胆固醇对血管内皮细胞的损伤

目的 研究胆固醇对人血管内皮细胞的损伤作用.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,分别以浓度为6.25、12.50、25.00、50.00 mg/L的胆固醇作用于ECV304细胞48 h,检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性,一氧化氮(nitric oxide, NO)浓度,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)活性及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)浓度.结果 与无胆固醇组比较,胆固醇浓度为50.00 mg/L时培养液中LDH活性显著增加;25.0 mg/L,50.0 mg/L浓度组培养液中NO浓度显著降低;胆固醇浓度为6.25、12.5、25.0、50.0 mg/L组与无胆固醇组比较,随着胆固醇浓度提高,培养液中NOS活性逐渐降低,MCP-1浓度逐渐增高,有显著性差异.结论 一定浓度的胆固醇能直接损伤人血管内皮细胞结构,影响内皮细胞的部分分泌功能.     

ECV304-SKOV3和L929-H22细胞协同形成血管样结构的体外研究

目的:在建立肿瘤基质血管内皮细胞模型(ECV304-SKOV3)和成纤维细胞模型(L929-H22)的基础上,进一步探讨二者在肿瘤新生血管形成中的协同作用.方法:对ECV304-SKOV3和L929-H22细胞用RT-PCR测定其端粒酶活性,双室联合培养测定ECV304-SKOV3细胞游走与管腔形成能力、L929-H22细胞促进肿瘤细胞侵袭与内皮细胞管腔形成能力.结果:ECV304-SKOV3细胞和L929-H22细胞的端粒酶活性明显强于亲代细胞ECV304、L929,分别为0.778±0.011、0.875±0.026、0.692±0.014、0.684±0.012(P＜0.001).ECV304-SKOV3细胞较ECV304细胞的游走能力强2.10倍,差异非常显著(P＜0.001),且管腔形成能力明显增强,管腔数多0.94倍(P＜0.01),管腔长0.91倍(P＜0.01).L929-H22明显促进肿瘤细胞侵袭(P＜0.001)与ECV304、ECV304-SKOV3细胞形成管型(P＜0.05),尤其与ECV304-SKOV3联合培养时形成的管腔最多且最长(P＜0.01;P＜0.001).结论:肿瘤基质血管内皮细胞存活能力、游走与管腔形成能力增强.肿瘤基质成纤维细胞明显促进肿瘤细胞侵袭与血管内皮细胞形成管型.二者在肿瘤新生血管形成中有协同作用.     

小檗碱衍生物B-119抑制肿瘤及血管内皮细胞增殖的作用

目的探讨小檗碱衍生物B-119对肿瘤细胞的增殖抑制作用及对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成的影响。方法MTT法检测B-119对瘤细胞株MDA-MB-231、B16、K562、LLC、HT29、SMMC-7721、Colo205、HL60和血管内皮细胞ECV304的增殖抑制作用;划痕法测定B-119对血管内皮细胞ECV304迁移的影响;观察B-119对血管内皮细胞ECV304小管形成的影响。结果 B-119对8株肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用,IC50值为0.76～26.83mg/L;B-119对ECV304的增殖抑制作用表现为时间、浓度依赖性,24,48,72h的IC50分别为59.22,12.08,3.31mg/L;药物干预组ECV304细胞迁移数减少,且随B-119浓度的增加,迁移抑制作用越强,B-119浓度为1.25,2.5,5mg/L干预24h后,细胞迁移数渐次减少,抑制率分别为49.29%,59.71%和71.94%(P<0.01);B-119对ECV304小管形成有明显的抑制作用,浓度为10,20,30mg/L时的小管形成抑制率分别为35.71%,57.14%和67.86%(P<0.01)。结论 B-119可抑制肿瘤细胞的增殖,并抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成。     

Celebrex对VEGF诱导的内皮细胞迁移的影响及其机制

目的:观察选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂celebrex对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的内皮细胞细胞迁移能力的影响及其与细胞内MMP-9表达的关系。方法:体外培养内皮细胞系ECV304,将细胞分为4组:①空白对照组(ECV304);②VEGF组(ECV304+VEGF);③celebrex+VEGF组(ECV304+VEGF+cele-brex);④celebrex组(ECV304+celebrex)。观察:①用损伤修复实验观察不同浓度celebrex对ECV304细胞迁移能力影响及对VEGF诱导下ECV304细胞迁移速度影响;②用半定量RT-PCR法检测VEGF及celebrex对ECV304细胞MMP-9 mRNA表达的影响。结果:ECV304细胞的迁移速度随VEGF浓度(0.02,0.2,2μmol/L)的增加呈降低趋势;celebrex+VEGF组(2μmol/L celebrex+5μg/L VEGF)迁移速度为(3.55±0.02)μm/h与VEGF组(5μg/L VEGF)迁移速度(7.66±0.02)μm/h比较,两者有显著差异(P<0.01);celebrex+VEGF组(2μmol/L celebrex+5μg/L VEGF)的MMP-9表达量明显低于VEGF组(5μg/L VEGF)。结论:celebrex能抑制VEGF诱导的ECV304细胞迁移,并使COX-2下游的MMP-9表达量显著下调,这是可能的机制之一。     

