ox-LDL对PLGF作用内皮细胞释放NO和内皮细胞黏附分子的影响

目的：探讨氧化型低密度脂蛋白对胎盘生长因子-1作用人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮和内皮细胞黏附分子的影响。方法：在ox-LDL（25μg／mL）条件下,应用不同浓度的PLGF-1（20、40、80ng／mL）孵育ECV-304,对照组为内皮细胞未受损时,相同浓度梯度的PLGF-1孵育ECV-304,3h、6h、12h、24h后应用ELISA法检测内皮细胞黏附分子-可溶性细胞间黏附因子-1、可溶性血管内皮细胞黏附因子-1的表达,硝酸盐还原酶法检测NO的表达。结果：正常生理条件下,PLGF诱导NO和内皮细胞黏附分子的表达,且呈时间（当t=6h达到最理想的分泌量）、浓度依赖关系。在氧化损伤条件下,PLGF诱导NO的表达下降,而内皮细胞黏附分子的表达则增高,以VCAM-1表达增多更为明显。结论：氧化损伤是动脉粥样硬化的独立危险因素,而PLGF诱导内皮的活化,上调内皮黏附分子的表达,可进一步促使疾病的恶化。故认为抑制PLGF的生物活性可达到控制炎症反应的作用。     

氨氯地平对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞MCP-1 mRNA表达的影响

目的观察氨氯地平对氧化型低密度脂蛋白（ox—LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（hUVEC-12）单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）mRNA表达的影响,以进一步探讨氨氯地平抗动脉粥样硬化的作用机制。方法筛选ox—LDL与hUVEC-12细胞孵育合适的处理浓度与时间,然后用不同浓度氨氯地平（0、0．1、1．0、10．0μmol／L）预孵育hUVEC-12后,与ox—LDL共同孵育,RT—PCR检测细胞MCP-1 mRNA表达的变化情况。结果筛选出ox—LDL与hUVEC-12共同孵育的合适浓度为50mg／L,时间为24h。氨氯地平可下调MCP-1 mRNA的表达,并且对其表达的影响呈现浓度依赖性。结论氨氯地平可下调ox—LDL诱导的人脐静脉内皮细胞MCP-1 mRNA的表达。     

ox-LDL对内皮细胞CD40信号表达的影响及黄芪甲苷的抗炎作用

[目的]观察氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)对体外培养的血管内皮细胞(ECV-304)CD40信号的影响及黄芪甲苷的抗炎作用。[方法]100 mg/L ox-LDL刺激ECV-304细胞24 h后,以实时定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)测定细胞CD40 mRNA和蛋白的表达,酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、可溶性血管细胞间黏附因子-1(sVCAM-1)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的含量。以拮抗性抗CD40抗体,抑制CD40的作用后,再次观察上清液TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8的含量变化。20μg/mL的黄芪甲苷预孵育4 h,再以100 mg/L ox-LDL刺激ECV-304 24 h,测定细胞CD40 mRNA、CD40蛋白的表达及上清液TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8的含量。[结果]1)ox-LDL上调细胞CD40 mRNA和CD40蛋白的表达。2)ox-LDL促进细胞分泌TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8;而抑制CD40蛋白则抑制细胞分泌TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8。3)黄芪甲苷下调CD40 mRNA、CD40蛋白表达,抑制内皮细胞分泌TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8。[结论]黄芪甲苷通过抑制CD40信号下调ox-LDL所致内皮细胞炎症介质的表达,是其抗动脉粥样硬化的潜在机制。     

小凹介导氧化低密度脂蛋白跨内皮细胞转运

目的探讨小凹在氧化低密度脂蛋白（ox—LDL）逆向转运中的作用机制。方法用40μg／mLox—LDL处理人脐静脉内皮细胞（hUVEC）不同时间（0、6、12、24h）,高效液相色谱法观察细胞内脂质含量变化。用nocodazole阻滞cavolae运动后,荧光倒置显微镜观察FITC标记的氧化低密度脂蛋白受体（Lox-1）在细胞内的定位。将人脐静脉内皮细胞种植于transwell培养系统套3i／1．上层,分别用3种小凹阻滞剂carrageenan、filipin、no—codazole预处理细胞1h后加入40岬l／mLDiI荧光标记的ox—LDL（DiI—ox—LDL）于套皿上层孵育24h,取套皿下层液体用荧光分光光度计测荧光强度值。结果人脐静脉内皮细胞与ox—LDL孵育时,细胞荷脂呈时间依赖性增加。同时ox—LDL导致Lox-1向胞浆聚集,而nocodazole可阻止Lox-1向胞浆的聚集。小凹阻滞剂明显阻滞ox—LDL的跨内皮细胞转运分别达49％、72％和80％。结论内皮细胞可摄取ox—LDL而荷脂,其摄取ox—LDL的受体Lox-1定位于小凹中,小凹在介导ox—LDL的跨内皮细胞转运过程中起运载工具的作用。     

