骨髓间充质干细胞移植对缺血再灌注大鼠脑神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响.方法:SD大鼠84只,随机分为假手术组(n=12)、模型组(n=24)、磷酸盐缓冲液(PBS)组(n=24)和MSCs组(n=24).模型组、PBS组和MSCs组采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型,假手术组除不插尼龙线外,其余步骤相同.PBS组和MSCs组分别于建模成功后24 h分别经颈动脉注入等体积的PBS液和已制备好的同种异体MSCs悬液.每组于脑缺血2 h再灌注2 d、4 d、6 d、8 d时行神经功能缺损评分及脑灌注固定取材,采用免疫组化染色及TUNEL检测脑组织Bcl-2、Bax蛋白的表达及凋亡细胞数.结果:假手术组在各时间点神经功能评分为0分,无神经功能缺损,未见细胞凋亡,未见Bcl-2和Bax表达.与模型组和PBS组比较,脑缺血2 h再灌注4 d开始,MSCs组神经细胞凋亡数、Bax蛋白表达和神经功能缺损评分较低,Bcl-2蛋白表达较高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞移植能改善脑损伤大鼠的功能;上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,减少神经细胞凋亡,可能是其主要机制之一.     

谷氨酰胺联合脐血间充质干细胞移植在大鼠肠缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨谷氨酰胺联合脐血间充质干细胞(MSCs)移植在大鼠肠缺血再灌注损伤中作用。方法体外复苏并培养脐血间充质干细胞移植前备用,观察CM-Di I荧光标记后脐血间充质干细胞的去向。80只SD大鼠随机分为正常对照组,缺血再灌注损伤组,谷氨酰胺组,MSCs移植组及联合组每组各15只。对照组采用生理盐水灌肠,损伤组采用TNB(S乙醇稀释)灌肠,在TNBS建模后1 h,谷氨酰胺组于尾静脉输入谷氨酰胺0.45 g/kg、MSCs移植组于尾静脉输入1×10~(10)/L脐血间充质干细胞悬液,联合组尾静脉输入谷氨酰胺0.45 g/kg+脐血间充质干细胞悬液1×10~(10)/L。通过ELISA法检测各组大鼠血清中肠脂肪酸结合蛋白(IFABP)、白介素-6(IL-6)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量;各组于再灌注1 h、3 h后检测肠组织含水率;通过RT-PCR、Western blot观察大鼠肠黏膜上皮细胞caspase-3、NF-k B、Bcl-2在谷氨酰胺联合MSCs移植后的mRNA和蛋白的表达情况。结果通过荧光示踪法观察到移植的MSCs细胞分布于肠粘膜淋巴组织内和腺上皮细胞间,表明MSCs可能参与了肠缺血再灌注损伤的修复过程。各组大鼠血清中SOD、IFABP、IL-6的含量变化比较,损伤组血清中IFABP、IL-6的含量较对照组显著增加,而谷氨酰胺组,MSCs移植组及联合组与之比较,则显著减少,联合组减少更为明显,损伤组血清中SOD的含量较对照组显著减少,而谷氨酰胺组,MSCs移植组及联合组与之比较,则显著增高,联合组增高更为明显(P0.05)。再灌注1 h和3 h,损伤组肠组织含水率均明显高于对照组;与损伤组相比,谷氨酰胺组、MSCs移植组及联合组肠组织含水率值均显著降低,联合组降低更为明显,而谷氨酰胺组、MSCs移植组差异无统计学意义(P0.05)。与对照组比较,损伤组肠黏膜上皮细胞caspase-3、NF-k B的mRNA和蛋白表达明显上调,Bcl-2的mRNA和蛋白表达明显下调(P0.05),而谷氨酰胺组、MSCs移植组及联合组与之比较,caspase-3、NF-k B的mRNA和蛋白表达明显下调,Bcl-2的mRNA和蛋白表达明显上调(P0.05),谷氨酰胺组及MSCs移植组之间无统计学差异(P0.05),但两组与联合组比较,差异明显(P0.05)。结论谷氨酰胺组及MSCs移植后,明显减轻了大鼠肠缺血再灌注损伤程度,其可能通过抑制caspase-3、NF-k B表达和促进Bcl-2表达减轻肠黏膜缺血再灌注损伤。     

