CRISPR技术发展及其在骨和软骨组织工程中的应用

由Cas9核酸酶和单向导RNA（sgRNA）组成的CRISPR/Cas9系统,可对sgRNA靶向的DNA序列进行缺失、插入和点突变等基因重编程操作,是新兴的基因编辑技术。此外,CRISPR/dCas9（Cas9核酸酶活性丧失的突变体）,仍保留sgRNA靶向结合DNA的能力,dCas9蛋白融合转录激活物（CRISPRa）后可激活目标基因表达,也可通过融合转录阻遏物（CRISPRi）抑制目标基因表达。CRISPR/Cas9系统的高效输送是限制其临床广泛应用的主要问题之一。病毒载体被广泛用于递送CRISPR/Cas9元 件;但就安全性、简便性和灵活性而言,非病毒载体研究更具吸引力。本文主要总结了CRISPR技术的原理和研究进展,包括CRISPR/Cas9的递送载体,递送模式以及递送过程的障碍,并回顾基于CRISPR技术在骨和软骨组织工程中的研究进展,讨论CRISPR技术在骨和软骨组织工程应用中面临的挑战和未来。     

改性壳聚糖作为基因递送载体的研究进展

基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。基因治疗有3个基本要素:目的基因、表达载体和递送载体,其中递送载体的构建和改进,一直是基因治疗研究的重点。递送载体有病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体的转染效率较高,但也存在一些明显缺点,如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等[1],因此人们愈来愈重视非病毒载体的研究。其中壳聚糖及其衍生物是研究的热点之一。1壳聚糖壳聚糖是甲壳类动物的甲壳质脱乙酰化后得到的阳离子多糖类物质。壳聚糖安全无毒,在体内可降解成水和二氧化…     

壳聚糖纳米粒作为基因治疗载体的研究进展

20 0 3年底 ,首个基因治疗药物—重组人P5 3腺病毒注射液[1～ 3 ] 在我国批准临床应用 ,标志着基因治疗进入了新时代。在基因治疗三要素 :目的基因、表达载体、递送载体中 ,递送载体的构建和改进 ,一直是基因治疗研究的重点。基因递送载体有病毒载体和非病毒载体。前者作为一种     

CRISPR/Cas9系统在现代生物学研究和临床试验中的应用

 规律成簇间隔短回文重复结构(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protien 9,Cas9)系统在生物医学研究中被广泛应用于基因编辑及探索基因的功能。这种基因编辑技术越来越多地运用在人类疾病的治疗中,包括巴斯综合征、杜氏肌萎缩症、血友病、地中海贫血和囊性纤维化。CRISPR/Cas 9基因编辑系统可以在体外细胞实验和体内动物实验上修复突变的DNA序列,也能改变 CCR5、PD-1/L1、CAR-T等基因序列,用于控制 HIV病毒的入侵及提高肿瘤免疫治疗的疗效。该技术还被运用于诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)分化,形成某些具有功能的器官用于器官移植。本文综述了CRISPR/Cas 9系统的来源、结构和作用原理,以及其在现代生物学研究和基因治疗领域的应用。     

CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用研究进展

常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白9（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR）/（CRISPR-associatedproteins9,Cas9）改造的第3代人工核酸内切酶,因其简单、高效等优点,已成为一种热门的基因编辑工具。近年来一些研究成功应用CRISPR/Cas9系统在体内外进行相关疾病基因的靶向修饰,为基因编辑技术在临床的应用奠定了基础,但其脱靶效应、导入方式、编辑效率等仍需改进。本文将对CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用进展作一综述。     

基因编辑研究进展与展望

CRISPR?Cas9技术的发展极大地推动了基因编辑技术的进步，基于该技术开发的碱基编辑器和先导编辑器赋予了CRISPR?Cas9系统更加强大的基因编辑能力，加速了CRISPR?Cas9技术应用于临床基因治疗。虽然目前对该系统做了诸多优化和改进，但在特异性、安全性以及在体转导等方面仍存在改进和优化的空间。本文针对这三方面的研究进展进行简要介绍和展望。     

纳米基因载体的研究进展

近年来，基因治疗迅速发展。基因治疗的主要过程是目的基因的获取和高效的基因转染。基因治疗成败的关键是基因治疗的载体系统。高效、安全是载体应具备的最基本条件。目前基因转染常用的载体有病毒型载体和非病毒型载体。病毒型载体在当前批准进入临床试验的基因治疗中占75％，转染效率通常在90％以上，但病毒蛋白有诱发机体产生免疫反应、体内潜在的病毒复制、生产成本高、不能反复应用、无靶向性等缺点。特别是在1999年的基因治疗临床试验中出现腺病毒载体致人死亡事件后，人们把注意力与希望逐步转向非病毒载体。非病毒型载体虽然制备简单、无免疫原性和比较安全，但是转染效率低是其致命缺点，尤其是在血清蛋白存在的情况下。所以寻找一种既高效又安全的基因载体是基因治疗领域面临的最紧要课题。     

小干扰RNA治疗药物载体递送技术研究进展

RNA干扰（RNAi）是一种控制靶基因表达的序列特异性调控机制。体内外研究结果表明,RNAi技术的应用对多种疾病治疗有巨大的前景,其瓶颈在于如何将基于RNAi的药物有效递送至靶细胞或靶组织。常用的载体递送系统可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。研究载体递送系统需重点考虑的因素有脱靶效应、递送方式、免疫反应诱导及剂量等。如果这些关键问题能够解决,将大大增加RNAi成为治疗药物的可能性。     