Ox-LDL诱导血管内皮细胞表达LOX-1

【目的】探讨血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（LOX-1）作为氧化低密度脂蛋白（OX—LDL）的特异性受体在摄取ox-LDL后对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）表达LOX-1的影响以及LOX-1在ox-LDL诱导其自身表达中所起的作用。【方法】用天然低密度脂蛋白（n—LDL）、LOX-1的受体阻断剂聚肌苷酸[poly（I）250μg／mL和爱兰苔胶carrageenan）以及不同质量浓度的ox—LDL（0，10，20，50，100μg／mL）与HUVECs作用于不同的时间（0，6，12，24，36h），用Realtime RT—PCR测定LOX-1 mRNA的表达水平，用Western blot测定LOX-1蛋白表达水平，并比较加入LOX-1阻断剂前后LOX-1表达的变化。【结果】在HUVECs中加入不同质量浓度的ox—LDL（0，10，20，50，100μg／mL），各组剂量的ox—LDL都可以增加LOX-1 mRNA和蛋白的表达（P〈0．01），在10—50μg/mL的剂量范围内有明显的剂量-效应关系。但n—LDL对LOX-1的表达无影响。随着ox—LDL与HUVECs作用时间的延长，LOX-1 mRNA和蛋白的表达显著升高（P〈0．01），在6～24h内呈明显的时间-效应关系（P〈0．01）。HUVECs预先与250μg/mL的poly（I）或carrageenan作用2h，然后再加入50μg／mL的ox—LDL作用24h。poly（I）和carrageenan都可以显著抑制ox—LDL诱导的LOX-1 mRNA和蛋白的表达（P〈0．01）。【结论】Ox—LDL可以诱导HUVECs LOX-1的表达，该诱导作用可被LOX-1的阻断剂部分拮抗。表明LOX-1不仅特异性地结合ox—LDL，而且介导ox—LDL对LOX-1表达的上调作用。     

一种新的2型糖尿病血管并发症细胞研究模型:葡萄糖、胰岛素、低密度脂蛋白联合诱导血管内皮细胞损伤的研究

目的观察不同浓度的葡萄糖、胰岛素和氧化型低密度脂蛋白（ox—LDL）对内皮细胞的协同损伤作用，建立一种2型糖尿病血管并发症体外内皮细胞损伤模型。方法采用L9（3^4）正交设计方法，将生长融合状的血管内皮细胞（ECV-304）随机分为9组，分别施加不同浓度的葡萄糖、胰岛素和ox—LDL条件液，培养24h后观测细胞活性、细胞一般形态学和超微结构改变以及细胞凋亡情况。结果显微镜下见模型组细胞回缩变圆，轮廓分明，细胞内出现粗糙颗粒样变化；线粒体肿胀，嵴丢失，内质网结构模糊、肿胀，呈小泡状；琼脂糖凝胶电泳可见模型组有明显的细胞凋亡典型的阶梯状区带电泳图谱（DNA Ladder）。结论三因素对细胞有协同损伤作用，可以诱导细胞发生凋亡和细胞器结构发生变化，含100mg／L ox—LDL、20mmol／L葡萄糖和100mU／L胰岛素的混合条件培养液对细胞的损伤最显著，可作为糖尿病血管并发症体外内皮细胞损伤模型的合适诱导条件液。     

脱氢表雄酮对氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞表达VCAM-1的影响

目的探讨雄激素脱氢表雄酮（DHEA）对氧化低密度脂蛋白（ox—LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的影响。方法体外培养HUVECs，采用免疫细胞化学、Western blot、原位杂交等方法，观察不同浓度DHEA（1，5，50μmol／L）对ox—LDL诱导的HUVECs表达VCAM-1的影响。结果ox—LDL诱导培养HUVECs后，HUVECs VCAM-1表达明显升高，预先用DHEA处理HUVECs可使VCAM-1的表达降低（P〈0．01），且这种降低呈浓度依赖性。结论DHEA能浓度依赖性地抑制ox-LDL诱导的HUVECs VCAM-1的表达。     

