锤体装配异常、细胞外泌体功能改变与鼻咽癌发生发展相关；鼻咽癌组织细胞内部分信号通路发生显著改变，包括DNA修复、细胞外基质受体相互作用、细胞周期、小细胞肺癌、人T细胞白血病病毒1感染等。蛋白质相互作用网络提示存在3个重要的基因簇及4个关键基因。结论：利用生物信息学方法能有效筛选目标基因和信号通路，为鼻咽癌的治疗提供新的策略。     

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与鼻咽癌的关联性

目的探索杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）基因多态性与鼻咽癌（NPC）发生的关联性。方法采用聚合酶链反应（PCR）／系列特异性引物（SSP）方法,对比43例广东籍汉族鼻咽癌患者和53例籍贯种族都匹配的正常对照KIR基因位点的多态性。结果共检出目前已知的16个KIR基因,在检测的全部个体中,3DL3、3DL2及2DL4出现频率均为100％。广东籍鼻咽癌病例组中2DL2、2DS1、2DS3、2DS4的基因频率比正常对照组显著升高（P值分别为0．035、0．002、0．C107、0．001）,而其他各KIR基因频率差异无统计学意义。结论2DL2,2DS1、2DS3、2DS4基因频率升高可能与NPC发病相关。     

沉默Sam68对鼻咽癌5-8F细胞增殖的影响及其机制

目的探讨Sam68基因对鼻咽癌5-8F细胞增殖能力的影响及可能的分子机制。方法通过靶向沉默鼻咽癌5-8F细胞内源
性Sam68基因,研究细胞增殖能力的变化情况,并采用qRT-PCR和Western blotting实验方法检测Sam68、细胞周期相关蛋白及
其上游分子的表达情况。结果转染Sam68靶向siRNA的5-8F细胞中,Sam68蛋白和mRNA表达水平均明显降低。MTT、细胞
周期实验证实干扰Sam68后5-8F细胞的增殖能力受到抑制;Western blotting检测结果显示细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达明
显下调,p27 表达上调,同时p-FOXO3a、p-Akt 和p-GSK-3β的表达明显下调,而总FOXO3a、Akt 和GSK-3β的表达则无明显变
化。结论Sam68可能通过激活Akt/FOXO3a信号通路对细胞增殖的相关分子进行调控,进而影响鼻咽癌细胞的增殖能力。
     

去甲斑蝥素对人胆囊癌GBC-SD细胞系增殖相关基因蛋白PCNA、Ki-67的影响

目的　探讨去甲斑蝥素对人胆囊癌GBC SD细胞系增殖相关基因蛋白PCNA、Ki 67的影响。方法　应用体外细胞培养技术进行人胆囊癌GBC SD细胞的培养和传代 ;将去甲斑蝥素作用于经体外培养的人胆囊癌GBC SD细胞 ,应用SABC法检测其对GBC SD细胞增殖相关基因蛋白PCNA和Ki 67表达影响。结果　对照组GBC SD细胞可见核仁或胞核呈不同程度的PCNA或Ki 67棕褐染色 ,PCNA和Ki 67阳性指数分别达 0 .93 2和 0 .964;去甲斑蝥素 (60 μg/ml)作用 48h后 ,PCNA表达和Ki 67表达阳性的细胞数明显减少 ,PCNA和Ki 67阳性指数仅为 0 .3 18和 0 .2 97,差异有显著性 (P <0 .0 5)。结论　去甲斑蝥素可影响GBC SD细胞增殖相关基因蛋白PCNA和Ki 67的表达 ,这可能是其抑制人原发性胆囊癌GBC SD细胞增殖的机制之一     

粉防己碱对人鼻咽癌细胞株CNE增殖抑制和凋亡作用的研究

目的：探讨粉防己碱（Tet）对人鼻咽癌细胞株CNE增殖抑制和凋亡的影响。方法：将人鼻咽癌细胞株CNE分为不同浓度Tet处理组,并设立对照组。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE体外生长的抑制作用;采用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳技术、流式细胞术Annenxin V/PI EGFP观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE凋亡的影响;采用逆转录-多聚酶链反应技术（RT-PCR）观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE凋亡相关基因mRNA表达的影响。结果：Tet呈浓度依赖性抑制癌细胞体外生长（P〈0.05）。Tet处理细胞72 h后,电镜下可见细胞缩小,核裂解,凋亡小体形成;随着Tet浓度的提高,各Tet处理组DNA凝胶电泳梯形条带和细胞凋亡率渐趋明显。与对照组相比较,Bcl-2 mRNA的表达渐减弱,Bax基因mRNA表达渐增强（P〈0.05）。结论：Tet可抑制癌细胞生长,促进癌细胞凋亡,其抗癌作用机制可能与下调Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达有密切联系。     

