杜仲SSR-PCR反应体系的优化

目的:建立杜仲简单重复序列-聚合酶链式反应(SSR-PCR)的优化反应体系,为杜仲种质间的遗传差异及亲缘关系分析提供参考。方法:选择Taq DNA聚合酶,模板DNA,Mg2+,引物及d NTP浓度为考察因素,利用单因素试验和L16(45)正交试验优选杜仲的SSR-PCR反应体系,运用SPSS软件对试验结果进行分析。结果:各因素水平变化对反应体系影响顺序依次为Mg2+Taq DNA聚合酶引物d NTP模板DNA。优化的PCR反应体系为10×PCR缓冲液2μL,Taq DNA聚合酶0.5U,Mg2+浓度1.25 mmol·L-1,d NTP浓度0.2 mmol·L-1,引物浓度0.3μmol·L-1,模板DNA用量60 ng,定容至20μL。结论:利用该体系进行扩增,所得谱带明亮清晰,稳定性和重复性良好,适用于杜仲不同居群间亲缘关系和遗传多样性分析。     

射干内生真菌SRAP-PCR反应条件的优化

以从射干中分离纯化出的96株内生真菌DNA为研究对象,采用单因素试验设计,对影响SRAP-PCR反应的DNA模板、Mg2+、d NTPs、Taq DNA聚合酶和引物对浓度进行了优化,以确定适合射干内生真菌的SRAP-PCR反应最佳反应体系。结果表明,建立的射干内生真菌最佳反应体系为20μL,反应体系中含10×PCR buffer(不含Mg2+)2.0μL,DNA模板50 ng,Mg2+浓度为2.5mmol·L-1,d NTPs为0.5 mmol·L-1,引物1.0μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.5U。利用该反应体系从90对引物中筛选出可扩增清晰、稳定性好条带的引物38对。该体系为今后利用SRAP分子标记技术开展射干内生真菌的分子遗传学研究奠定基础。     

金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究

目的建立金钗石斛Dendrobiumnobile相关序列扩增多态性(SRAP)反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法运用L25(56)正交设计对影响金钗石斛SRAP反应的5个因素:模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物在5个水平上进行优化试验,对PCR结果进行极差分析。结果金钗石斛SRAP反应最佳体系为:25μL PCR体系中含有20 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs,1 UTaq酶,0.6μmol/L引物。各因素对SRAP反应的影响依次为:Taq酶Mg2+dNTPs模板DNA引物。结论所建立的金钗石斛SRAP反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。     

三叶青相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系的建立与优化

目的建立浙江和江西产的三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)SRAP-PCR的反应体系和扩增程序。方法应用L9(34)正交设计方法,以三叶青基因组DNA为模板,研究了Mg2+、dNTP、引物和模板DNA 4种PCR反应组分浓度变化对扩增结果的影响,根据梯度PCR仪引物的条带数量及清晰度选择退火温度。结果优化后的25μL反应体系包含:10×PCR buffer2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.15mmol/Ld NTP,0.15μmol/L引物,1.0U Taq DNA聚合酶,50ng DNA模板。扩增程序的最佳退火温度为51℃。并筛选出8对扩增产物丰富,多态性好的引物。结论正交设计优化的三叶青SRAP反应体系,经过10份样品检验,证明该体系稳定可靠,多态性好,可用于三叶青遗传多样性分析。     

对叶百部基因组DNA提取及ISSR-PCR体系优化

目的建立适合对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR最佳反应体系。方法通过改良的CTAB法提取对叶百部基因组DNA,并采用正交试验设计方法对影响ISSR-PCR反应体系的5种因素(d NTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq聚合酶)4个水平进行正交试验,优化ISSR-PCR反应体系。结果确立了对叶百部最佳反应体系,即在20μl的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μl,d NTP 175μmol/L,Mg2+1.7mmol/L,引物0.6μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA 15ng。结论建立并优化了对叶百部基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系。     