脐带间充质干细胞移植对急性脑缺血/再灌注损伤大鼠脑组织内CD_(31)及白细胞介素6的作用

目的探讨脐带间充质干细胞(UC-MSCs)对急性脑缺血/再灌注损伤脑组织内CD_(31)和白细胞介素6(IL-6)的影响。方法 24只SD大鼠随机分为对照组、缺血/再灌注组以及缺血/再灌注+干细胞治疗组,每组8只。对照组为仅在颈内动脉下穿线不结扎;缺血/再灌注组为结扎30 min后恢复血流灌注;缺血/再灌注+干细胞治疗组为结扎30 min后恢复血流灌注,并给予干细胞干预治疗,即将2×10~6脐带干细胞通过尾静脉注射途径输注至大鼠体内。采用免疫组织化学、反转录聚合酶链反应和Western blot技术等检测各组缺血脑组织内CD_(31)和IL-6的变化。结果三组实验大鼠脑组织中IL-6 mRNA和CD_(31)mRNA及其蛋白表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较情况:与对照组相比较,脑缺血/再灌注组大鼠IL-6 mRNA、IL-6蛋白水平升高,缺血/再灌注组+干细胞治疗组降低(P<0.05);与缺血/再灌注组比较,缺血/再灌注组+干细胞治疗组IL-6 mRNA、IL-6蛋白水平降低(P<0.05)。与对照组相比较,缺血/再灌注组和缺血/再灌注组+干细胞治疗组的CD_(31)mRNA、CD_(31)蛋白水平均升高,且缺血/再灌注组+干细胞治疗组高于缺血/再灌注组(P<0.05)。结论行UC-MSCs移植术治疗大鼠急性脑缺血/再灌注损伤可有效提高CD_(31)的表达,改善损伤区域血管重建,并通过降低IL-6的表达水平有效抑制炎症进展。     

骨髓间充质干细胞诱导为神经样细胞后对大鼠脑缺血模型修复的研究

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导为神经样细胞后对大鼠脑损伤模型修复的情况。方法:取大鼠骨髓作骨髓间充质干细胞的分离和传代培养,贴壁法分离MSCs,并诱导其分化,将经诱导的细胞直接注射移植到大鼠脑缺血模型大鼠的脑组织,检测分化的神经细胞样细胞在神经系统微环境中存活及病理变化。结果:细胞移植组病理变化与脑损伤模型组相比,神经细胞变性、坏死数量明显变少,间质水肿较轻。结论:骨髓间充质干细胞诱导为神经样细胞后移植能改善脑损伤大鼠的功能。     

骨髓间充质干细胞移植对缺血再灌注大鼠脑神经细胞凋亡及survivin、caspase-3蛋白表达的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)移植对缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞凋亡及存活蛋白(survivin)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达的影响.方法 健康SD大鼠42只,随机分为假手术组(n=6)、磷酸盐缓冲液(PBS)组(n=18)和MSC组(n=18).PBS组和MSC组采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型,假手术组除不插入尼龙线外,其余步骤相同.PBS组和MSC组分别于建模成功后3 h分别经尾静脉注射等体积的PBS液和已制备好的同种异体MSC悬液.每组于脑缺血90 min再灌注1 d、3 d、6 d时分别采用Western blot及免疫组化方法检测缺血侧脑组织survivin和caspase-3蛋白的表达,运用TUNEL方法检测细胞凋亡.结果 假手术组无神经功能缺损,未见细胞凋亡及未见survivin和caspase-3蛋白表达.与PBS组比较,MSC组于脑缺血90 min再灌注1 d开始,caspase-3蛋白表达减少,再灌注3 d开始,神经细胞凋亡数较少,神经功能缺损评分较低,survivin蛋白表达较高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞移植能改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能,上调survivin蛋白表达,下调caspase-3蛋白表达,减少神经细胞凋亡,推测可能是其作用机制之一.     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的 研究经静脉移植的骨髓间充质干细胞(MSCs)在缺血大鼠脑组织的分布、改善神经功能的情况及对凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响.方法 体外培养扩增MSCs后,用绿色荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记,静脉途径移植给大脑中动脉缺血2 h再灌注的SD大鼠,观察各组的神经功能,观察MSCs在脑内的分布,...     

