药用大黄全长转录组测序分析及Ⅲ型聚酮合成酶家族基因鉴定

目的 利用全长转录组测序技术挖掘药用大黄蒽醌类成分合成中的关键酶Ⅲ型聚酮合成酶（PKS Ⅲ）家族基因。方法 利用PacBio Sequel Ⅱ平台进行药用大黄全长转录组测序，数据通过非冗余蛋白（NR）、Swiss-Prot、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、真核生物相邻类的聚簇（KOG）、基因本体（GO）数据库进行功能注释。筛选PKS Ⅲ家族基因全长并进行编码蛋白生物信息特征分析，借助MEGA 6.0构建PKS Ⅲ家族基因系统发育进化树。结合RNA-Seq数据分析，运用TBtools计算PKS Ⅲ家族基因的相对表达量。结果 共获得原始数据55.50 GB，52 960条高质量转录本，平均长度1 712.56 bp；50 007条Isoforms在NR、Swiss-Prot、KEGG和KOG数据库中得到注释。GO分类注释到生物过程、细胞组分和分子功能3个类别的65个小组。KEGG代谢通路共有17 637条转录本被注释于137条通路中，其中标准次生代谢通路15条。筛选到16个含开放阅读框的Isoforms，编码8个PKS Ⅲ家族基因，包括RoALS1-3（芦荟松合酶）、RoCHS1-3（查耳酮合酶）、RoSTS（二苯乙烯合酶）和RoPKS（聚酮合成酶）等，编码蛋白长度为391~393 aa，无信号肽或跨膜结构域，均定位于细胞质中。编码蛋白序列保守，磷酸化及糖基化位点和数目各异。大多数PKS Ⅲ家族基因Isoforms在药用大黄根和根茎中表达量高。药用大黄PKS Ⅲ家族基因与掌叶大黄、虎杖、拟南芥基因汇于一支，亲缘关系近。结论 获得药用大黄全长转录组信息特征，鉴定了8个药用大黄PKS Ⅲ家族基因，明确了序列及表达特征，为药用大黄蒽醌类成分合成的分子机制研究提供参考。     

基于转录组测序揭示光质对刺五加实生苗基因表达的调控作用

目的 对刺五加Acanthopanax senticosus实生苗进行转录组测序,分析其响应不同光质调控的分子机制。方法 以生长60 d的刺五加实生苗为材料,设置不同光质处理组（LED-1、LED-2）和对照组[高压钠灯（high pressure sodium,HPS）],应用Illumina HiSeq^TM对其叶片进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）筛选和共表达网络分析。结果 转录组测序共获得126 252条Unigene。其中92 681条被注释,3个处理组中筛选出DEGs 7664个。基因本体（gene ontology,GO）富集结果表明,DEGs在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）途径富集分析表明,DEGs显著富集在植物激素传导、糖代谢、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成。适度光质胁迫可以促进刺五加实生苗中苯丙素类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进刺五加有效成分累积的基础。结论 通过高通量转录组测序,揭示了不同光质对刺五加实生苗基因表达的调控特征,可为深入研究刺五加药效成分的生物合成机制及栽培中的光环境设置提供科学依据。     

党参不同组织化学成分分布及转录组学分析

目的 分析党参不同组织转录组特征，解析党参根中活性成分积累的遗传基础，为党参的高品质生产与种植提供理论依据。方法 选取盛花期党参根、茎、叶、花不同组织为实验材料，采用高效液相色谱法（HPLC）检测党参苷Ⅰ、党参炔苷、苍术内酯Ⅲ含量，利用RNA-Seq对不同组织进行转录组测序，通过基因本体（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库富集分析筛选分析差异表达基因，探讨党参不同组织化学成分分布特征及转录谱特征。结果 党参根中党参多糖及党参苷Ⅰ含量显著高于其他各组织。党参根转录谱与茎、叶、花存在显著差异，差异基因表达聚类分析、GO、KEGG富集分析发现差异基因主要富集在黄酮类、苯丙烷类生物合成、蔗糖淀粉代谢、植物激素信号传导、植物病原菌互作、MAPK级联信号传递、三磷酸腺苷结合转运盒（ABC）转运蛋白等途径。苯丙烷类化合物生物合成相关基因在根、花中表达量显著上调，ABC转运蛋白则多在花中高表达，党参多糖合成关键酶基因蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）、果聚糖1-外切水解酶（1-Feh）及大量与次生代谢产物积累密切相关的胁迫响应基因等在党参根中显著上调表达。结论 党参根中活性成分含量与转录谱特征与茎、叶、花等组织存在显著差异，表现出组织特异性，同时胁迫响应相关基因及活性成分菊粉型果聚糖、苯丙烷类化合物合成相关基因在根中表达上调。     

