乳源免疫调节肽通过泛素-蛋白酶体途径抑制卵巢癌耐药性及其机制研究

目的 研究乳源免疫调节肽(PGPIPN)抑制卵巢癌耐药性及其机制.方法 MTT法检测PGPIPN与抗癌药顺铂(DDP)联合用药抑制人卵巢癌敏感细胞株(SKOV3)、耐药细胞株(SKOV3-DDP)和原代卵巢癌细胞的半数抑制浓度(IC50)和细胞增殖抑制率,PCR法和Western blot法检测人卵巢癌细胞株和原代卵巢癌细胞用药情况下泛素-蛋白酶体途径相关基因的表达.结果 PGPIPN和DDP联合用药细胞增殖抑制率显著高于单独DDP组或PGPIPN组,差异有统计学意义( P＜0. 05),PCR和Western blot结果表明 PG-PIPN通过调节泛素-蛋白酶体途径相关基因表达降低卵巢癌细胞的耐药性. PGPIPN促进SIAH和PSMA1 表达,降低β-catenin基因的表达(P ＜0. 05,P ＜0. 01),且有剂量依赖性.结论 PGPIPN通过泛素-蛋白酶体途径降低卵巢癌细胞对DDP的耐药性.     

肝/肾/骨型碱性磷酸酶基因ALPL抑制卵巢癌细胞系SKOV3增殖的研究

目的 研究肝/肾/骨型碱性磷酸酶基因(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)在卵巢癌细胞株中的表达及其对卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响.方法 通过qRT-PCR检测ALPL在不同卵巢癌细胞株(HEY、SKOV3、8910、ES-2、OVCAR3、3AO、A2780)mRNA中的表达,并与正常卵巢组织进行比较.在低表达ALPL的卵巢癌细胞株SKOV3中外源性过表达ALPL,通过MTT法、平板克隆实验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期.通过建立裸鼠皮下种植瘤模型,观察过表达ALPL的SKOV3细胞在体内的成瘤能力.结果 ALPL在卵巢癌细胞中的mRNA表达低于正常卵巢组织(P＜0.01),外源性过表达ALPL可抑制SKOV3细胞的增殖和克隆形成率(P＜0.01),阻滞细胞G1期向S的转化,并抑制肿瘤细胞的成瘤能力(P＜0.05).结论 ALPL表达的恢复可以明显抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖及成瘤能力.     

茶多酚对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖及顺铂敏感性的影响

目的 探讨茶多酚(TP)对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖及顺铂(DDP)敏感性的影响.方法 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测单独使用不同浓度TP、DDP及低毒剂量TP联合DDP对人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖抑制作用,分别计算抑制率、半数抑制浓度(IC50)及增敏倍数.结果 TP、DDP单药均以剂量依赖的方式抑制卵巢癌细胞株SKOV3的增殖.低毒剂量的TP联合DDP作用于细胞后,增殖抑制率明显增加,IC50由单用DDP时的6.555 mg/L下降到3.021 mg/L,敏感性提高到单用DDP的2.17倍.结论 TP对人卵巢癌细胞株SKOV3有生长抑制作用,低毒剂量TP与DDP联合应用可提高SKOV3细胞对DDP的敏感性,减少DDP的用量.     

褪黑素联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用

目的：探讨褪黑素（MLT）、顺铂（DDP）单独及联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用,为MLT作为卵巢癌化疗辅助药物的研究提供理论依据。方法：将体外培养至对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞分为对照组、单用MLT组（0.5、1.0和2.5 mmol/L）、单用DDP组（25和50 mg/L）、联合应用MLT及DDP组（MLT 0.5 mmol/L联合DDP 25 mg/L; MLT 0.5 mmol/L联合DDP 50 mg/L;MLT 1.0 mmol/L联合DDP 25 mg/L;MLT 1.0 mmol /L联合DDP 50 mg/L;MLT 2.5 mmol/L联合DDP 25 mg/L;MLT2.5 mmol/L联合DDP 50 mg/L）。应用显微镜观察法、MTT法测定用药后卵巢癌SKOV3细胞的凋亡及增殖抑制率,并采用免疫化学方法测定卵巢癌SKOV3细胞用药后的血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果：显微镜下观察结果显示用药组细胞贴壁能力减弱、变小变圆、折光性减弱、细胞皱缩、核固缩、染色质凝集、核碎裂。联合用药组凋亡细胞增多;MTT 法检测结果显示0.5、1.0和2.5 mmol/L-1的MLT单独应用或与25和50 mg/L的DDP联合应用均有抑制细胞生长作用（P<0.05）,且随浓度升高抑制率升高,联合用药组两药物间均有协同作用,两药相互作用指数（CDI）＜1;免疫化学染色法显示单用药组及联合用药组VEGF表达较对照组均降低,联合用药组VEGF表达明显降低（P<0.05）。结论：MLT对卵巢癌细胞生长有抑制作用,MLT联合DDP对VEGF表达下调有协同作用,提示适当浓度的MLT配伍DDP作用于卵巢癌细胞SKOV3可达到较好疗效。     

