基于一测多评法的当归药材质量控制研究

目的 建立一测多评法（quantitative analysis of multi-components by a single marker，QAMS）同时测定当归中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞的含量。方法 采用Waters X-Select CSH色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.085%磷酸-水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，体积流量1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长265 nm。结果 在线性范围内各成分线性良好（R²＞0.999）。以藁本内酯为内标，阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯和丁烯基苯酞的相对校正因子分别为1.073 4、0.564 8、0.468 1、0.926 2、1.083 5；同时采用外标法测定这6个成分的含量，将2种方法进行分析比较，结果没有明显差异。结论 建立了当归药材中阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和丁烯基苯酞6个成分的QAMS法，该法可用于当归的质量控制。     

基于HPLC多指标成分测定及指纹图谱多模式识别的不同产地不同品种当归质量差异分析

目的 建立当归Angelicae sinensis的HPLC指纹图谱并测定其主要有效成分的含量,结合多种化学计量学分析,确定不同产地不同品种(岷归1号、岷归2号)当归差异成分,为当归药材质量控制提供参考。方法 采用HPLC法建立不同品种当归的指纹图谱,并对指标成分进行含量测定。采用相似度评价、聚类分析(cluster analysis,CA)、因子分析、主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)、Fisher线性判别分析进行数据分析。结果 HPLC指纹图谱共标定了不同品种当归中的16个共有峰,指认出绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A、阿魏酸松柏酯、藁本内酯、丁烯基苯酞8个色谱峰。岷县产区当归的2个品种当归间存在差异的成分是绿原酸(P<0.01)、洋川芎内酯I(P<0.01)、洋川芎内酯H(P<0.01)、藁本内酯(P<0.01)和丁烯基苯酞(P<0.05),渭源产区的是洋川芎内酯I(P<0.01)、洋川芎内酯H(P<0.01)、洋川芎内酯A(P<0.01)、藁本内酯(P<0.01);临洮产区的是绿原酸(P<0.01)、阿魏酸(P<0.01)、阿魏酸松柏酯(P<0.01)、丁烯基苯酞(P<0.05);通渭产区的是阿魏酸(P<0.01)、洋川芎内酯H(P<0.05)、洋川芎内酯A(P<0.05)、藁本内酯(P<0.01)。结论 建立的HPLC指纹图谱结合含量测定、CA、因子分析、PCA、OPLS-DA分析可以客观、全面、有效地确定不同产地不同品种当归中主要有效成分的差异,可为当归品种鉴别及质量控制提供有力支撑。     

基于HPLC指纹图谱及多指标成分定量分析的不同产地当归质量特征研究

目的 建立不同产地当归Angelicae sinensis的HPLC指纹图谱并测定其主要成分的含量,结合化学计量学分析,建立各产地当归的“识别标志”。方法 采用HPLC-DAD方法建立甘肃、四川和云南等地当归的指纹图谱,并对指标成分进行含量测定。进行相似度评价结合主成分分析（principal component analysis,PCA）、偏最小二乘法判别分析（partial leastsquares discrimination analysis,PLS-DA）、Fisher线性判别（fisher linear discrimination analysis,FLDA）等模式识别技术进行分析。结果 HPLC指纹图谱共标定了不同产地当归中的13个共有峰,指认出绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、E-藁本内酯、E-丁烯基苯酞、Z-藁本内酯8个色谱峰,样品相似度均在0.90以上。绿原酸、洋川芎内酯I、E-丁烯基苯酞、总阿魏酸（阿魏酸与阿魏酸松柏酯换算后总量）、Z-藁本内酯6个指标成分含量测定变化范围分别为0.10～0.52 mg/g、0.10～0.24 mg/g、0.19～0.54 mg/g、1.42～2.66 mg/g、21.75～29.15 mg/g。PCA、PLS-DA分析结果表明,Z-藁本内酯、E-藁本内酯、阿魏酸松柏酯、阿魏酸在不同产地当归的中变化显著,Z-藁本内酯、E-丁烯基苯酞、总阿魏酸分别可作为甘肃当归、四川当归、云南剑川当归的成分识别标志。逐步线性判别验证当归产地其中自身判别正确率为96.3%,交叉验证正确率为92.3%。结论 建立的HPLC指纹图谱结合含量测定、PCA、PLS-DA客观、全面、有效地对不同产区当归质量特征进行探究,确认各产地当归的标志性成分,为当归的产地溯源及质量控制提供科技支撑。     