香附子全长转录组测序及生物信息学分析

目的 通过高通量测序技术获得香附子Cyperus rotundus L.全长转录组的信息特征,为深入挖掘香附子功能基因奠定基础。方法 通过PacBio Sequel高通量测序系统,对香附子根、茎、叶、花4个部位的混样进行全长转录组测序及生物信息学分析。结果 共获得195 722条环形一致性序列（CCS）获得188 243个高质量转录本,并注释了148 563个转录本,检测出4349个转录因子和95 118个简单序列重复（simple sequence repeat,SSR）位点,还预测到64 929个长链非编码RNA（lncRNA）和45 337个mRNA,并通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据途径分析了13个参与萜烯合酶合成相关的基因,以及7个参与β-石竹烯合成相关的基因。结论 获得了较为可靠的香附子全长转录组数据,这将显著增强对香附子发育过程中植物化学生物合成调控基础的理解,可为深入研究香附子生物学特性、相关代谢途径、信号通路及分子机制提供数据支持。     

基于高通量测序技术探讨补骨脂宁治疗肺癌的潜在机制

目的 探索补骨脂宁治疗肺癌的潜在分子机制。方法 利用不同浓度的补骨脂宁干预A549细胞,采用噻唑蓝（MTT）法、高通量测序技术、趋势分析、基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析的方法分别检测A549细胞的增殖能力,筛选补骨脂宁抑制A549细胞增殖的关键基因以及关键通路,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）对测序的结果进行验证,探讨补骨脂宁治疗肺癌的潜在机制。结果 补骨脂宁可明显抑制A549细胞的增殖,并调节细胞内4 364个基因的表达。通过趋势分析发现这些差异基因分别聚类在20个基因表达模式中,其中前4个基因表达模式具有统计学意义,且均为显著下调趋势,说明补骨脂宁主要通过抑制某些基因的表达,发挥抗增殖的作用;通过组间差异基因的比较,笔者发现随着补骨脂宁浓度的增加,下调基因也随之增加,细胞增殖趋势越加减弱,与趋势分析结果一致,因此,笔者着重分析高浓度补骨脂宁干预组的278个差异基因,GO分子功能结果显示,补骨脂宁主要改变细胞和代谢的过程,KEGG通路富集结果显示,补骨脂宁主要通过影响类固醇生物合成、脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、酮体的合成与降解和类固醇激素的合成等通路发挥作用,因此选取显著富集于脂质代谢通路并且P<0.01的差异表达基因LSS,硬脂酰基辅酶A脱氢酶（SCD）,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因（HMGCS1）,血管生成素样蛋白4（ANGPTL4）进行验证,Real-time PCR显示补骨脂宁可以抑制LSS,SCD,HMGCS1的mRNA表达,升高ANGPTL4的mRNA表达,与测序结果基本一致。结论 补骨脂宁主要通过靶向脂质代谢途径相关的代谢因子,抑制A549细胞增殖,从而达到治疗肺癌的作用。     