内质网应激反应与人卵巢癌细胞顺铂耐药性关系的实验研究

目的:探讨顺铂敏感的人卵巢癌SKOV3细胞与顺铂耐药的卵巢癌SKOV3/DDP细胞之间内质网应激的差异及其与顺铂敏感性的关系。方法:采用人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞,给予顺铂进行体外实验。Hochest33342染色,激光共聚焦显微镜观察细胞核形态。免疫荧光结合免疫印迹技术检测内质网应激标志蛋白Grp78和PDI的表达。用钙离子敏感的荧光探针Flour-4/AM和Rhod-2/AM分别检测人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞浆和线粒体钙离子含量变化。结果:MTT法检测人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞生存率,两种细胞对顺铂的敏感性存在明显差异,SKOV3细胞对顺铂敏感性显著高于SKOV3/DDP细胞;Hochest33342染色结果显示顺铂(6μg/ml)作用24h,可以引起SKOV3细胞发生明显的凋亡,而SKOV3/DDP细胞无明显变化;顺铂作用SKOV3细胞,导致Grp78和PDI的表达明显增加,内质网应激介导的凋亡信号分子CHOP、Caspase-4表达增加,线粒体Cyt C的释放以及Caspase-3的活化增加,而SKOV3/DDP细胞无明显变化;顺铂作用于SKOV3细胞,引起胞浆和线粒体钙离子含量的显著增加,而SKOV3/DDP细胞无显著变化。结论:顺铂敏感性不同的人卵巢癌细胞,其在顺铂作用下的内质网应激反应存在显著差异,顺铂敏感的细胞其内质网应激强度高,并且其在顺铂作用后的胞浆和线粒体钙离子明显升高,内质网应激途径和线粒体途径凋亡被激活,这些结果表明卵巢癌顺铂耐药可能与内质网应激耐受有关。     

小鼠白介素-12在人卵巢癌SKOV3中的抗肿瘤作用

目的观察转染至SKOV3卵巢癌细胞中小鼠IL-12全长基因的质粒能稳定表达相关细胞因子基础上,在脾细胞存在的情况下对SKOV3肿瘤细胞的杀伤作用.方法MTT方法检测对SKOV3卵巢癌细胞增殖的影响,免疫组化法检测SKOV3卵巢癌细胞表面IL-12蛋白的表达.结果转染后癌细胞免疫组化可见IL-12表达,在脾细胞的作用下,MTT结果显示IL-12对SKOV3卵巢癌细胞有抑制其增殖的作用,P＜0.05.结论成功地将IL-12基因转染至SKOV3卵巢癌细胞中并稳定表达相关细胞因子,在脾细胞存在情况下对SKOV3细胞有抑制其增殖作用,从而杀伤卵巢癌细胞,具有抗肿瘤作用.     

Rac1蛋白在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞株SKOV3增殖及迁移的作用

目的 研究Rac1蛋白在人卵巢浆液性腺癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞株SKOV3恶性增殖和迁移的影响.方法 Western blot检测人卵巢浆液性腺癌组织、卵巢良性浆液性囊腺瘤组织及卵巢正常组织中Rac1蛋白的表达水平;构建Rac1表达缺失的细胞株SKOV3-Rac1i;分别用细胞划痕实验、MTT及平板克隆实验检测SKOV3-Rac1i细胞迁移能力、细胞增殖及克隆形成能力.结果 卵巢浆液性腺癌组织中Rac1蛋白表达水平显著高于卵巢良性浆液性囊腺瘤组织[(0.89 ±0.17)vs(0.69 ±0.24),P＜0.05]和卵巢正常组织[(0.89±0.17) vs (0.72±0.12),P＜0.05];与亲代细胞相比,SKOV3-Rac1i细胞表现出迁移能力减弱(P＜0.05)和增殖能力明显受限(P＜0.05).结论 Rac1在人卵巢浆液性腺癌组织中呈高表达,其可能是通过影响细胞迁移能力及细胞的增殖而促进卵巢癌细胞的恶性生物行为.     