蜂毒素体外抑制内皮细胞血管生成及其作用机制

目的:探讨蜂毒素对人脐静脉来源内皮细胞(ECV304)血管生成的抑制作用及其机制.方法:体外培养ECV304细胞,分别测定蜂毒素对其增殖、迁移及形成管状结构的影响.采用酶联免疫吸附法检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量.应用实时荧光定量PCR方法检测ECV304细胞VEGF mRNA和bFGF mRNA的表达.结果:经蜂毒素作用后,ECV304细胞的增殖明显受到抑制,24,48,72 h的IC50分别为5.11,4.68,4.40 mg/L.蜂毒素低、中、高浓度组和沙利度胺(TLD)组ECV304细胞迁移数目(19.44±6.54),(11.17±2.85),(4.22±1.83)和(18.28±5.29)个,明显低于空白对照组(42.33±9.63 )个(P＜0.01).蜂毒素低、中、高浓度组及TLD组形成管状结构的面积分别为 (5947.22±973.72),(1558.33±281.06),(705.85±318.01)和(2928.92±735.67) μm2/视野,均低于空白对照组(7828.94±1202.54) μm2/视野(P＜0.01).经蜂毒素处理后,ECV304细胞分泌VEGF及bFGF的功能明显下降.荧光定量PCR证实,蜂毒素可降低ECV304细胞VEGF mRNA和bFGF mRN的表达.结论:体外实验结果表明,蜂毒素具有抑制ECV304细胞血管生成的作用,这种效应与血管内皮细胞VEGF和bFGF的活性降低及其合成受到抑制有关.     

肿瘤基质血管内皮细胞血管形成能力研究

目的:探讨肿瘤基质血管内皮细胞的血管形成能力.方法:对卵巢癌细胞SKOV3培养上清液诱导人内皮细胞ECV304获得能稳定生长的ECV304-SKOV3细胞,用免疫细胞化学测定其血管形成因子的表达、PT-PCR测定其端粒酶活性、双室联合培养测定其游走能力与管腔形成能力,并分析其蛋白质合成能力、粘贴能力.并与亲代细胞ECV304比较.结果:ECV304-SKOV3细胞蛋白质合成能力、端粒酶活性强于亲代细胞ECV304(P＜0.001),但粘贴能力减弱(P＜0.001).表达bcl-2、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)增强(P＜0.05),而粘合素(tenascin,TN)减弱(P＜0.05).ECV304-SKOV3细胞较ECV304细胞的游走能力强2.10倍,差异非常显著(P＜0.001),管腔形成能力也明显增强,平均每视野管腔数分别为(12.4±1.517)条和(6.4±0.894)条(P＜0.01),管腔长分别为(262.17±49.52)μm和(137.34±18.69)μm(P＜0.01).结论:肿瘤基质血管内皮细胞存活能力增强,表达多种细胞因子与血管形成因子增强,相应地游走能力与管腔形成能力明显增强.     

腺病毒介导的Vasostatin基因对血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的Vasostatin基因对体外培养的血管内皮细胞增殖及凋亡的作用.方法采用MTT法观察Vasostatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响.采用透射电镜、TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色、流式细胞仪AnnexinV/PI双染法,检测腺病毒介导的Vasostatin基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡.结果Ad-Vasostatin(MOI分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P＜0.05);透射电镜下及TUNEL/Hoechst33258双重荧光染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变.以MOI为50的Ad-Vasostatin处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(15.70±0.84)%,PBS组为(2.54±0.83)%,Ad-lacZ组为(2.34±0.79)%,三组比较均有显著性差异(P＜0.01).结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用.     