基于高通量测序的不同生态环境东方泽泻块茎转录组分析

目的 探索不同生态环境对东方泽泻生理活动及其药效成分原萜烷型三萜生物合成调控的分子基础。方法 通过Illumina HiSeq测序平台获取种植于福建和四川的东方泽泻块茎转录组数据并进行功能注释,基于|log₂FC|>0.58（FC为差异倍数）、P<0.05的筛选条件获得差异表达基因。结果 转录组测序共获得50 652条unigenes,有22 689条unigenes注释到京都基因与基因组百科全书（KEGG）、NR、SwissProt、COG、基因本体（GO）和Pfam数据库。从福建和四川2种环境生长的东方泽泻之间筛选到3878条差异表达基因,其中2082条在福建东方泽泻中上调表达,1796条在四川东方泽泻中上调表达,差异基因主要参与植物防御反应、光合作用、淀粉和蔗糖代谢、萜类生物合成等生理活动,包括5个原萜烷型三萜生物合成通路上的关键酶基因。此外,东方泽泻移栽四川后,与三萜生物合成相关的转录因子和细胞色素P450（CYP450）基因表达也发生了显著变化。结论 利用高通量测序技术和生物信息分析获得了不同生态环境下东方泽泻转录组信息特征,为阐明生态环境对东方泽泻原萜烷型三萜生物合成的调控机制提供参考。     

雪峰虫草子座不同生长发育时期的转录组研究

目的 挖掘调控雪峰虫草生长发育的相关通路和基因,揭示其子座生长发育的内在分子机制。方法 采用转录组测序技术（RNA-Seq）对雪峰虫草子座菌丝体（MD1）、子座原基（PD2）和子座（SD3）生长发育3个不同阶段进行测序;数据通过非冗余蛋白（NR）、Swiss-Prot、Pfam、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、真核生物相邻类的聚簇（KOG）、基因本体（GO）数据库进行功能注释。利用EdgeR软件进行差异表达基因分析,挖掘调控雪峰虫草子座生长发育的相关通路和基因。结果 测序结果显示,MD1、PD2、SD3分别获得了8.15、7.51、6.87 GB分析数据,拼接分析数据共获得34 218个转录本,平均长度为5502 bp,组装及去冗余后获得10 511条unigenes,平均长度为2470 bp。KOG功能注释和GO富集分析显示,细胞和细胞组分、新陈代谢过程、信号转导及碳代谢是雪峰虫草子座发育过程中的关键基因类别。对子座不同生长发育时期的基因进行差异表达分析发现,PD2和SD3相比差异表达基因最多,其中上调基因1073个,下调基因1036个,MD1和SD3相比差异表达基因最少,上调基因533个,下调基因578个。差异表达基因的KEGG通路富集结果显示,细胞外信号调节激酶（MAPK）信号通路是参与调节雪峰虫草子座生长发育的关键信号通路。结论 Ste2和Gpd1及其所在途径可能分别调控雪峰虫草子座原基的形成和子座的生长。     

SPR天然产物小分子抑制剂的“人工智能”药物筛选和“网络药理”作用机制研究＊

目的 基于“人工智能”药物筛选，获得墨蝶呤还原酶（SPR）的潜在小分子抑制剂。同时，针对最佳的候选SPR天然小分子抑制剂，利用“网络药理学”开展抗肿瘤作用机制探究。方法 首先，搜集多个平台数据构建天然小分子化合物库，利用“三重积分协同过滤计分系统”进行“人工智能”药物筛选，获得候选的SPR天然小分子抑制剂。随后，利用“分子对接”和中药系统药理学分析平台（TCMSP）系统分析，初步评价出最佳候选者。最后，通过SIB和STITCH数据库获得最佳抑制剂的作用靶标、蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络和网络拓扑参数，导入Cytoscape系统对网络进行分析，筛选关键靶标。通过DAVID数据库进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，预测其抗肿瘤作用机制。结果 筛选出候选抑制剂1783个；从得分前20的化合物中，分析筛选出刺囊酸可能最佳SPR天然产物小分子抑制剂；获得其关键靶点。GO富集结果表明刺囊酸可能主要涉及到RNA聚合酶II启动子的转录，细胞增殖的调控和G蛋白偶联受体信号途径等生物学过程；KEGG富集表明可能涉及癌症信号通路，蛋白多糖信号通路等。结论 天然小分子化合物可能是SPR抑制剂的重要来源，刺囊酸可能是最佳的SPR天然小分子抑制剂。总之，本研究可能为天然产物小分子抑制剂的研究开发提供启示。     