凋亡相关基因及蛋白的表达与人卵巢癌细胞顺铂耐药的关系

目的探讨COC1/DDP和COC1中凋亡相关基因及凋亡相关蛋白的表达与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法采用流式细胞仪检测不同浓度顺铂作用于COC1及COC1/DDP细胞48h后细胞凋亡率;RT-PCR及Western blot法检测凋亡相关基因及蛋白Bcl-2、Caspase-3、Smac和Survivin在COC1和COC1/DDP中的表达。结果DDP作用于COC1和COC1/DDP细胞48h后细胞随着DDP浓度的升高,凋亡率也相应增高。COC1/DDP中抗凋亡基因及蛋白Bcl-2、Survivin的表达明显高于COC1。COC1/DDP中促进凋亡的基因及蛋白Smac、Caspase-3的表达明显低于COC1。结论在COC1/DDP中抗凋亡基因及蛋白Bcl-2、Survivin的高表达以及促进凋亡的基因及蛋白Smac和Caspase-3的低表达可能参与COC1/DDP对DDP耐药的发生机制。     

Molecular cloning and characterization of NAG-7: a novel gene downregulated i n human nasopharyngeal carcinoma

目的　分离位于染色体 3p2 4 2 6区域中鼻咽癌新的抑瘤基因。方法　在染色体 3p2 4 2 6鼻咽癌杂合性丢失 (lossofheterogosity ,LOH)高频区 ,用RT PCR及Northern杂交检测了2 0个表达序列标记 (expressedsequencetag ,EST)在鼻咽癌细胞株HNE 1和原代培养的正常鼻咽上皮细胞中的表达水平 ,并对其中一个在鼻咽癌细胞株HNE 1中表达下调的EST在 19例鼻咽癌活检组织中的表达进行了检测。用cDNA文库筛选方法获得其全长cDNA序列 ,对该序列进行了初步分析。结果　获得一个位于染色体 3p2 5 3的新基因 ,命名为NAG 7基因。该基因在 2 6 3% (5 19)的鼻咽癌活检组织中表达下调。它全长 16 6 7bp ,其开放阅读框 (openreadingframe ,ORF)编码一个含 94个氨基酸的碱性蛋白质 ,分子量为 110 2 3 87道尔顿 ,预测为一跨膜蛋白质。它含有一蛋白激酶C磷酸化位点和肉豆蔻基位点。迄今为止 ,NAG 7基因序列在基因库中未见任何同源性基因。结论　NAG 7基因是一个在鼻咽癌中表达下调的新基因 ,它的改变可能参与了鼻咽癌的发生发展     

胆固醇转运相关基因NPC1、NPC2调节造血前体细胞的增殖和分化

目的 采用NPC1、NPC2基因敲低的造血前体细胞(erythroid myeloid lymphoid,EML)作为模型,探讨NPC1、NPC2对EML细胞增殖、分化的影响.方法 通过NPC1 shRNA、NPC2 shRNA重组慢病毒感染EML细胞获得NPC1、NPC2基因有效沉默的EML细胞模型.利用该模型以Filipin染色检测NPC1、NPC2基因敲低后对EML细胞内胆固醇分布的影响,采用CCK-8和台盼蓝染色检测细胞增殖,采用流式细胞仪检测NPC1、NPC2基因沉默后EML细胞干性标志物CD34、sca-1、c-kit及TER-119、CD11b、B220的变化,采用Western blot检测造血干细胞因子(stem cell factor,SCF)刺激细胞后c-kit磷酸化的改变.结果 成功构建NPC1、NPC2基因沉默的EML细胞模型,NPC1、NPC2基因在mRNA和蛋白表达均显著降低(P＜0.01).NPC1、NPC2敲低的EML细胞中出现胆固醇蓄积,且在NPC1敲低的EML细胞模型中胆固醇蓄积更显著.沉默NPC1、NPC2基因后使得EML细胞增殖减慢(P＜0.01),并且能够降低EML细胞CD34、sca-1和TER-119、B220的阳性率(P＜0.01).经SCF刺激后NPC1基因沉默的EML细胞中c-kit的磷酸化降低显著(P＜0.01),但在NPC2基因沉默的EML细胞中c-kit磷酸化的改变差异无统计学意义.结论 胆固醇转运相关基因NPC1通过调节细胞胆固醇流动参与了EML细胞的增殖和分化调控.