晶状体蛋白αB对卵巢癌细胞恶性行为的影响

目的 研究晶状体蛋白αB(αB-crystallin)在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞SKOV3增殖及迁移侵袭能力的影响.方法 免疫组织化学法检测人正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中αB-crystallin表达;针对蛋白αB-crystallin的基因(CRYAB基因)设计合成靶向小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)重组慢病毒,并感染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3;流式细胞仪、平板克隆、MTT检测细胞凋亡和增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达.结果 αB-crystallin在卵巢癌组织中表达高于正常卵巢组织,在Ⅱ型卵巢癌组织中呈明显高表达(P＜0.01),稳转CRYAB siRNA慢病毒后SKOV3细胞内αB-crystallin蛋白表达降低64％,其凋亡和增殖无明显改变,但SKOV3细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制(P＜0.01),同时蛋白MMP-2和MMP-9表达下调(P＜0.01).结论 αB-crystallin能够影响卵巢癌SKOV3细胞浸润转移,其在Ⅱ型卵巢癌组织中的高表达可能与其高侵袭潜能相关.     

CIK细胞对卵巢癌化疗耐药的逆转作用及对ERCC表达的影响

目的 探讨细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞在杀伤人卵巢癌耐顺铂(DDP)细胞株(SKOV3/DDP)的效应当中是否存在着逆转化疗耐药作用及其对切除修复交叉互补基因组1(ERCC1)、切除修复交叉互补基因组2(ERCC2)表达的影响.方法 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测DDP、CIK细胞、无毒剂量CIK细胞联合顺铂对人卵巢癌亲本细胞株(SKOV3)和SKOV3/DDP的体外杀伤活性.实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和Western-blot分别检测经无毒剂量CIK细胞作用下两组细胞中ERCC1、ERCC2基因表达的变化.结果 DDP和CIK细胞对SKOV3、SKOV3/DDP两组细胞均有杀伤效应,且随DDP浓度和效靶细胞比值的升高呈依赖性增加;与单纯DDP作用相比,无毒剂量CIK细胞联合DDP对SKOV3/DDP细胞具有较明显的协同作用(P＜0.05).CIK细胞作用SKOV3/DDP细胞后,靶细胞中ERCC1 mRNA和蛋白的表达量较干预前降低,差异有统计学意义(P＜0.05);ERCC2 mRNA和蛋白的表达量较干预前降低,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CIK细胞可以部分逆转SKOV3/DDP细胞对DDP的耐药性,且CIK细胞逆转SKOV3/DDP的耐药作用可能与ERCC1表达下调有关联,而与ERCC2表达下调无关联.     

miR-9和miR-210在卵巢癌SKOV-3及SKOV-3/DDP细胞株中的表达及机制探讨

目的 检验miR-9和miR-210在卵巢癌SKOV-3及SKOV-3/DDP细胞株中的差异表达,观察其对卵巢癌细胞生物学功能的影响并探讨其作用机制,为卵巢癌的靶向治疗积累数据,提供参考方向。 方法 培养人正常卵巢上皮细胞株,卵巢癌SKOV-3和SKOV-3/DDP细胞株,RT-PCR(实时荧光定量聚合酶链反应)检验miR-9和miR-210在各细胞株中的表达差异;将miR-9mimics和miR-210mimics转染至卵巢癌SKOV-3及SKOV-3/DDP中,用CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V/PI法测细胞凋亡,细胞划痕实验测细胞迁移能力的改变及细胞侵袭实验测细胞侵袭情况。 结果 miR-9在SKOV3及其耐药株SKOV-3/DDP中低表达,而miR-210在SKOV3及其耐药株SKOV-3/DDP中高表达;miR-9/miR-210过表达抑制3种细胞的增殖;miR-9/miR-210过表达促进细胞发生凋亡;miR-9/miR-210过表达导致3种细胞迁移和侵袭能力下降。 结论 miR-9/miR-210在卵巢癌细胞中起到抑癌基因的作用,过表达miR-9/miR-210能显著抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进肿瘤细胞的凋亡;miR-9/miR-210可以作为卵巢癌及复发性卵巢癌新的潜在治疗靶点。