大鼠总基因甲基化状态改变相关危险因素的研究

目的：探讨高胆固醇血症（Hypercholesterolemia,HTC）对wistar大鼠主动脉基因组DNA总甲基化水平及总甲基转移酶活力的影响并比较高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocysteinemia,HHCY）和HTC在影响主动脉基因组DNA总甲基化水平、总甲基转移酶活力之间的差异。方法：将wistar大鼠33只,随机分3 组：对照组、蛋氨酸组、高胆固醇组,每组11只。对照组给予普通大鼠饲料,其余各组给予相应的配方饲料。持续喂养3个月后心脏取血检测血清同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）、总胆固醇（Total cholesterol,TC）等相关指标。提取主动脉基因组DNA检测基因组DNA总甲基化水平、提取主动脉核蛋白检测基因组DNA总甲基转移酶活力。结果：经多个样本均数间的多重比较（Dunnett-t检验）:高胆固醇组大鼠的血清TC水平明显高于对照组和蛋氨酸组,且差异有统计学意义（P＜0.05）,血清中甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein-cholesterol,HDL-C）,差异无统计学意义（P ＞0.05）。蛋氨酸组大鼠血清Hcy水平明显高于对照组及高胆固醇组,且差异有统计学意义（P＜0.05）。HHCY和HTC均增加基因组DNA总甲基转移酶活力,可促使基因组DNA去甲基化,与对照组相比,各组均具有统计学意义（P＜0.05）,但两组之间差异无显著性。结论：HTC降低大鼠主动脉基因组DNA总甲基化水平可能是HTC导致动脉粥样硬化发病重要机制之一,且HHCY和HTC在影响基因组DNA低甲基化之间的差异无显著。     

地塞米松诱导人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：观察地塞米松对人脐带静脉血管内皮细胞( ECV304)增殖的影响。方法：采用细胞凋亡的荧光检测法（Heochst 33342）检测地塞米松对脐静脉血管内皮细胞（ECV304）的形态学改变, MTT 法观察地塞米松对ECV304增殖的抑制作用,流式细胞仪术检测地塞米松引起的ECV304凋亡率改变。结果：较高剂量（100umol/L）地塞米松对脐静脉血管内皮细胞增殖起抑制作用,并诱导其凋亡。结论：地塞米松具有比较明显的抑制血管内皮细胞增殖的作用。地塞米松抗血管生成的机制可能与其抑制血管内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

腺病毒介导的Vasostatin基因对血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的Vasostatin基因对体外培养的血管内皮细胞增殖及凋亡的作用。方法采用MTT法观察Vasostatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。采用透射电镜、TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色、流式细胞仪AnnexinV/PI双染法,检测腺病毒介导的Vasostatin基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果Ad-Vasostatin(MO I分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P<0.05);透射电镜下及TUNEL/Hoechst33258双重荧光染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变。以MO I为50的Ad-Vasostatin处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(15.70±0.84)%,PBS组为(2.54±0.83)%,Ad-lacZ组为(2.34±0.79)%,三组比较均有显著性差异(P<0.01)。结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用。     

牡蛎糖胺聚糖对H2O2所致血管内皮细胞氧化损伤的保护作用

目的了解牡蛎糖胺聚糖（O-GAG）对过氧化氢所致血管内皮细胞（VECs）氧化损伤的保护作用及其机制。方法采用人脐静脉内皮细胞株ECV304体外培养的方法,建立H2O2诱导的血管内皮细胞损伤模型,实验分为正常对照组、损伤模型组（过氧化氢50 mg/L）、肝素组（肝素200 mg/L,过氧化氢50 mg/L）、O-GAG保护组（O-GAG 10、50、100、200、400、800 mg/L,过氧化氢50 mg/L）、O-GAG对照组（O-GAG 100、200、400 mg/L）。采用噻唑蓝（MTT）比色法观察O-GAG对血管内皮细胞增殖活性的影响,黄嘌呤氧化酶法检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果与正常对照组相比,损伤模型组细胞的增殖活性和SOD的活活性均明显降低（F=137.23、135.40,q=5.26、5.34,P〈0.01）,而O-GAG对照组（100、200 mg/L）的细胞增殖活性明显增高（q=3.40、3.81,P〈0.05）。与损伤模型组相比,O-GAG各保护组（50-800 mg/L）细胞增殖活性明显增加（q=3.40-5.23,P〈0.05、0.01）,SOD活性明显升高（q=4.46-5.07,P〈0.01）。结论O-GAG对过氧化氢所致血管内皮细胞的氧化损伤具有保护作用,其作用机制可能与增加细胞内SOD活性有关。     