姜黄素抑制ECV304细胞增殖及对基质金属蛋白酶2表达的影响

目的：探讨姜黄素对人脐静脉内皮细胞（ECV304）的作用以及对ECV304表达的基质金属蛋白酶2（MMP-2）的影响。方法：采用MTT法，台盼蓝染色法测定姜黄素对ECV304的量效关系和时效关系，Giemsa染色观察姜黄素对ECV304的抑制作用；通过RT-PCR检测姜黄素作用ECV304后MMP-2mRNA表达，明胶酶谱法检测MMP-2的活性，免疫组化检测细胞MMP-2表达。结果：姜黄素对ECV304的押制作用呈浓度依赖性和时间依赖性，Giemsa染色显示浓度为8μg/mL和10μg／mL的姜黄素可诱导ECV304凋亡，凋亡率分别是21．6％和34．7％；在10μg／mL姜黄素作用24h下，MMP-2的mRNA显著减少，其分解明胶的活性也显著降低，免疫组化显示与阴性对照组相比内皮细胞MMP-2表达减少。结论：姜黄素能够抑制血管内皮细胞的生长、降低血管内皮细胞MMP-2的表达。     

ox-LDL对巨噬细胞表达miRNA-155和miRNA-146a／b的影响

目的：探讨氧化低密度脂蛋白（ox—LDL）刺激对巨噬细胞表达miRNA-155和miRNA-146a／b的影响。方法：培养人巨噬细胞,随机分为三组：空白对照组、ox-LDL（10μg／mL）组和OX—LDL（20μg／mL）组,刺激6h后,收集细胞,实时定量PCR方法检测miRNA-155和miRNA—146a／b的表达。结果：OX—LDL刺激可以增加巨噬细胞表达miRNA-155和miRNA-146a／b,且呈浓度依赖性。结论：miRNA-155和miRNA-146a／b可能参与ox-LDL致动脉粥样硬化过程。     

IL-6对血管内皮细胞活性及TF mRNA表达的影响

目的研究IL-6对脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）组织因子（TF）的mRNA水平的影响．方法应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养，用第二、三代细胞进行试验。测定IL-6（0．5ng／mL）处理前后细胞活性，反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测细胞内TFmRNA水平。结果72h内，IL-6对HUVECs的活性的影响与正常对照组相比差异无统计学意义。IL-6作用HUVECs6h即诱导TFmRNA表达，12h达到高峰，以后表达减弱，72h不能检测到mRNA；对照组TF mRNA不表达或表达极弱。结论IL-6（0．5ng／mL）对HUVECs的活性不造成直接的影响，同时在24-48h内IL-6（0．5ng／mL）可诱导HUVECs TF表达，这可能与IL-6作为前炎症因子诱导急性炎症反应时相的血液循环障碍相关。     

同型半胱氨酸诱导内皮细胞炎症损伤及金雀异黄酮的保护作用机制探讨

目的:探讨金雀异黄酮(genistein,GEN)对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导的内皮细胞毒性和炎症的抑制作用及其分子机制。方法:采用MTT法检测细胞活性,倒置显微镜观察细胞形态变化,酶联免疫吸附法(ELISA)检测相关炎症分子白细胞介素-6(IL-6)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)。结果:单独加5.0 mmol/L的Hcy组活力最差,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。显微镜下见对照组细胞呈单层鹅卵石样紧密排列,细胞状态良好,而Hcy 5.0 mmol/L组细胞排列杂乱,凋亡增多,状态也最差。ELISA结果发现,与对照组比较,5.0 mmol/L的Hcy能显著增强IL-6及ICAM-1表达(P<0.01)。然而GEN(10、50、100μmol/L)能够增强细胞活力,显著抑制由Hcy介导的IL-6及ICAM-1表达的增强,大大改善细胞状态,尤其是100μmol/L的GEN(P<0.01)。结论:GEN对Hcy介导的内皮细胞毒性及炎症反应有明显的抑制作用。     

血管紧张素-(1-7)对巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子表达的影响

目的探讨血管紧张素(Ang)-(1-7)是否可以调节巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子的表达及TLR4/NF-κB通路在其中的作用。方法佛波酯(130 ng/ml)诱导人单核细胞(THP-1)分化为巨噬细胞,分别以不同浓度(0.01、0.1、1μmol/L)的Ang-(1-7)和相同浓度氧化低密度脂蛋白(ox-LDL,50 mg/L)联合刺激,并以A-779[Ang-(1-7)特异性受体阻断剂,10-7 mol/L]预处理以及用TLR4单克隆抗体(5 mg/L)阻断TLR4/NF-κB信号通路。ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)的含量。实时PCR检测TLR4的mRNA水平,免疫印迹法检测细胞总蛋白TLR4蛋白水平、IκB蛋白的磷酸化水平以及胞浆蛋白、核蛋白NF-κB蛋白水平。结果与对照组比较,Ang-(1-7)干预下调泡沫细胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达,呈现剂量依赖性(P0.05),其作用可被A-779部分抑制;当TLR4/NF-κB信号通路被TLR4单克隆抗体阻断后,Ang-(1-7)作用可被部分抑制。Ang-(1-7)干预下调泡沫细胞TLR4mRNA和蛋白表达水平,下调IκB蛋白的磷酸化水平,抑制NF-kB蛋白由细胞质向细胞核内转位(P0.05),其作用可被A-779部分抑制。结论 Ang-(1-7)可以抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,该过程与TLR4/NF-κB信号转导通路抑制有关。     