人骨髓间充质干细胞定向移植对局灶性脑缺血大鼠行为学的影响

目的：探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响。方法：采用密度梯度分离法、贴壁筛选法体外培养、扩增人MSCs，并用流式细胞术鉴定其免疫学表型；健康Wistar大鼠50只随机均分为正常对照组(A组)、假手术组(B组)、脑缺血/再灌注后无处理组(C组)、脑缺血/再灌注后移植无血清DMEM组(D组)、脑缺血/再灌注后移植人MSCs组(E组)，每组10只。D、E两组脑缺血周边区(右侧)分别移植无血清培养基5 μL和5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记MSCs (4×10⁵• μL^-1) 5 μL；采用免疫组化技术检测BrdU 标记的人MSCs在局灶性脑缺血大鼠体内存活情况；采用前肢不对称 应用试验及姿势反射试验，观察各组大鼠术后1、3、7及28 d行为学变化。结果：成功地分离并纯化人MSCs；流式细胞术检测P3 MSCs结果显示，CD44、CD29均呈阳性表达，CD34、CD45、CD31均呈阴性表达；移植的人MSCs在局灶性脑缺血大鼠缺血周边区聚集并存活。各组大鼠行为学评分随着细胞移植后时间延长均逐渐降低，移植人MSCs组大鼠行为学评分较其他组显著降低 (P<0.05)，该组大鼠移植人MSCs后7 d时行为学评分低于同组内其他时间点(P<0.01)。结论：局灶性脑缺血周边注射人MSCs显著地改善大鼠脑缺血症状，前肢不对称应用试验可更客观地评价大鼠长时间运动功能变化。     

脑缺血再灌注损伤后神经细胞干细胞因子mRNA表达

目的:观察神经细胞干细胞因子(SCF)mRNA在大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时间,不同部位的表达情况。方法:成年SD大鼠,以线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO模型),随机分为缺血1.5h、再灌注2h至14d组和假手术组。原位杂交技术检测脑缺血再灌注后脑组织不同部位的SCFmRNA表达情况。结果:脑缺血再灌注后,SCFmRNA的表达在皮质区及纹状体区均明显高于假手术组,于7d达高峰,14d下降。结论:脑缺血再灌注后SCFmRNA表达在脑内不同部位、不同时间具备同样的规律,可能具有促进内源性神经干细胞的增殖作用。     

间充质干细胞移植脑缺血区GDNF及受体表达变化

目的：观察骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)后胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）及其受体GFRα1、c-Ret表达的影响。方法：用线栓法建立大鼠MCAO模型,随机分为MSCs移植组、盐水组和假手术组。移植后1、3、5和7 d应用免疫组织化学和原位杂交技术检测GDNF及其受体的表达。结果：与盐水组和假手术组比较,移植组缺血周边区可见GDNF阳性表达细胞增多。移植后第7天移植组GDNF在缺血周边区的表达高于盐水组和假手术组（P<0.05）。移植组的皮层、海马及底节等部位均可见GFRα1、c-Ret mRNA 的阳性表达细胞,且多见于细胞形态完整的神经元,范围集中在缺血周边区。随时间延长,GFRα1、c-Ret mRNA表达细胞增多,在第7天时表达最多,与其他两组比较差异有显著性（P<0.05）。结论：MSCs移植入脑组织可能分泌和(或)促进神经细胞分泌GDNF,并增加缺血周边神经元表达GDNF及其受体,从而起到脑保护作用。     

三维球体间充质干细胞移植对大鼠缺血再灌注损伤脑组织TNF-α及凋亡相关蛋白表达的影响

目的 观察三维(3-D)球体间充质干细胞(MSCs)移植对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)及凋亡相关蛋白表达的影响,探讨3-D球体MSCs的神经保护作用及可能机制。 方法 实验大鼠随机分为假手术组、溶剂对照组、3-D球体MSCs治疗组(n=36),假手术组常规分离大脑中动脉(MCA)但不结扎,MSCs治疗组采用线栓法建立大脑中动脉缺血(MCAO)模型后给予MSCs移植,溶剂对照组模型建立成功后给予等体积溶剂对照。各组大鼠分别于移植治疗后1、3、7 d进行神经功能评分;采用ELISA和RT-PCR方法检测大鼠脑组织中的TNF-α表达;采用免疫组化SABC法染色,观察损伤侧大鼠脑组织Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达。 结果 与假手术组、溶剂对照组相比,MSCs治疗组大鼠神经运动功能评分降低(P <0.05);与假手术组相比,溶剂对照组大鼠脑组织TNF-α、Caspase-3和Caspase-8表达增加(P <0.01);与溶剂对照组相比,MSCs治疗组脑组织TNF-α、Caspase-3、Caspase-8表达下降(P <0.05,P <0.01)。 结论 3-D球体MSCs移植可能通过下调脑组织中炎性因子TNF-α含量及减少凋亡相关蛋白的表达,改善大鼠脑缺血再灌注损伤后神经运动功能。     