新老产地川芎中3种内酯成分的含量测定

目的: 建立同时测定川芎中主要内酯成分(洋川芎内酯A、阿魏酸松柏酯、藁苯内酯)的方法,比较新老产地川芎药材中3种内酯成分的含量差异。 方法: 采用单因素考察同时提取3种内酯成分的最佳条件,采用反相高效液相色谱法测定3种内酯成分含量。 结果: 新老产地川芎中3种内酯成分含量差异较大,其中差异最大为阿魏酸松柏酯,其次是洋川芎内酯A、藁苯内酯。通过聚类分析发现3种内酯成分没有地域分布规律。 结论: 所建立的方法操作简便、灵敏快速、重复性好,可用于川芎药材的质量控制;新老产地川芎的内酯含量比较为川芎的引种栽培、品质评价供依据。     

当归中一个新苯酞类化合物

当归为伞形科植物当归Angelicae sinensis的干燥根,是一味常见中药材。该研究通过正相硅胶色谱和反相制备液相色谱等方法,从当归中分离出6个化合物,包括1个新化合物;根据理化性质和波谱数据,分别鉴定为洋川芎内酯H-7-乙酸酯（1）、邻苯二甲酸（2）、邻苯二甲酸二异丁酯（3）、阿魏酸对羟基苯乙醇酯（4）、阿魏酸（5）和阿魏酸松柏酯（6）,其中1为新化合物。     

当归的形态变化特征与物质积累进程

目的 通过研究当归成药期的形态变化特征及物质积累进程,为当归的规范化种植提供参考。方法 以当归为材料进行田间试验,定期取样并测定茎叶性状,根部性状,根部浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯质量分数等。结果 株高、叶数和叶鲜/干质量在成药期呈先升高后降低的趋势,根长、根粗和根鲜/干质量在成药期呈升高的趋势,浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯的质量分数和总量在成药期均呈升高的趋势。结论 茎叶生物量的积累进程快于根部生物量,且浸出物、挥发油、有机酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本内酯的积累进程从属于根部生物量。     

施钾对当归苯酞类成分含量动态的影响

目的:研究施钾量对不同生长期当归根系中藁本内酯,洋川芎内酯A,洋川芎内酯H,洋川芎内酯I,阿魏酸松柏酯,丁烯基苯酞及欧当归内酯A等苯酞类成分含量动态的影响,为合理制定当归施用钾肥方案提供科学依据。方法:在大田试验条件下,研究施K_2O量为0 kg·hm~(-2)(K_0),150 kg·hm~(-2)(K_1),300 kg·hm~(-2)(K_2),450 kg·hm~(-2)(K_3),600 kg·hm~(-2)(K_4)和750 kg·hm~(-2)(K_5)对当归苯酞类成分动态含量的影响,采用HPLC测定不同生长期当归根中上述7种成分含量。结果:施钾并不改变当归根中苯酞类成分含量随生长期变化而变化的趋势;不同施钾量对当归苯酞类成分含量有显著影响(P0.05)。在本试验条件下,K_2O以450 kg·hm~(-2)处理对增加当归根中苯酞类成分含量的效果最好。结论:施钾能提高当归根中苯酞类成分含量,但施钾不会改变整个生育期内当归根中苯酞类成分含量的总体变化趋势。     

