北沙参异戊烯基转移酶GlIPT1基因的克隆及生物信息学分析＊

目的 挖掘参与北沙参（Glehniae Radix）香豆素合成的关键酶异戊烯基转移酶（Isoprenyltransferase，IPT）基因，进一步分析该基因的序列特征及表达量模式。方法 本研究摸索了一种北沙参基原植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.）无菌苗制备方法，并且在珊瑚菜转录组测序数据的基础上，使用茉莉酸甲酯（MeJA）处理筛选出表达量上调的候选基因序列；利用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术对GlIPT1基因cDNA序列进行全长克隆；根据所得的氨基酸序列进行蛋白质理化性质、二级结构、三级结构分析；利用Clustalx及MEGA 6.0构建NJ系统进化树；利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测该基因的组织特异性表达。结果 GlIPT1基因cDNA序列全长为1296 bp，编码306个氨基酸残基，蛋白相对分子质量为34409.30 Da，等电点为5.93，属于P-loop_NTPase超家族，为亲水性蛋白。系统进化分析表明，GlIPT1与伞形科植物胡萝卜Daucus carota subsp. sativus IPT蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示：GlIPT1基因在珊瑚菜的花中表达量最高，其次是根，在叶中表达量较低。结论 本实验为进一步研究北沙参的分子育种和利用生物技术提高香豆素产量奠定了基础，具有重要的理论价值和良好的应用前景。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

鸢尾糖基转移酶编码基因ItUGT349和ItUGT419克隆及特性研究

目的 克隆获得鸢尾Iris tectorum糖基转移酶基因ItUGT349和ItUGT419,并对其进行生物信息学分析、基因差异表达检测和蛋白原核表达等特性分析。方法 以鸢尾转录组中筛选到的ItUGTs基因全长开放阅读框(open reading frame,ORF)设计特异性引物,进行PCR扩增,经测序后获得基因序列并进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR(real-time PCR,qRT-PCR)进行基因差异表达检测;最后构建pET-32a(+)原核表达载体在大肠杆菌中表达蛋白。结果 PCR扩增ItUGT349和ItUGT419的ORF长度分别为1461、1488 bp,编码蛋白相对分子质量大小分别为53 830、54 910。荧光定量PCR显示,ItUGT349的表达量在叶片中最高,而ItUGT419在花器官中表达最高。进化树表明,ItUGT419与三萜类糖基转移酶聚类在一起,ItUGT349与三萜、黄酮和木质素等多种类型的糖基转移酶聚类到一支。ItUGT349和ItUGT419在大肠杆菌中均成功的表达出可溶性蛋白。结论 通过ItUGT349和ItUGT419基因全长ORF克隆,并对其进行序列分析,基因差异表达检测及原核表达等研究,为后续进一步鉴定其催化功能奠定基础。     

北柴胡转录因子BcbZIP179的基因克隆及原核表达＊

目的 克隆北柴胡转录因子基因BcbZIP179的全长编码序列，原核表达融合蛋白。为进一步研究该基因在北柴胡转录调控中的功能提供理论依据。方法 以北柴胡转录组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增BcbZIP179基因的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qPCR方法分析BcbZIP179基因在不同组织器官中的表达及MeJA处理条件下的表达情况。构建原核表达载体，在不同温度和IPTG浓度下，采用2种菌株诱导表达目的蛋白。结果 BcbZIP179编码序列全长432 bp，编码144个氨基酸，BcbZIP179受MeJA诱导，在MeJA处理的北柴胡不定根中，处理前24 h内，表达量逐渐升高，随后表达量降低；BcbZIP179在北柴胡的根、茎、叶、花及果实中均有表达，在果实中的表达量最高；利用大肠杆菌原核表达系统，在16℃和37℃不同温度条件下均获得了带有6×His标签的BcbZIP179融合蛋白。结论 克隆到了北柴胡中的1个bZIP家族的转录因子基因BcbZIP179，在16℃、IPTG 0.05 mmol·L^-1条件下，可获得体外表达的蛋白，为制备抗体、分离互作蛋白和调控靶基因进而研究其功能奠定基础。     