电刺激对脑梗死大鼠运动功能恢复及Nogo-A、NgR表达的影响

目的探讨单侧和双侧电刺激对脑梗死大鼠梗死灶周围Nogo-A、Nogo受体(NgR)表达和神经功能恢复的影响及作用机制,为电刺激在脑梗死治疗及康复中的应用提供理论依据。方法利用线栓法制作大鼠局灶性脑梗死模型,将造模成功且存活的脑梗死大鼠分为对照组、单侧电刺激组、双侧电刺激组（各32只）,另外假手术组32只、正常组8只。对照组、假手术组自然恢复;单、双侧电刺激组接受电刺激治疗。于第1、3、7、14、21d利用平衡木实验检测各组大鼠神经功能情况,第3、7、14、21d利用免疫组化检测梗死灶周围皮质Nogo-A和NgR阳性蛋白的表达。结果电刺激治疗的大鼠运动功能的恢复较对照组明显改善（P＜0.05）,双侧电刺激组恢复优于单侧电刺激组。正常组与假手术组各时间点Nogo-A和NgR表达差异无统计学意义（P＞0.05）,脑梗死后第3、7d对照组Nogo-A的表达明显高于假手术组,电刺激后Nogo-A的表达较对照组下降（P＜0.05）,双侧电刺激组较单侧电刺激组下降（P＜0.05）。脑梗死后3?d至21d对照组与假手术组NgR表达差异无统计学意义（P＞0.05）,电刺激后NgR表达较对照组下降,双侧电刺激组NgR的下降较单侧电刺激组明显。结论电刺激能够促进脑梗死大鼠神经功能的恢复,双侧电刺激效果优于单侧电刺激,下调Nogo-A和NgR的表达可能是其促进运动功能恢复的机制之一。     

环孢素对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元的保护作用

目的:通过观察应用环孢素对大鼠坐骨神经切断后脊髓前角运动神经元GAP-43mRNA的表达,研究环孢素对脊髓前角运动神经元的影响。方法:60只大鼠随机分为实验组和对照组,实验组进行环孢素干预,在3、7、14、21、28天,5个不同的时相点各从实验组和对照组中随机抽取6只大鼠,取下脊髓T12-L1节段,脊髓前角GAP-43mRNA的表达用荧光定量RT-PCR检测。结果:对照组GAP-43mRNA第3日呈低表达,第7天表达量增加,第14天表达量达到高峰,第21天表达量下降,第28天表达量接近第3天水平。实验组第3、7和14天表达量与对照组相似,第21和28天表达量较对照组有所提高,经统计学处理,第3、7和14天实验组与对照组比较,差异无显著性(P>0.05),第21天和28天实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:应用环孢素对坐骨神经损伤后脊髓运动神经元有一定的保护作用,可延缓神经元的退变。     

实时聚合酶链反应检测切割穹窿海马伞大鼠海马内磷脂酰乙醇胺结合蛋白mRNA的表达变化

目的探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）mRNA的表达差异。方法42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹隆海马伞后1、3、7、14、21及28d组,每组6只。提取各组大鼠的海马组织总RNA,应用实时PCR技术观察切割穹窿海马伞后海马中PEBPmRNA的表达变化。结果PEBPmRNA在切割后3d表达开始上升,7d达最高水平,随后缓慢下降,21d时降至正常。结论切割穹窿海马伞后海马中PEBP的高表达可能与诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化的海马神经再生有关。     

RT-PCR/Southern杂交法检测穹窿海马伞切割大鼠海马Brn-4 mRNA的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法:42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹窿海马伞后1、3、7、14、21及28d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用RT-PCR/Southern杂交方法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA的表达变化。结果:海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3d开始升高,14d达到最高水平,随后下降,28d左右恢复至正常水平。结论:切割穹窿海马伞后海马内Brn-4mRNA表达明显上调,可能与促进海马内移植的或自体的神经干细胞向神经元分化有关。     

强制性运动疗法对大鼠脑缺血再灌注后神经修复及Rh0激酶表达的影响

目的探讨脑卒中后强制性运动疗法(CIMT)对大鼠脑缺血再灌注后行为功能及大脑皮质缺血区Rho激酶表达的影响。方法健康雌性SD大鼠75只,随机分为强制性运动疗法组(CIMT组)25只,缺血再灌注组(I/R组)25只和假手术组(Sham组)25只,对前两组大鼠用线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型。3组大鼠再随机分为缺血再灌注后7,14,21,28和35d时处死组。各组动物在处死前行神经功能缺损评分(Bederson评分),水迷宫试验和平衡木试验,并采用Western blot方法检测Rho激酶的表达。结果与I/R组比较,在脑缺血再灌注术后14d和21d,CIMT组的肢体运动平衡能力及记忆功能明显恢复;在缺血侧大脑皮质中Rho激酶的表达,CIMT组在14d和21d时的表达明显低于I/R组。结论强制性运动疗法可以改善脑缺血再灌注后的神经功能,其在分子水平上发挥作用可能和下调Rho激酶的水平有关。     