一测多评法测定川芎、当归中洋川芎内酯A和藁本内酯的含量

目的:建立HPLC一测多评法测定川芎、当归中洋川芎内酯A和藳本内酯的分析方法。方法:以丁苯酞作为洋川芎内酯A和藁本内酯的内标,在不同条件下测定相对校正因子,利用校正因子和内标测定川芎、当归中洋川芎内酯A和藁本内酯的含量。结果:丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯进样量分别在0.199 4~3.988(r=0.999 9),0.043 46~0.869 2(r=0.999 9)和0.080 67~1.613 4μg(r=0.999 9)与峰面积呈良好的线性关系,测得洋川芎内酯A、藁本内酯对丁苯酞的校正因子分别为0.490 7和0.226 3。结论:用丁苯酞作为内标,测定川芎、当归中洋川芎内酯A和藁本内酯的含量,解决了对照品不稳定的难题,该方法简便可行,可用于川芎、当归的质量控制。     

基于熵权-变异系数法对不同干燥方式下当归干燥特性及理化性质的评价

目的 分析自然晾晒干燥（natural drying,ND）、热风干燥（hot air drying,HAD）、真空干燥（vacuum drying,VD）、微波真空干燥（microwave vacuum drying,MVD）、真空远红外干燥（vacuum far infrared drying,VFIRD）和超声-真空远红外干燥（ultrasonic vacuum far-infrared drying,US-VFIRD）6种干燥方式对当归干制品干燥特性、理化品质及微观结构的影响,探究当归的最佳干燥方式。方法 选取干燥时间、色差、复水比、收缩率等物理特性和绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、丁烯基苯酞、藁本内酯、多糖、总酚、总黄酮等化学成分含量作为评价指标,使用熵权-变异系数法计算耦合权重系数和综合评分,并利用加权逼近理想解排序法（weighted approximation ideal solution ranking method,TOPSIS）验证评价模型。结果 MVD干燥时间最短（110min）且干制品色差最低（△E＝8.12±3.97）;US-VFIRD能更好地保存样品中藁本内酯、绿原酸、阿魏酸等天然活性成分和多糖、总酚、总黄酮等基本营养成分的含量,并对样品内部组织结构有明显的改善作用,其干制品品质最佳（熵权-变异系数综合评分为77.94,TOPSIS相对贴近度Φ为0.8383）,其次是MVD。结论 采用US-VFIRD干燥方式明显优于其他5种干燥方式,为超声波技术用于当归干燥提供理论支持。     

两类根际复配促生菌剂对当归生长、生理特征及药效成分的影响

目的 研究叶面喷施两类根际复配促生菌剂对当归生长与生理特征、药效成分的影响,以期为当归生态种植提供功能性微生物菌剂奠定基础。方法 在田间叶面喷施浓度为1×10⁸ CFU·mL^-1的复配促生菌剂T1（假单胞菌属CBS5、CBS7和CBSB）和T2（芽孢杆菌属5C1、5C5和5C7）,以喷施无菌马铃薯葡萄糖肉汤培养基为对照（CK）。常规方法测定当归植株生长指标,利用便携式光合测量系统测定当归植株光合生理指标,试剂盒法测定植物和微生物相关酶活性,超高效液相色谱串联质谱法分析植物内源激素水平,高效液相色普法测定阿魏酸、洋川芎内酯I、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、Z-藁本内酯含量。结果 与CK比较,2种复合菌剂能促进当归植株生长,增加生物量;提高叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度、蒸腾速率,增加过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、多胺氧化酶、二胺氧化酶和多酚氧化酶的活性,增加植株中内源茉莉酸、细胞分裂素及赤霉素水平,提高当归药材阿魏酸、洋川芎内酯A、Z-藁本内酯含量;降低膜脂过氧化产物丙二醛和衰老因子脱落酸的含量;减少根腐发病率。结论 叶面喷施两类根际复配促生菌剂对当归生长、光合作用和抗胁迫能力均有促进作用,对当归药材品质形成有不同程度的提升。综合分析,当归叶面喷施复合菌剂T1处理的促生增质作用优于T2处理。     

