Shox2基因转染后犬骨髓间充质干细胞HCN4表达的变化

目的 探讨矮小同源盒基因亚型2(short stature homobox 2,Shox2)外源基因对犬骨髓间充质干细胞(canine mesenchymal stem cells,cMSCs)体外诱导分化的影响.方法 分离培养犬骨髓间充质干细胞,用包装好的两种慢病毒载体pLentis-mShox2-RFP及pLentis-RFP分别转染第3代cMSCs,收集转染阳性的cMSCs与乳鼠心肌细胞(rat ventricular myocytes,NRVMs)共培养.实验分4组:A组(RFP-cMSCs组)、B组(RFP-cMSCs+ NRVMs共培养组)、C组(Shox2-RFP-cMSCs组)、D组(Shox2-RFP-cMSCs+NRVMs共培养组).共培养诱导分化5d后,利用嘌呤霉素对cMSCs进行纯化,运用全细胞膜片钳检测诱导出内向电流的动力学特征,运用实时荧光定量PCR、Western blot检测HCN4、Tbx3、Cx45/43、Nkx2.5等标志性基因mRNA和蛋白的表达情况,并行免疫荧光检测.结果 Western blot及RT-PCR检测结果显示,D组细胞Shox2、HCN4、Tbx3、Cx45窦房结细胞特异性基因的表达较A、B、C组明显增高(P＜0.05),B组细胞Cx43及Nkx2.5较C、D组细胞明显增高(P＜0.05);免疫荧光结果显示,在Shox2基因调控作用下,cMSCs有HCN4通道生成;膜片钳检测结果显示,C、D组细胞产生了具有明显时间-电压依赖性的内向电流,且对细胞外Cs+敏感,符合起搏离子流Ⅰf的动力学特征;而A、B组未检测出此电流.结论 经mShox2基因修饰的cMSCs通过体外诱导,产生了起搏离子流Ⅰf并高表达窦房结标志性基因,成功向具有一定自主搏动能力的窦房结样细胞分化.     

ISL-1诱导脂肪干细胞向起搏样细胞分化

目的 探讨过表达胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1)的慢病毒在体外转染脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),能否诱导ADSCs向起搏样细胞分化。方法 取第3~5代ADSCs,随机分成Bank.mCherry和胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1)3组,按分组分别转染病毒,经荧光强度和流式分析确定最适感染复数,与乳鼠心室肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRVMs)共培养7天后进行实时荧光定量聚合酶式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR).蛋白质印迹.免疫荧光检测分析,期间观察细胞形态和搏动频率变化,并用膜片钳技术记录细胞内电流活动。结果 分离贴壁后的ADSCs呈长梭形,慢病毒转染ADSCs的最适感染复数为50。ISL-1组ADSCs形态呈多样化,窦房结特异性基因HCN4.Cx45和Tbx3的mRNA表达水平上调,而工作心肌特异性基因Nkx2.5下调,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。ISL-1组大多数细胞可检测到HCN4表达并且可记录到超极化内向电流。结论 经ISL-1基因修饰的ADSCs通过体外心肌微环境诱导,产生了一定的高表达窦房结标志性基因并具有细胞内典型超极化电活动的起搏样细胞。     

HCN4与生物心脏起搏的基础研究现状

HCN4作为超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因家族亚型,被认为是心脏起搏细胞产生自动节律重要基础,其中超极化激活电流(funny current,If)是重要的起搏调控部分,HCN家族基因参与编码If电流,由于HCN4与心脏起搏的产生和调节关系密切,所以被称为起搏基因.     