基因治疗病毒载体的研究进展

基因转移载体是基因治疗的重要组成部分,包括病毒载体和非病毒载体。目前应用的病毒载体主要有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。不同的病毒载体各有利弊。随着对病毒载体的不断改造完善,提高其基因转移效率和安全性,病毒载体将在基因治疗中继续发挥重要作用。     

基因治疗病毒载体的研究及应用

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用,因此它可用来治疗一些后天性和遗传性疾病,其成功与否的关键是载体。目前应用的载体主要有包括病毒和非病毒载体,但在基因治疗中应用最为广泛的载体是病毒载体。本文就近年来病毒载体系统在基因治疗中的应用及其改进等方面的研究进行综述。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤耐药研究中的应用进展

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统是存在于细菌和古生细菌中的一种抵御外源DNA入侵的适应性免疫反应系统.与传统的锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9操作更加简便、高效.目前,该技术已在肿瘤耐药研究中得到广泛应用,包括乳腺癌和白血病耐药等诸多方面.CRISPR/Cas9技术的应用虽仍存在脱靶效应等问题,但其应用前景非常广阔.本文就其在肿瘤耐药研究方面的应用进行综述.     

光诱导CRISPR/Cas9系统在基因表达调控中的研究进展

Cas9是CRISPR/Cas9系统中RNA引导的可切割双链DNA的核酸酶,野生型Cas9可通过基因剪切直接导致目的基因表达沉默.将Cas9蛋白D10A和H840A位点突变,可获得失去切割活性但仍保留与DNA结合能力的dCas9,其与转录激活因子连接后结合到DNA特定位点可实现转录激活;若dCas9直接与靶基因特定位点结合则可阻碍目的基因的转录.将光可调节物质引入CRISPR/Cas9可设计成光诱导CRISPR/Cas9系统.此系统在蓝光(470 nm)诱导下作用于靶DNA可实现人为可控的基因表达激活和抑制.本文主要介绍了光诱导CRISPR/Cas9系统的特性及其在基因表达调控中的运用.     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。     

CRISPR/Cas 基因组靶向编辑技术综述

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）是细菌特有的一种获得性免疫系统,研究人员将其改造成为靶向基因组编辑的工具,由于操作简单、成功率高且效率高,成为了靶向基因组编辑工具中的佼佼者。同时CRISPR/Cas系统也被改造作为一种极为有效的位点特异性的转录抑制/激活的工具而在研究工作中广泛应用,不仅如此,具有靶向细胞转录过程中产生的RNA底物的利用前景,从而起到与RNAi技术相类似的效果。 CRISPR-Cas技术已经在基因功能研究、动物模型建立、基因治疗等领域得到广泛的推广和应用,有力地推动了相关领域的研究进展。     

新一代基因编辑工具研究进展

目前,以核酸酶为主要成分的基因编辑工具已经成功实现可编程地对哺乳动物基因组进行靶向突变或插入删除,从锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）、CRISPR/Cas系统发展到更安全更精准的Cas9融合蛋白基因编辑工具和其他核酸酶基因编辑工具,本文系统阐述了基因编辑的发展演进历程、介绍了新一代基因编辑工具的开发与优化,针对基因编辑工具的临床应用与面临的挑战进行了展望。     

CRISPR-Cas9的原理及其应用进展

［摘要］CRISPR-Cas9技术是近年来发展迅速的一项基因定点修饰技术．该技术基于规律性短重复回文序列簇（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat, CRISPR）和Cas9核酸酶（CRISPR associated system9,Cas9）构成的CRISPR-Cas9系统而形成．CRISPR-Cas9系统是广泛存在于细菌和古生菌中的一种免疫机制．因为该机制可通过特异结合并剪切DNA片段的方式,有效帮助菌体抵御包括噬菌体和质粒在内的一系列外源性DNA侵染．故而近年来受到很多研究人员的关注,并被大量用于基因的定点修饰．目前该技术已经成功应用于多种生物基因修饰与治疗．多项研究结果表明该技术较其他同类技术具有明显的高效性、准确性,对基因工程有着极大的促进作用和广泛的应用前景．对该技术原理及应用进展进行综述．     

CRISPR/Cas9基因编辑技术:基因剪刀—重写生命密码的工具——2020年诺贝尔化学奖简介

2020年诺贝尔化学奖授予了Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A. Doudna博士,以表彰她们在“发展了基因组编辑技术”方面做出的贡献。本文对CRISPR/Cas9结构、原理进行了系统介绍,简要回顾了CRISPR/Cas9技术的发现及发展过程,最后对CRISPR/Cas9技术面对的前景、挑战与争议进行了展望。     

CRISPR/Cas9文库筛选技术的发展及在肿瘤研究中的应用

近年兴起的CRISPR/Cas9［Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）9］技术因其能快速、简便、精准地实现基因敲除、敲入、激活、干扰等编辑功能而成为一种强大的遗传筛选工具,目前已在各类细胞系和小鼠及斑马鱼等多种动物模型中得到大规模运用。利用CRISPR系统构建基因组文库进行高通量筛选,是研究疾病特别是肿瘤靶标基因的主要策略。本文就CRISPR/Cas9文库筛选技术的原理和发展,脱靶效应的改进方案,文库筛选的基本流程以及近年来该技术在肿瘤研究中的应用进行总结。