同型半胱氨酸对血管内皮细胞凋亡和核因子-κB活化的影响

目的:观察同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉内皮细胞株ECV-304细胞凋亡及核因子-κB (NF-κB)活化的影响,以探讨Hcy致动脉粥样硬化的可能机制。方法:将不同浓度的Hcy与ECV-304细胞体外共培养不同时间,PI单染法检测细胞凋亡,免疫组织化学染色法检测细胞内Bcl-2的表达及NF-κB的细胞内定位,流式细胞术检测细胞核NF-κB的表达。结果:Hcy可诱导细胞凋亡,凋亡指数随Hcy浓度增大和作用时间的延长而逐渐升高;10.0 mmol/L Hcy作用24 h后Bcl-2表达阳性细胞的均数显著低于1.0、5.0 mmol/L组和对照组(P < 0.01);随Hcy浓度的升高,NF-κB由细胞质转位至细胞核,5 mmol/L Hcy作用0.5、1、2 h,NF-κB的核内表达率分别为(16.76±2.55)%、(12.91±1.38)%、(14.15±1.74)%。结论:Hcy可下调抗凋亡基因Bcl-2的表达而诱导细胞凋亡,且存在剂量效应关系。Hcy可活化NF-κB,且呈现剂量依赖性。     

阿托伐他汀通过下调PAPP-A、MMP3mRNA表达抑制rhCRP诱导的人动脉平滑肌细胞炎症反应

目的：探讨阿托伐他汀（ATO）对人重组C反应蛋白（rhCRP）诱导的人动脉平滑肌细胞炎症反应的影响及其机制是否与下调妊娠相关性血浆蛋白-A（PAPP-A）、基质金属蛋白酶3（MMP3）mRNA表达相关。方法：应用不同浓度rhCRP（1、5、10、20mg／L）处理人动脉平滑肌细胞不同时间（3、6、12、24h）,采用ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-8水平．以确定炎症模型建立条件。不同时相点加入10μmol／LATO后,ELISA法再次检测IL-6、IL-8水平;RT-PCR法测定FAPP-A、MMP3mRNA表达水平。结果：不同浓度rhCRP处理人动脉平滑肌细胞不同时间后,人动脉平滑肌细胞培养基中的IL-6、IL-8呈浓度依赖性和时间依赖性增加（P〈0．05）。采用10mg／LrhCRP处理12h作为人动脉平滑肌细胞炎症模型建立的条件。ATO10．7moL／L预处理、共处理均能有效抑制rhCRP所致的IL-6、IL-8升高（P〈0．05）,同时也能抑制rhCRP所致的PAPP-A、MMP3mRNA表达升高（P〈0．05）;而ATO后处理组IL-6、IL-8水平及PAPP-A、MMP3mRNA表达水平与rhCRP模型组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：ATO具有抑制rhCRP诱导的人动脉平滑肌细胞炎症反应的作用,此作用可能与其下调PAPP-A、MMP3mRNA表达有关。     

金黄色葡萄球菌诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的观察

目的观察人脐静脉内皮细胞株ECV．304对金黄色葡萄球菌（S．aureus）感染的反应。方法常规方法制备金黄色葡萄球菌悬液,以1：1、1：10和1：100的感染复数感染ECV．304细胞1、3、6、12h和24h后,估算细胞吞噬细菌数,采用Hoechst33258染色,DNAladder及细胞凋亡相关因子RT．PCR检测细菌感染后细胞凋亡情况。结果金黄色葡萄球菌感染复数越高,细胞内吞噬的活细菌数越多。金黄色葡萄球菌感染导致ECV-304细胞发生凋亡,凋亡具有时间依赖性,随着感染时间的延长,凋亡小体增多,DNA片段也随之增多。抗凋亡细胞因子Bcl2mRNA表达量随着感染时间的延长下降,而促凋亡细胞因子Bax和Caspase．3表达量增多。结论金黄色葡萄球菌感染ECV-304细胞后,通过下调抗凋亡细胞因子Bcl2、上调促凋亡细胞因子Bax和Caspase-3诱导细胞凋亡。金黄色葡萄球菌感染内皮细胞的可能致病机制为临床治疗提供了实验依据。     