濒危药用植物三叶青ISSR分子标记的建立

目的对三叶青的简单重复序列-聚合酶链式反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序进行优化,并将其应用于野生三叶青种质资源的遗传分子标记。方法采用单因素试验,对三叶青ISSR-PCR反应条件中的Mg2+、d NTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度等因素进行筛选,之后结合正交试验来选择多态性高、重复性好的ISSR引物。结果建立了ISSR-PCR最佳反应体系,为25μL反应体系中含有2.5 mmol/L Mg2+、0.2μmol/L引物、0.25mmol/L d NTP、50 ng DNA模板、0.5U Taq DNA聚合酶,并利用U810等16条引物,初步构建了15份三叶青种质资源的ISSR指纹图谱,平均多态条带百分率达57.0%。结论该反应体系的稳定性和多态性良好,可满足对三叶青野生资源的遗传变异水平和结构分析的研究考察。     

穿龙薯蓣ISSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

目的建立穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的稳定体系。方法利用单因素及正交试验设计的方法对影响穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增效果的d NTPs浓度、引物浓度、模板DNA用量Taq DNA聚合酶用量、Mg~(2+)浓度进行优化。结果穿龙薯蓣的ISSR-PCR的20μl最佳反应体系为:2.0μl 10×Taq Buffer,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.225mmol/L d NTPs,1.5 UTaq DNA聚合酶,1.0μmol/L引物,2.0 ng/μl DNA模板,dd H2O补齐。应用该反应体系筛选出来适用于穿龙薯蓣ISSR扩增的12条引物,并确定了各引物的最佳退火温度。结论确立了一个适用于穿龙薯蓣ISSR-PCR扩增的体系。     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据.方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择.结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR缓冲液2.5 μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7℃.结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析.     

何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性反应体系的优化

目的 建立何首乌及其混伪品序列相关扩增多态性(SRAP)分子鉴定技术体系.方法 正交优化影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量.结果 20 μl反应体系的优化组合为:Mg2+ 2.5 mmol/L,dNTPs 0.4 mmol/L,引物0.35μmol/L,Taq酶1U.结论 Mg2+、dNTPs、引物浓度与Taq聚合酶量对不同物种SRAP-PCR结果有不同程度影响,利用SRAP分子鉴定前应对此4因素进行优化.     

天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的建立并优化天门冬ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨天门冬种质间遗传多样性提供依据。方法采用单因子试验和正交设计法,研究Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响。结果天门冬ISSR-PCR的最佳反应体系为25μL的反应体系中含模板DNA 40 ng、Mg2+1.25 mmol/L、dNTP 320μmol/L、引物1.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U。在此基础上,从50条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论建立的天门冬ISSR-PCR反应体系,经过17份天门冬种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬遗传分析。     

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。     

肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量测定

目的:建立肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量方法.方法:采用紫外分光光度法,以去氢二异丁香酚为对照品,测定波长275 nm.结果:去氢二异丁香酚质量浓度在1.5～9.0 mg·L-1与吸光度呈良好线性关系,r=0.999 8,平均回收率97.6％(n=6),RSD 1.2％.结论:建立的方法简便、快速、重复性好.     

HPLC测定秃叶黄皮树和黄皮树中5种有效成分的含量

目的: 测定秃叶黄皮树和黄皮树中黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、小檗碱、黄柏酮的含量,并比较不同品种黄柏药材有效成分含量的差异。 方法: 采用HPLC,Xtimate C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）,梯度洗脱,检测波长220 nm,流速1.0 mL·min^-1,柱温30℃。 结果: 5 种成分在上述条件下分离良好。黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、小檗碱、黄柏酮分别在0.001 7~0.07,0.002~0.08,0.000 5~0.02,0.01~0.4,0.000 5~0.02 g·L^-1呈良好线性关系,r分别为0.999 9,0.999 9,0.999 9,0.999 9,0.999 5,平均回收率均>97%,（RSD<3%,n=9）。 结论: 该方法简便、准确、重复性好,可作为秃叶黄皮树与黄皮树质量控制的方法。秃叶黄皮树中黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、小檗碱、黄柏酮含量与黄皮树无明显差异;且已成为黄柏药材的主流商品,建议将秃叶黄皮树与黄皮树一同作为黄柏收入药典。     