腺病毒介导超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4过度表达对乳鼠心肌细胞电生理特性的影响

目的观察过度表达超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型(HCN)4对乳鼠心肌细胞电生理特性的影响。方法酶解法分离20只乳鼠的原代心肌细胞并进行培养,用含HCN4基因的重组腺病毒AdHCN4感染心肌细胞,以未感染细胞作为对照组,通过RT-PCR及细胞免疫荧光方法检测心肌细胞中HCN4基因在mRNA和蛋白质水平的表达,用全细胞膜片钳方法测定转染HCN4基因的心肌细胞的动作电位和起搏电流If。结果AdHCN4感染组心肌细胞中HCN4mRNA和蛋白质的表达水平明显高于对照组细胞;感染组心肌细胞自发搏动的频率为(92·5±7·4)次/分,明显高于对照组心肌细胞的(68·9±6·2)次/分(P<0·05);动作电位出现明显的4相自动除极化,其最大舒张电位(-52·8±4·2)mV明显高于对照组细胞(-62·1±2·6)mV(P<0·05);动作电位复极50%和90%的时间两者比较差异无统计学意义;在感染组细胞中,起搏电流If的电流密度为(115·7±7·8)pA/pF,也明显高于对照组细胞的(7·2±0·6)pA/pF(P<0·05)。结论过度表达起搏通道基因HCN4能够明显增强乳鼠心肌细胞的自律性,从而增加心肌细胞自发搏动的频率,这提示HCN4基因有可能成为治疗缓慢性心律失常疾病的目的基因。     

外源性Nkx2.5、GATA4促进大鼠骨髓间充质干细胞的心肌分化

目的:心脏早期转录因子Nkx2.5、GATA4转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨Nkx2.5、GATA4对大鼠BMSCs向心肌细胞分化的作用和影响。方法:全骨髓法分离、纯化、扩增培养SD大鼠BMSCs,流式细胞术联合检测第三代细胞表面分子,CD90+/CD29+/CD45-细胞达95%以上。采用阳离子转染试剂LipofectamineTM2000将p EGFP-N1-Nkx2.5、p VP22-GATA4/myc-His质粒转染BMSCs。结果:转染4周后,Western blotting、免疫细胞化学结果表明,与空质粒组、空白对照组相比,Nkx2.5、GATA4显著提高转染组大鼠心肌细胞肌钙蛋白T(cardiac troponin T,c Tn T)、连接蛋白43(connexin43,Cx43)的表达。免疫细胞化学结果显示Nkx2.5转染组、GATA4转染组中部分细胞呈c Tn T、Cx43阳性,c Tn T阳性细胞的胞质中可见棕黄色丝网状及颗粒样结构,Cx43阳性细胞的细胞质中可见棕褐色颗粒。透射电镜观察各组细胞超微结构变化,转染组大鼠心肌细胞的细胞质内出现大量平行排列的肌丝样结构,细胞侧面或细胞末端可见较多缝隙连接。结论:外源性Nkx2.5、GATA4能够促进BMSCs向心肌细胞分化。     

大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征

目的 研究大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)基因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征.方法 利用脂质体介导大鼠HCN4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体,转染HEK293细胞进行扩增,用逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)检测HCN4 mRNA表达,采用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞上HCN4电流.结果 大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞,记录到一系列超极化内向离子流,该电流呈电压、时间依赖性,没有明显的失活,在-150 mV时电流幅值为(540±24.1)pA,电流密度为(9.6±0.7)pA/pF(n＝12),半激活电压(V1/2)为(-105.7±12.0)mV,稳态激活曲线斜率(k)为-15.7mV,HCN4电流翻转电位为(-84.0±7.9)mV.结论 应用脂质体转染方法成功进行了起搏通道HCN4基因的异源性表达.     

上调白血病骨髓基质细胞GJIC功能对Jurkat细胞药物敏感性的影响

目的 观察上调白血病骨髓基质细胞间隙连接细胞间通讯(GJIC)功能对共培养的人急性淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat)细胞药物敏感性的影响.方法 体外培养白血病骨髓基质细胞,转染Cx43基因,罗氏黄染料传输法检测转染后骨髓基质细胞的GJIC功能变化;将Jurkat细胞与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养,观察共培养的Jurkat细胞对化疗药物甲氨蝶呤(MTX)药物敏感性的改变.结果 转染Cx43基因的白血病骨髓基质细胞的GJIC功能明显增加;与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞在MTX作用下的存活率(61.3±3.24)%较未转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞(82.4±3.12)%明显下降;与转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞在MTX作用下的凋亡率(48.1±3.78)%较与未转染Cx43基因的骨髓基质细胞共培养的Jurkat细胞(18.5±3.43)%明显增加,差异有统计学意义(P<0.01).结论 上调白血病骨髓基质细胞GJIC功能能够增加共培养的Jurkat细胞对化疗药物的敏感性.     