三七三醇皂苷对局灶脑缺血再灌注大鼠不同恢复时期脑组织Nogo-A mRNA和蛋白表达的影响

目的:观察局灶性脑缺血再灌注后Nogo-A mRNA和蛋白表达的动态变化,以及三七三醇皂苷(PTS)对其影响。方法:将健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和药物干预组(PTS组),采用Longa线栓法制备大脑中动脉阻塞与再灌注大鼠短暂局灶性脑缺血模型。药物干预后,采用RT-PCR结合免疫组织化学技术检测大鼠缺血再灌注后不同时期(3 d,7 d)脑组织Nogo-A mRNA和蛋白的表达。结果:模型组Nogo-A mRNA和蛋白表达在缺血再灌注损伤后3 d时下降,7 d时上升。PTS组在3 d时大脑皮层和海马Nogo-A表达比模型组低,但差异无显著性意义(P0.05);7 d时Nogo-A表达明显低于模型组,差异有显著性意义(P0.01)。结论:PTS可使缺血再灌注大鼠的Nogo-A表达下降,这可能是其发挥脑保护作用的机制之一。     

电针对脊髓损伤大鼠 Nogo/NgR 信号通路相关因子基因表达的影响

目的观察电针对脊髓损伤大鼠Nogo/NgR信号通路相关因子基因表达变化,探讨电针治疗脊髓损伤的可能作用机制。方法大鼠随机分为模型组、电针组、阻断剂组、电针+阻断剂组、假手术组,用改良Allen’s撞击法制备T10脊髓损伤模型,分别于治疗后1、7、14 d对各组大鼠进行BBB功能评分;在7、14 d于损伤处提取脊髓组织,以蛋白印迹法(Western blot)测定各组大鼠脊髓组织中Nogo-A、NgR、LINGO-1蛋白的表达变化,实时荧光定量PCR测定Nogo-A、NgR、LINGO-1 mRNA的表达变化。结果脊髓损伤后,造模大鼠1 d后BBB评分均为0分;治疗7、14 d后,各治疗组BBB评分均明显高于模型组(P0.05),且电针+阻断剂组优于电针组、阻断剂组(P0.05)。与假手术组比较,同时间点模型组各基因表达均明显提高(P0.05);与模型组比较,各治疗组基因表达明显下降(P0.05);电针+阻断剂阻组与电针组比较,同时间点LINGO-1基因表达有显著差异(P0.05)。结论 Nogo/NgR信号通路在脊髓损伤后神经的再生与修复过程中起着关键作用,电针通过抑制Nogo/NgR信号通路而对脊髓损伤大鼠起治疗作用。     

HMGB-1联合MSCs移植对急性心肌梗死大鼠心脏功能影响的实验研究

目的 研究高迁移率组蛋白-1(HMGB-1)联合骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对于大鼠发生急性心肌梗死后心功能的影响及其相关作用机制.方法 将144只雄性SD大鼠分为健康对照组、模型对照组、MSCs移植组、HMGB-1注射组、HMGB-1注射+MSCs移植组及HMGB-1 BoxA注射+MSCs移植组等6组,术后第28天对大鼠的心脏功能、心肌的病理切片、心肌梗死的面积及梗死区新生血管的密度进行检测.并在心肌梗死术后第3、7、28天测定血清中相关细胞因子的水平.结果 在术后第28天,HMGB-1注射+MSCs移植组较其余5组的左心室舒张末期内径和左心室收缩期内径明显缩小,左心室短轴缩短率和射血分数明显增加(P＜0.05);HMGB-1注射+MSCs移植组梗死面积与其余模型组相比明显缩小(P＜0.05),梗死区的新生血管数目显著增加(P＜0.05).在术后第3天和第7天,HMGB-1注射+MSCs移植组的大鼠血清TLR4、VEGF水平最高(P＜0.05);术后第7天及第28天,HMGB-1注射+MSCs移植组大鼠的血清中白细胞介素6、核因子Kappa及肿瘤坏死因子α的水平最低(P＜0.05).结论 通过使用HMGB-1注射联合MSCs移植的治疗方法可以有效改善心肌梗死预后.