藏柴胡中三萜皂苷类成分的研究

该研究主要探究藏柴胡中的三萜皂苷类成分。采用大孔吸附树脂,MCI,硅胶,ODS,MDS柱色谱以及半制备高效液相色谱等分离纯化方法,从藏柴胡70%乙醇(含0.5%氨水)提取物中得到12个化合物。利用高分辨质谱、核磁共振等波谱手段鉴定其结构分别为柴胡皂苷b2(1),柴胡皂苷a(2),柴胡皂苷b1(3),柴胡皂苷d(4),hydroxysaikosaponin a(5),柴胡皂苷b3(6),柴胡皂苷c(7),柴胡皂苷i(8),柴胡皂苷f(9),chikusaikosidesⅡ(10),柴胡皂苷s(11),柴胡皂苷I(12)。12个化合物均属齐墩果烷型三萜皂苷类化合物,其中化合物1,3,5,8~9,11~12均为首次从该植物中分离得到。体外抗流感病毒实验表明在20μmol·L-1下,化合物2,4,6,8,11~12对流感病毒WSN33具有较明显抑制作用,其抑制率分别为91.3%,88.6%,53.4%,61.3%,77.3%,57.4%。     

丰城鸡血藤化学成分的研究

目的:分离和鉴定丰城鸡血藤的活性成分.方法:用溶剂法和色谱方法分离化合物,用波谱方法鉴定其结构.结果:从丰城崖豆藤中分离得到10个化合物,其中8个为黄酮类化合物(1～8):毛蕊异黄酮(1),染料木苷(2),gliricidin(3),8-甲雷杜辛(4),阿夫罗摩辛-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5),澳白檀苷(6),异甘草素(7)和3,5,7,4'-四羟基-3'-甲氧基黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8);2个为三萜类化合物,羽扇豆醇(9)和无羁萜-3β-醇(10).结论:10个化合物均为首次从该植物中获得.探讨毛蕊异黄酮等在NMR测定中的溶剂效应,纠正了文献[1-2]中该化合物碳谱数据的一些归属错误.     

厚朴与凹叶厚朴在湖北地区的生态适宜性研究＊

通过实地调查和文献研究，了解厚朴与凹叶厚朴在湖北地区的种植状况；采集45个野生分布点的海拔、经纬度数据，应用地理信息系统（GIS）提取各样点生境适宜度值，分析厚朴与凹叶厚朴在湖北地区的生长适宜性，为确定湖北区域内厚朴的适宜种植地提供科学依据。本研究结果表明，湖北西南部位于武陵山区的恩施地区及其周边适宜厚朴生长，适宜度值0.4~0.9；湖北东部位于大别山区的黄冈地区适宜凹叶厚朴生长，适宜度值0.8以上；湖北西北部位于武当山区的十堰地区，厚朴与凹叶厚朴均不适宜生长。     

古钩藤茎叶的化学成分研究

目的研究民族药用植物古钩藤Cryptolepis buchananii茎叶的化学成分。方法采用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱色谱以及制备HPLC等手段分离并纯化化合物,通过NMR、MS等波谱技术并结合文献数据鉴定化合物结构。结果从古钩藤茎叶甲醇提取物的醋酸乙酯部分共分离得到13个化合物,分别鉴定为异莨菪亭(1)、(+)-3-hydroxy-β-ionone(2)、(3R,6R,7E)-3-hydroxy-4,7-megastigmadien-9-one(3)、ficusic acid(4)、(+)-松脂素(5)、(+)-8-羟基松脂素(6)、(+)-丁香脂素(7)、异橙黄胡椒酰胺乙酸脂(8)、loliolide(9)、(–)-蛇菰宁(10)、金圣草素(11)、9-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic acid methyl ester(12)和ficusesquilignan A(13)。结论所有化合物均为首次从该属植物中分离得到。     