膝骨关节炎患者滑液中炎症因子的表达及其与中医证型的相关性分析

目的分析膝骨关节炎（KOA）不同中医证型患者关节滑液中炎症因子水平及其与膝骨关节炎中医证型的相关性。方法90例KOA患者（119膝）根据中医辨证分为肾虚髓亏型、阳虚寒凝型及瘀血阻滞型。抽取关节液标本,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA法）测定基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、组织型金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）水平。Pearson相关性检验分析其与中医证型、年龄、病程之间的关系。结果阳虚寒凝型患者MMP-13、IL-1、TNF-α水平明显高于肾虚髓亏型及瘀血阻滞型（P〈0．05）,TIMP-1水平明显低于肾虚髓亏型及瘀血阻滞型（P〈0．05）;相关性分析提示MMP-13、IL-1、TNF-α水平与年龄和病程呈正相关（P〈0．05）,TMP-1水平与年龄和病程呈负相关（P〈0．05）。结论不同中医证型的KOA患者炎症因子水平存在差异,阳虚寒凝型患者炎症因子水平较肾虚髓亏及瘀血阻滞型患者高,说明此类型的患者软骨组织免疫炎症反应处于一个高度激活的状态：年龄大、病程长的患者炎症因子水平较年龄小、病程短的患者高,提示KOA患者应该注意早期防治,以减少关节腔内炎症反应对膝关节的损伤。     

高血压合并糖尿病患者血清粘附因子与炎性因子水平及相关性研究

目的 探讨高血压合并糖尿病患者血清粘附因子与炎性因子水平及并进行相关性分析.方法 选择高血压患者164例,为单纯高血压组（A组）,高血压合并糖耐量受损组（B组）,高血压合并糖尿病组（C组）,同时选择同期进行健康体检的40例为对照组（D组）,分别检测各组ICAM-1、VCAM-1、MMP-9、IL-6、IL-8、TNF-α水平.结果 A组VCAM-1较对照组差异有统计学意义（P＜0.05）,B组ICAM-1、VCAM-1、MMP-9较D组均差异有统计学意义（P＜0.05）,C组ICAM-1、VCAM-1、MMP-9较D、A组均差异有统计学意义（P＜0.05）.A组IL-8较D组差异有统计学意义（P＜0.05）,B组IL-6较D组均差异有统计学意义（P＜0.05）,IL-8、TNF-α较D、A组差异有统计学意义（P＜0.05）,C组IL-6、IL-8较D、A、B组均出现升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,TNF-α较D、A组升高,差异有统计学意义（P＜0.05）.IL-6与ICAM-1、VCAM-1呈显著正相关（P＜0.05）,IL-8与ICAM-1、VCAM-1、MMP-9呈显著正相关（P＜0.05）,TNF-α与ICAM-1、VCAM-1呈显著正相关（P＜0.05）.结论 血糖水平升高可加重高血压患者血清粘附因子与炎性因子水平紊乱,增加心血管并发症风险.     

低温缺氧条件下脂质体介导的寡核苷酸对人脐静脉内皮细胞-304的转染

目的 研究在Euro-Collins溶液(ECs)中,低温(4 ℃)缺氧条件下体内阳离子脂质体转染剂(In vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)在人脐静脉内皮细胞株ECV-304中的转染效率。方法 (1) 将ECV-304在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中以37 ℃、5% CO₂的条件培养,待生长至单层融合后,进行试验。(2) 使用前配制脂质体-ODN复合物,脂质体与ODN 的+/-电荷比率为2。(3) 应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在ECs中、4 ℃条件下,ODN浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25 μmol/L时,缺氧保存2、4、6、8 h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照组,观察对ECV-304的转染效率。结果 在ECs中、4 ℃缺氧保存条件下,随着保存时间的延长和脂质体-ODN浓度的升高,ECV-304的MFI增强,保存6 h后MFI基本达到了最大强度,并且大部分ODN均位于细胞核内;而ODN的细胞摄取率无差异。但与裸转染相比,MFI和细胞摄取率均有显著差异性。结论 在ECs中和低温缺氧条件下,脂质体可以高效地将NF-κB decoy ODN转染到ECV-304细胞核,为供体器官在基因调控水平的保护研究提供了实验依据。