蟾蜍TNFRSF11b、TNFRSF9基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆中华蟾蜍肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因的全长序列,并分析其序列特征。方法 根据转录组测序所得的TNFRSF11b、TNFRSF9基因片段设计特异性引物,以中华蟾蜍蟾皮为材料,利用逆转录聚合酶链式反应（PCR）技术获得BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列,并采用生物信息学手段分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR方法检测BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在中华蟾蜍7种组织/器官中的表达情况。结果 克隆获得蟾蜍BbgTNFRSF11b基因的全长cDNA序列为1233 bp,编码410个氨基酸,理论相对分子质量为46.97 kDa,等电点为8.64,不存在跨膜区及信号肽,为亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点。BbgTNFRSF9基因的全长cDNA序列为829 bp,编码247个氨基酸,理论相对分子质量为67.874 kDa,理论等电点为5.12,存在信号肽,为疏水性蛋白,具有多个磷酸化位点,进化树分析发现BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因与其他动物TNFRSF11b、TNFRSF9基因相似度不高,表明该基因虽有特殊结构域但不同物种间差异较大。组织表达分析显示,BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因在耳后腺中表达显著高于其他部位。结论 成功获得蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9基因序列,掌握其序列特征,为后续深入研究该蛋白的功能提供参考。     

红花光调控信号途径关键基因CtHY5的克隆及表达分析

目的 以药用植物红花Carthamus tinctorius为研究对象,克隆光信号途径关键转录因子HY5基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析,为红花HY5基因的功能研究提供参考。方法 以红花转录数据为参考,设计引物,采用PCR扩增方法从红花中克隆得到HY5的全长cDNA和DNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测编码蛋白的结构与功能,并通过荧光定量PCR方法检测CtHY5基因在红花不同组织及花发育不同时期的表达情况。结果 CtHY5基因的cDNA全长为462 bp,编码153个氨基酸,DNA全长为1941 bp,包含4个外显子和3个内含子。生物信息学分析表明,CtHY5为亲水性蛋白,定位于细胞核中。系统进化树及模体结构分析结果表明CtHY5与来自菊科的刺菜蓟、黄花蒿、薇甘菊、向日葵、莴苣中的HY5进化关系较近。定量分析表明,在白色红花和红色红花中,CtHY5基因均在花中表达量最高,其次为茎和苞片,在根中表达量最低。此外,除了根外,CtHY5基因在白色红花各组织中的表达量要明显高于红色红花。结论 首次从红花中克隆得到了光信号途径关键转录因子CtHY5基因,并研究了该基因在不同花色红花品系中的表达模式,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

西洋参根腐病抗性相关基因PqDELLA1的克隆及表达分析

目的 克隆西洋参PqDELLA1基因,进行生物信息学分析,并探讨其在西洋参抗根腐病中的表达模式。方法 根据已获得的西洋参转录组数据,设计PqDELLA1基因全长扩增引物,利用无缝克隆的方法获得全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）;采用国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在线Blastp、DNAMAN和MEGA 6.0等软件对序列进行生物信息学分析;通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测PqDELLA1基因的组织表达及诱导表达模式。结果 扩增得到西洋参PqDELLA1基因,其cDNA序列为1743 bp,编码580个氨基酸;PqDELLA1蛋白相对分子质量为63 910,理论等电点为5.01,不含信号肽,为非跨膜蛋白,定位于细胞核,与番茄SlDELLA蛋白氨基酸相似度最高。qPCR结果显示PqDELLA1基因在叶中表达量最高,其次为茎,根中最少;该基因的表达受根腐病病原菌茄病镰刀菌（Fusarium solani）的诱导,接种后5 d内持续升高后降低。结论 首次克隆出西洋参PqDELLA1基因并进行了生物信息学和表达特性分析,发现该基因可响应F. solani的侵染,为后续解析其参与西洋参抗病反应的分子机制提供参考。     

丹参SmRopGEF1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的 克隆丹参SmRopGEF1基因,研究其编码蛋白的亚细胞定位及其对逆境胁迫的应激反应和激素诱导下的表达水平。方法 根据前期丹参转录组测序结果设计SmRopGEF1基因特异引物,利用聚合酶链式反应（PCR）扩增SmRopGEF1基因序列;使用生物信息学方法分析SmRopGEF1蛋白序列特征及进化关系;构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并转化至大肠埃希氏菌中诱导表达,构建35S启动的SmRopGEF1的绿色荧光蛋白原生质体瞬时表达载体,利用激光共聚焦显微镜观察SmRopGEF1的亚细胞定位;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测逆境胁迫（低温、盐及干旱）和激素诱导（生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯）下的基因表达量。结果 丹参SmRopGEF1基因开放阅读框（ORF）全长为1701 bp,编码566个氨基酸,蛋白相对分子质量是62 362.99。生物信息学分析显示SmRopGEF1蛋白含有1个PRONE保守结构域,系统进化树分析表明SmRopGEF1蛋白与芡欧鼠尾草和一串红RopGEF1蛋白为高同源蛋白。成功构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并在大肠埃希氏菌Rosetta（DE3）菌株中表达、纯化出SmRopGEF1重组蛋白。亚细胞定位的结果显示SmRopGEF1存在于植物细胞的细胞核中。qRT-PCR实验结果表明盐胁迫和冷胁迫能够显著提高SmRopGEF1的表达量;干旱胁迫后丹参愈伤中SmRopGEF1表达量下降。茉莉酸甲酯诱导后SmRopGEF1表达量升高。结论 克隆了丹参SmRopGEF1基因,其在抗逆胁迫中起到重要作用并且可能参与茉莉酸甲酯信号转导。研究结果丰富了丹参防御反应机制的研究,为选育丹参抗逆优良品种、提高丹参的产量与品质提供了参考。     