经尿道灌注SCL和GJA1基因慢病毒对糖尿病膀胱病变中CD117和Cx43蛋白及其mRNA表达的影响

目的：探索灌注干细胞白血病SCL和GJA1基因慢病毒对糖尿病膀胱病变中CD117(c-kit)和Cx43蛋白及其mRNA表达的影响。方法：选取70只健康成年雄性豚鼠，称量体重在300～400 g之间，一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)200 mg/kg,浓度1%,构建豚鼠糖尿病膀胱模型，经尿流动力学筛选出26只成模型豚鼠。随机将24只糖尿病膀胱模型豚鼠分为4组，每组6只：阴性对照组(n=6)、Cx43组(n=6)、CD117组(n=6)、CD117+Cx43组(n=6)。阴性对照组将未携带基因的慢病毒+PBS液0.2 ml单次经尿道灌注，CD117组单次经尿道灌注SCL基因重组慢病毒药物(滴度2×10⁷U)0.2 ml, Cx43组单次经尿道灌注GJA1基因重组慢病毒药物(滴度2×10⁷U)0.2 ml, CD117+Cx43组单次经尿道灌注SCL+GJA1基因重组慢病毒药物(滴度2×10⁷U)0.2 ml。灌注结束后迅速结扎尿管至2 h后解除尿管。各组的糖尿病豚鼠膀胱在结束灌注后第14天时于无菌操作和全身麻醉下取出，将...     

窦房结细胞自律性与超极化激活起搏电流关系的研究进展

窦房结是正常心脏活动的起搏点,在心脏传导系统中自律性最高,窦房结细胞的自动除极是其自律性产生的基础,多种离子通道及相应电流参与窦房结细胞自律性活动,其中超极化激活环核苷酸门控通道(HCN)及其电流(If)在窦房结细胞自律性产生过程中起着重要作用,HCN通道共有HCN1~4四个亚型,在心脏窦房结细胞中HCN4是主要的亚型,负责形成If,HCN4及相关If对窦房结自律性有着重要的影响。     

缝隙连接蛋白及其阻断剂研究进展

缝隙连接是细胞间的主要连接方式,广泛分布于心肌细胞及神经细胞等。细胞间电活动的传递主要是通过缝隙连接来完成,丰富的、通道阻抗小的缝隙连接构成了细胞间电偶联的基础。缝隙连接蛋白Cx43是构成心室缝隙连接通道的结构基础,与心房颤动、风湿性心瓣膜病等心脏疾病密切相关。缝隙连接蛋白Cx36介导的缝隙连接通路在癫痫、神经元损伤等神经系统疾病中扮演着重要角色。在中枢神经系统中,缝隙连接蛋白Cx36是唯一在神经元特异性表达的缝隙连接蛋白,尤其在海马的CA1、CA3、CA4等区高度表达,Cx36可能在癫痫电活动方面发挥重要作用。缝隙连接蛋白介导通道的通透功能具有较高的可塑性,可以被很多因素调控。应用缝隙连接阻断剂可减轻缝隙连接相关疾病的症状,在心脏、神经系统疾病新药研发中具有重要作用。因此,缝隙连接阻断剂有可能成为相关疾病治疗的研究热点。本文就心肌细胞及神经细胞缝隙连接蛋白的典型代表Cx43、Cx36及其阻断剂的研究进展进行综述。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

肝干细胞－卵圆细胞的研究进展

卵圆细胞是肝脏干细胞的代表细胞,主要存在于幼肝及成人受损的肝脏中,是一种双潜能的肝脏干细胞,多种因素调节其分化,在此过程中动态表达一系列表面标志物。卵圆细胞的分化异常与肝癌的发生关系密切。在体外大量扩增卵圆细胞并使之分化为成熟的 有功能的肝细胞,为终末期肝病、肝脏的组织工程研究及基因治疗开辟了新的途径。 