基于miRNA差异性探讨化毒三阴方对气虚质三阴乳腺癌PI3K/Akt/NF-κB通路的调控作用

目的 该研究旨在基于miRNA差异性探讨化毒三阴方对气虚质三阴乳腺癌（TNBC）患者磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核转录因子-κB（PI3K/Akt/NF-κB）信号通路的调控作用。方法 基于前期研究成果及利用生信分析方法,预测气虚质与平和质患者差异表达miRNA调控的靶基因,与TNBC靶基因取交集,并将交集靶基因进行京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析,分析其差异表达miRNA调控TNBC关键通路及靶基因。纳入完成西医标准治疗后气虚质TNBC患者,予化毒三阴方干预3年,收集服药前后患者外周血,检测其服药前后关键通路上基因的表达情况。结果 气虚质与平和质差异表达的miRNA共有49个,上调16个,下调33个,调控TNBC共1 445个靶基因,PPI和KEGG通路富集分析显示,关键基因主要有肿瘤蛋白p53（TP53）,蛋白激酶B1（Akt1）,表皮生长因子受体（EGFR）,丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）,血管内皮生长因子A（VEGFA）,肿瘤坏死因子（TNF）等,关键通路有PI3K/Akt,丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）,RAS信号通路等。共纳入11例气虚质TNBC患者,与服药前相比,服药后患者PI3K/Akt信号通路上NF-κB1,Akt1表达下调,编码PI3K基因（PIK3CA）,B细胞淋巴瘤-xL（Bcl-xL）表达上调。其中治疗前后NF-κB1,Akt1表达差异具有统计学意义。结论 化毒三阴方可调控气虚质TNBC患者的PI3K/Akt/NF-κB信号通路上的基因表达,使NF-κB1,Akt1表达下调,PIK3CA,Bcl-xL表达上调。     

基于HIF-1α/NLRP3途径介导细胞焦亡探讨《古今录验》续命汤治疗缺血性卒中的机制

目的 研究《古今录验》续命汤通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）途径调控缺血性卒中（IS）细胞焦亡的作用机制。方法 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、续命汤低剂量组、续命汤高剂量组和二甲双胍组,每组20只,连续灌胃3 d取材。采用高通量测序筛选差异信使RNA（mRNA）,对关键差异基因行基因本体（GO）功能及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析;改良神经功能评分（mNSS）法、2,3,5-氯化三苯四氮唑（TTC）染色评价脑梗死损伤效应;苏木素-伊红（HE）染色进行脑组织病理形态学观察;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测缺血侧脑皮质区白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）水平比较;荧光双标染色检测HIF-1α、NLRP3共定位情况;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测NLRP3、HIF-1α、胱天蛋白酶-1（Caspase-1）、消皮素D（GSDMD）mRNA的表达情况;蛋白免疫印迹法检测HIF-1α、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白的表达情况。结果 mRNA测序共得到5 705个（下调2 733个,上调2 972个）差异基因,经同源基因转化后,与焦亡基因集取交集,获得95个关键差异焦亡基因。与假手术组比较,模型组的mNSS评分、脑梗死面积显著增大（P<0.01）,神经元形态多样、排列错乱、细胞间隙增宽,缺血侧皮质区IL-1β、IL-18的含量显著增高（P<0.01）,共定位荧光强度明显增强,HIF-1α、NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白的表达水平显著升高（P<0.01）。与模型组比较,续命汤高剂量组改善大鼠神经功能评分、脑梗死面积最显著（P<0.01）;各药物组神经元较完整、排列较整齐、细胞间隙变窄,共定位荧光强度明显降低;续命汤能够降低IL-1β、IL-18的含量及HIF-1α、NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白的表达（P<0.05,P<0.01）,尤以高剂量组最明显（P<0.01）。结论 《古今录验》续命汤能够抑制IS后细胞焦亡,促进神经功能恢复,可能与抑制HIF-1α/NLRP3途径有关。