珊瑚菜GlPS1、GlPS2基因克隆及表达分析

目的克隆珊瑚菜Glehnia littoralis补骨脂素合成酶(psoralen synthase,PS)基因全长cDNA序列,并进行生物信息学和表达量分析。方法在前期珊瑚菜转录组测序的基础上,筛选出表达量较高的2条PS基因GlPS1和GlPS2序列。利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法对2个基因cDNA序列3’端进行克隆,DNAMAN拼接后得到基因全长cDNA序列,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测GlPS1和GlPS2基因的组织特异性表达。结果 GlPS1和GlPS2基因cDNA序列全长分别为1 885 bp和1 971 bp,编码495和502个氨基酸残基,蛋白相对分子质量分别为55 740.7和56 363.9,等电点为8.28和6.62,均属于细胞色素P450超家族,含有1个跨膜区,为亲水性蛋白。系统进化分析表明,GlPS1和GlPS2与伞形科欧防风Pastinaca sativa、旱芹Apium graveolens、大阿米芹Ammi majus PS蛋白亲缘关系较近。RT-qPCR结果显示GlPS1基因在根中表达量较高,在叶中表达量较低,而GlPS2基因在花中表达量较高,在根中表达量较低。结论首次获得珊瑚菜GlPS1和GlPS2基因的全长cDNA序列并进行了表达分析,为进一步开展珊瑚菜补骨脂素合成酶基因的功能和遗传调控机制研究奠定基础。     

铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A的克隆与表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用铁皮石斛F-box蛋白基因即S期激酶相关蛋白(S phase kinase-associated protein)基因DoSKP2A,并进行生物信息学和表达特征分析。方法采用RACE技术获基因全长;利用生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建;借助定量PCR检测基因表达模式。结果克隆到DoSKP2A(GenBank注册号KU160472),c DNA全长1 507 bp,开放阅读框(ORF)长1 101 bp,编码蛋白含366个氨基酸,相对分子质量39 590,等电点7.9。DoSKP2A蛋白不含跨膜域和信号肽,包含F-box核心结构域(26～88)、亮氨酸重复序列LRR(202～226)和多个保守基序;Do SKP2A与植物SKP2As蛋白一致性为64.6%～72.4%,所在分支隶属于SKP2As分子进化的单子叶植物分支,与小兰屿蝴蝶兰SKP2A亲缘关系近;DoSKP2A基因转录本在石斛3种器官中为组成型表达,根中相对表达量较高,为叶中的6.16倍,茎中次之,叶中表达量很低。结论获得一个全新的铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A全长、生物信息及其表达特征,为研究其在铁皮石斛生长发育、信号传导和抗逆境胁迫的分子机制提供基础。     

药用真菌猪苓细胞凋亡抑制因子基因BI-1的克隆和表达分析

目的克隆药用真菌猪苓Polyporus umbellatus凋亡抑制因子基因BI-1并进行生物信息学和表达模式分析。方法利用5’-RACE PCR方法获取基因cDNA全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和跨膜结构等分子特性;采用Bioeditor以及MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;实时荧光定量PCR分析基因表达模式。结果猪苓细胞凋亡抑制因子BI-1(Genebank登录号JQ693683)的cDNA全长为1 091 bp,其中编码区占1 005 bp,编码334个氨基酸,推测相对分子质量为36 170,理论等电点为10.51,定名为Pu BI-1。整个多肽链具5个疏水区,表现为疏水性,是疏水性蛋白。系统进化树结果显示Pu BI-1所在分支隶属于担子菌群,与裂褶菌形成一单系。Pu BI-1基因转录本在初始期和生长期表达量在菌核组织中显著高于未形成菌核的菌丝组织,分别为原基期菌核(SI)为3.8倍、发育期菌核(SD)为7.497倍,成熟期菌核和菌丝中的Pu BI-1基因的表达量几乎无差异。结论猪苓凋亡抑制因子基因BI-1的分子特征及表达模式为进一步研究其在猪苓菌丝形成菌核过程中的作用奠定理论基础。     

竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆及生物信息学分析

目的 克隆竹节参Panax japonicus鲨烯环氧酶基因（squalene epoxidase,PjSE）的全长cDNA序列,进行生物信息学分析和原核表达。方法 设计特异性引物,从竹节参中克隆得到PjSE序列;以PjSE基因序列作为输入数据,利用多序列同源比对等生物信息学分析工具进行序列分析;构建重组原核表达载体pCold-PjSE,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;采用实时荧光定量PCR技术分析该基因在竹节参不同组织中的相对表达量。结果 PjSE基因开放阅读框长度为1884 bp,编码627个氨基酸,PjSE蛋白相对分子质量为68 639.49,初步预测其具有跨膜结构域,可能定位在叶绿体上;聚丙烯凝胶电泳结果显示诱导表达蛋白的相对分子质量大小与预期结果一致;该基因在竹节参叶中表达量最高,须根次之,根中表达量最低。结论 PjSE基因的克隆、生信分析及原核表达研究,不仅有助于丰富竹节参中该类功能蛋白的种类和数量,完善竹节参皂苷类成分的生物合成途径,也为后期开展竹节参皂苷的异源合成提供了可供选择的关键基因元件。     

白木香2个小分子热激蛋白基因的克隆及表达分析

目的从白木香Aquilaria sinensis中克隆sHSP1和sHSP2基因,并对它们的生物信息学及表达模式进行分析。方法根据本课题组白木香转录组数据库进行分析获得2条具有小分子热激蛋白(sHSPs)保守结构域的sHSPs基因序列,利用RT-PCR技术克隆sHSP1和sHSP2基因的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测sHSP1和sHSP2基因在不同组织和高盐及外源ABA、SA、MJ处理下不同时间的表达差异。结果克隆得到的白木香sHSP1和sHSP2基因开放阅读框都为474 bp,编码157个氨基酸。组织表达分析的结果显示,sHSP1和sHSP2基因主要在根中表达,在茎和叶中的表达量较少;白木香愈伤组织在高盐处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在36 h和24 h达到最高表达水平,而愈伤组织在外源ABA、MJ处理下,sHSP1和sHSP2基因都在12 h达到最高表达水平,在SA处理下,sHSP1和sHSP2基因分别在12、24 h达到最高表达水平。结论获得了sHSP1和sHSP2 2基因全长c DNA序列,且2个基因在不同组织根、茎、叶中的表达存在差异性,在受到高盐和外源ABA、SA、MJ处理时,在不同时间的愈伤组织中的表达及积累情况也不同,该研究为后续深入研究白木香防御反应奠定了基础。     

白桦BpTRX基因和启动子克隆及H_2S处理后的表达模式

目的研究白桦硫氧还蛋白(Betula platyphylla thioredoxin,BpTRX)基因全长和启动子序列及其编码结构和性质,揭示其在硫化氢(H2S)处理下BpTRX的表达模式。方法通过PCR手段克隆BpTRX基因,应用染色体步移技术获得BpTRX启动子区序列,并对BpTRX基因、启动子及其编码蛋白进行生物信息学分析,构建BpTRX系统进化树。利用实时荧光定量PCR定量分析BpTRX基因在H2S外源胁迫处理下的表达模式。结果 BpTRX基因全长351 bp,编码了由117个氨基酸组成的蛋白。BpTRX基因与蓖麻、大豆、苜蓿和葡萄TRX-H型蛋白亲缘关系紧密。获得的BpTRX启动子区序列为873 bp,包含了转录必备的元件以及大量的胁迫响应和激素响应元件等。结论获得BpTRX基因的全长和部分启动子序列,BpTRX基因对H2S处理的响应趋势为双峰形式,即先增加后降低、再增加再降低。     

温郁金中茉莉酸氨基酸合酶关键基因JAR的克隆及生物信息学分析

目的 克隆温郁金茉莉酸氨基酸合酶关键基因JAR(JA-amino acid synthetase)的全长c DNA序列,并进行生物信息学和表达分析。方法 根据温郁金转录组数据设计特异性引物。以温郁金根茎的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增获得JAR全长c DNA序列,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的特征;利用ClustalW和MEGA 6.06软件构建温郁金JAR的系统进化树;构建原核表达载体PET-22B(+)-JAR,纯化重组蛋白JAR5,并进行鉴定。结果 扩增后的基因编码582个氨基酸,全长1749 bp,且具有典型的GH3特征结构域,不具跨膜域,不存在信号肽,属于不稳定蛋白;PCR扩增后得到约1 800 bp大小的片段,经凝胶过滤色谱纯化,最终得到基于蛋白印迹实验(Western blotting)验证正确的66 200大小的重组蛋白。结论 首次克隆并分析了温郁金JAR基因,纯化了JAR5蛋白,为进一步研究温郁金JAR基因蛋白功能研究提供依据。