不同雌激素水平对大鼠血管内皮细胞功能及血管内皮细胞粘附分子1表达的作用

目的研究雌激素对雌鼠肺血管内皮细胞功能及血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)表达的调节。方法（1）雌性SD大鼠24只分为假手术组、去势组、治疗组,采用放射免疫法检测血清中内皮素、前列环素的含量,铜-镉还原法测定血清中一氧化氮的产量。放射配体结合法检测肺血管内皮细胞中雌激素受体含量。（2）正常雌鼠肺培养的第2代血管内皮细胞,按不同浓度17-β雌二醇(17-βE2)分为A组（对照）、B组（3×10-8mol/L17-βE2）、C组（3×10-7mol/L17-βE2）;D组（3×10-6mol/L17-βE2）、E组（3×10-6mol/L17-βE2+3×10-6mol/L他莫西芬）处理48h,白细胞介素-1β作用后流式细胞仪分别检测各组VCAM-1表达量。结果(1)去势组雌鼠血中一氧化氮（18μmol/L±8μmol/L）、前列环素（8.5pg/ml±2.5pg/ml）均降低,治疗组二者水平明显升高（31μmol/L±7μmol/L,P<0.05;10.9pg/ml±3.4pg/ml）,而内皮素含量变化则相反（170pg/ml±39pg/ml;100pg/ml±32pg/ml,P<0.05）。(2)去势组雌鼠血管内皮细胞中雌激素受体含量(fmol/106cell）显著降低（6.7±0.5),治疗组雌激素受体含量维持在高水平（17.6±1.2,P<0.01）。(3)白细胞介素-1β作用后A组表达VCAM-1细胞百分率明显增高（17.5%±1.5%）,B、C、D组表达VCAM-1细胞百分率显著降低（15.4%±1.42%、12.4%±0.34%、8.7%±0.27%,P<0.01）。结论雌激素水平可明显影响雌鼠血管内皮细胞内皮素、一氧化氮、前列环素的分泌,并可影响雌鼠血管内皮细胞中雌激素受体含量。雌二醇均可降低白细胞介素-1β诱发的雌鼠血管内皮细胞VCAM-1表达增高。     

白芍总苷对系统性红斑狼疮CD4+ T细胞ITGAL基因表达和启动子甲基化修饰的影响

目的: 探讨白芍总苷(total glucosides of peony, TGP)对系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血CD⁴⁺ T细胞甲基化敏感基因ITGAL(CD11a)表达及启动子甲基化修饰的影响。方法: 利用磁珠分选获得外周血CD⁴⁺ T细胞,用不同浓度TGP(0,62.5,312.5和1562.5 mg/L)处理SLE患者CD⁴⁺ T细胞,48 h后收集细胞。MTT法检测处理后CD⁴⁺ T细胞的活力。定量PCR检测ITGAL基因mRNA表达水平。流式细胞术检测CD⁴⁺ T细胞表面CD11a分子表达水平。亚硫酸盐测序法分析ITGAL基因启动子甲基化水平。结果: TGP处理48 h后,各浓度组CD⁴⁺ T细胞活力无明显差异。与对照组相比,高浓度组(1562.5 mg/L)ITGAL基因mRNA表达水平显著降低(P<0.01),CD⁴⁺ T细胞表面CD11a表达水平亦显著降低(P<0.01)。进一步DNA甲基化水平检测显示高浓度TGP处理组ITGAL基因启动子甲基化水平较对照组显著升高(P<0.01)。结论: TGP可通过升高ITGAL基因启动子甲基化水平降低SLE患者外周血CD⁴⁺ T细胞中CD11a表达水平,初步揭示了TGP抑制SLE自身免疫反应的分子机制。     

金属硫蛋白、同型半胱氨酸对血管内皮细胞的作用

目的:观察金属硫蛋白(metallothionein MT)对同型半胱氨酸(homocysteine Hcy)损伤血管内皮细胞的保护作用及机制。方法:培养血管内皮细胞,培养液中分别加入Hcy及Hcy+MT孵育血管内皮细胞,自动生化分析仪测培养液乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,硫代巴比妥酸法测细胞丙二醛(MDA)含量,化学比色方法测超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果:与对照组相比,Hcy组细胞LDH及蛋白漏出增加,细胞MDA含量明显升高(P<0.01);外源性给予MT(10-9mol/L,5×10-9mol/L,10-8mol/L)呈浓度依赖性地抑制Hcy引起的血管内皮细胞损伤,与Hcy组比,LDH漏出分别降低16.3%(P<0.05)、23.5%(P<0.01)和37.2%(P<0.01)。MDA含量分别减少15.8%(P<0.05)、21.1%(P<0.01)和36.8%(P<0.01)。结论:MT拮抗Hcy对血管内皮细胞的脂质过氧化损伤。     