蒙古黄芪和膜荚黄芪水溶性蛋白表达

目的:蒙古黄芪和膜荚黄芪都为药用黄芪,二者亲缘关系近,成分相似,药用价值尚未区分。该研究旨在建立蒙古黄芪和膜荚黄芪的水溶性蛋白表达谱,了解两种黄芪之间存在的差别。方法:样品采用水超声提取和丙酮沉淀的方法得到黄芪水溶性蛋白成分,质谱级胰酶酶解后的肽段经nano ESI-LC-MS/MS分析,采用Proteome Discoverer 1. 4软件比对豆科蛋白数据库鉴定蛋白,再使用非标记定量软件SIEVE分析蒙古黄芪与膜荚黄芪水溶性蛋白质表达的差异。最后运用生物信息学方法分析2种黄芪共有蛋白的分类、分子功能、参与的生物过程和信号通路。结果:蒙古黄芪鉴定特异性蛋白有920个,膜荚黄芪鉴定的特异性蛋白有717个,2种黄芪中共同表达的蛋白有472个,其中二者的差异表达蛋白有21个,如PR-10蛋白,NDK-1蛋白,谷蛋白A2,磷脂酶D等蛋白在两种黄芪中差异表达。蒙古黄芪高表达蛋白14个,膜荚黄芪高表达蛋白7个。结论:蒙古黄芪和膜荚黄芪的水溶性蛋白表达谱存在显著差异,特异性蛋白、差异表达蛋白和共同表达的蛋白可为今后两种黄芪的鉴别、药理作用机制的研究和寻找作用靶点提供参考。     

鄂尔多斯半日花化学成分研究

目的研究鄂尔多斯半日花Helianthemum ordosicum树枝的化学成分。方法采用各种色谱法对鄂尔多斯半日花氯仿提取物进行分离,运用波谱法鉴定分离所得化合物的结构。结果从鄂尔多斯半日花氯仿提取物中分离得到12个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇(1)、stigmast-4-en-3-one(2)、阿魏酸丁酯(3)、苯甲酸二丁酯(4)、苯甲酸(5)、咖啡酸(6)、阿魏酸(7)、表儿茶素(8)、儿茶素(9)、表没食子儿茶素(10)、没食子儿茶素(11)和没食子儿茶素-(4α,8)-表没食子儿茶素(12)。结论化合物1～12均为该植物中首次分离得到,其中化合物2、8～12为该属植物中首次分离得到。     

不同氮源对丹参和藏丹参毛状根有效成分积累的影响

目的氮素是中药材有效成分积累的重要影响元素,为探讨不同氮源对丹参Salviamiltiorrhiza和藏丹参Salvia castanea毛状根生长和活性成分积累的影响。方法分别采用硝酸铵、水解乳蛋白、蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白和酵母提取物6种氮源处理对丹参和藏丹参毛状根的影响,分析毛状根生长及活性成分积累的变化。结果硝酸铵最有利于2种丹参毛状根的生长。水解乳蛋白能够显著促进丹酚酸类成分的积累,与硝酸铵对照相比,丹参迷迭香酸和丹酚酸B含量分别提高了2.94倍和3.27倍,藏丹参二者含量分别提高了13.74倍和2.01倍。酵母提取物对2种丹参毛状根二氢丹参酮Ι和隐丹参酮积累的促进效果最为显著,水解乳蛋白能显著促进丹参根中丹参酮IIA的积累,牛肉浸膏则对藏丹参中丹参酮IIA积累的促进作用最为显著。结论硝酸铵是2种丹参毛状根生长的最佳氮源,水解乳蛋白是丹酚酸积累的最佳氮源,不同氮源对4种丹参酮的影响不一致,丹参和藏丹参对不同氮源的响应也不一致。该研究不仅对丹参毛状根规模化培养及活性成分工业化生产具有一定指导意义,也对藏丹参资源的开发利用提供了借鉴作用。