升降散对内毒素刺激血管内皮细胞ET-1和NO表达的影响

目的:探讨升降散对内毒素(LPS)刺激下血管内皮细胞ET-1和NO表达的影响。方法:将内皮细胞传代培养后分为空白组、对照组(空白细胞+LPS 0.50 mg/ml)、低剂量升降散组(升降散5 mg/ml+LPS 0.50 mg/ml)、中剂量升降散组(升降散10 mg/ml+LPS 0.50 mg/ml)和高剂量升降散组(升降散30 mg/ml+LPS 0.50 mg/ml),观察各组ET-1和NO水平变化。结果:升降散作用细胞48 h后,内皮细胞在5～30 mg/ml范围内对内皮细胞贴壁无明显影响。LPS作用内皮细胞48 h后,NOi、NOS、NOS水平明显升高,与空白组比较有显著性差异(P<0.01);升降散作用细胞后ET-1、NOi、NOS、NOS水平有不同程度降低,与对照组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01),且中、高剂量升降散组诸指标的降低幅度较低剂量升降散组明显(P<0.05,P<0.01)。结论:升降散能抑制LPS诱导的VECs活性物质生成和释放,从而减轻对组织细胞的损伤,以中高剂量升降散效果更显著。     

缺氧对人小细胞肺癌H446细胞基因组DNA甲基化水平的影响

目的研究缺氧对人小细胞肺癌H446细胞基因组DNA甲基化水平的影响。方法体外培养人小细胞肺癌细胞H446,置于缺氧(3%O2)条件下培养,分别于0、12、24、48、72 h后提取细胞基因组DNA,用甲基化敏感性随机引物PCR(MS-AP-PCR)方法检测基因组DNA甲基化状态。结果在缺氧状态下,H446细胞经酶解后的扩增谱带明显增多,且荧光强度较强,以24 h后明显,表明H446细胞基因组DNA甲基化水平在缺氧24 h后即发生明显升高,主要表现为多位点的异常甲基化。结论缺氧可能是造成肿瘤细胞内甲基化失衡的重要原因之一。     

人肝细胞癌总基因组DNA与c-myc、c-N-ras基因甲基化的改变

分别用两种方法研究了人原发性肝细胞癌总基因组及特定癌基因片段的DNA甲基化情况，并进行对比研究。以3H－SAM掺入法研究总基因组DNA甲基化水平，以限制性内切酶酶切、South－ern吸印法对c－myc、c－N－ras两种癌基因状况进行分析。结果：发现人肝细胞癌区和癌旁区组织内c－myc、c－N－ras癌基因分别有不同程度的低甲基化，且有癌区总基因DNA甲基化水平明显下降。本文结果提示：两种方法检测均发现在人原发性肝癌中存在DNA低甲基化现象，联用两种方法效果优于单一检测者。     

三羟异黄酮对胆固醇诱导内皮细胞损伤的保护作用

目的:探讨胆固醇(cholesterol)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)凋亡、细胞增殖的影响,同时观察CuSO4溶液在其中的作用及三羟异黄酮(genistein,GST)干预HUVEC的损伤情况。方法:实验分为8组。对照组(等体积溶剂)、胆固醇低剂量组(25 mg/L)、中剂量组(50 mg/L)和高剂量组(100 mg/L);另外4组分别为以上各组加入终浓度为10μmol/L CuSO4溶液。应用流式细胞仪检测不同浓度胆固醇对细胞凋亡率的影响;应用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT试验)检测细胞的生存率。胆固醇损伤组(胆固醇50 mg/L+终浓度为10μmol/L的CuSO4溶液)分别加入GST 22.5μmol/L、45μmol/L和90μmol/L。结果:不同浓度的胆固醇可不同程度地诱导HUVEC细胞发生凋亡,抑制HUVEC细胞增殖,且随浓度增高,其作用均明显增强。各组加入CuSO₄溶液后可使其细胞凋亡率明显升高,增殖率下降。胆固醇损伤组的GSH-Px活力和NO生成量明显下降,丙二醛(MDA)含量升高,与正常对照组和不同剂量组比较差异均有统计学意义(P<0.05~P<0.01),而正常对照组和GST不同剂量组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:胆固醇可以诱导内皮细胞凋亡及抑制细胞增殖,CuSO₄溶液可促进胆固醇对HUVEC的损伤。GST对被胆固醇损伤的内皮细胞有一定的保护作用。