近红外光谱法快速测定当归中7种成分的含量

目的应用近红外光谱(NIRS)技术结合偏最小二乘法(PLS)建立当归中多指标成分的快速无损检测方法,以更好地控制当归药材和饮片的质量。方法采集购买不同产地的当归样品共108批。建立同时测定当归中7种成分含量的超高效液相色谱(UPLC)方法,并以其测定值为参比;以积分球漫反射模式采集当归样品的NIRS图;采用PLS等化学计量学手段建立各指标性成分的参比值与NIRS图的定量校正模型。分别对建模过程的各个阶段进行优化,包括样本集的选择、不同预处理方法和不同光谱区段的选择。结果所建立的绿原酸、阿魏酸、异绿原酸A、藁本内酯、丁烯基苯肽、洋川芎内酯I和欧当归内酯A的模型校正集相关系数分别为0.937 6、0.970 2、0.963 4、0.991 1、0.962 4、0.966 6和0.947 6;预测均方差分别为0.072 1、0.038 9、0.011 3、0.483 0、0.017 5、0.178 0和0.097 0。NIRS模型预测值与UPLC测定值具有良好的线性相关关系,模型预测效果良好。结论采用NIRS技术结合PLS可以快速对当归中绿原酸、阿魏酸、异绿原酸A、藁本内酯、丁烯基苯肽、洋川芎内酯I和欧当归内酯A 7种成分的含量进行检测,方法操作简便、结果可靠。     

不同炮制方法对川芎中化学成分的影响研究

通过测定川芎不同炮制品中浸出物的含量及绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯的含量,研究不同炮制方法对川芎醇溶性浸出物及6种成分含量的影响。浸出物的测定按照2020年版《中国药典》四部2201项下醇溶性浸出物测定法进行;含量测定采用Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈(A)-0.5%醋酸溶液(B),梯度洗脱,柱温30℃,流速1.0 mL·min-1,检测波长285 nm,进样量10μL。结果表明,与生川芎相比,川芎炮制品的浸出物含量均明显增加,增加程度为蜜川芎>酒川芎>芷川芎>茶川芎。高效液相测定方法便捷、可靠,川芎及其炮制品中绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯线性关系良好,精密度、重复性、稳定性及加样回收率均良好。川芎炮制前后共有色谱峰15个,指认了其中8个,与炮制前相比,川芎蜜炙、酒炙后新增2个色谱峰,白芷提取物炮制后新增了4个色谱峰;酒川芎中绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯的含量均减少;蜜川芎、茶川芎、芷川芎中除阿魏酸含量增加外,其余5种成分含量均减少。黄酒、蜂蜜、茶叶及白芷提取物均能促进川芎中化学成分的溶出,增加浸出物的含量;川芎不同炮制品中6种成分含量的变化可为研究川芎不同炮制品化学成分、药效变化提供一定的依据。     

川芎饮片标准汤剂的质量分析

目的:制备川芎饮片标准汤剂并对其进行质量分析。方法:参照标准汤剂的要求,制备来自3个产地共15批川芎饮片标准汤剂;建立其HPLC指纹图谱,采用聚类分析进行质量分析;建立其指纹图谱共有模式下4种指标成分(阿魏酸,洋川芎内酯Ⅰ,洋川芎内酯A和藁本内酯)的HPLC含量测定方法;计算各批次样品中指标成分转移率、出膏率,并测定样品的pH。结果:对15批川芎饮片标准汤剂采用"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"(2012A版)进行指纹图谱分析,确定了22个共有峰,其相似度均0.92;定性指认出其中11,13,17,18,19,20号峰,分别为阿魏酸,洋川芎内酯Ⅰ,洋川芎内酯A,正丁基苯酞,阿魏酸松柏酯,藁本内酯;通过聚类分析可将3个产地的川芎饮片标准汤剂质量概貌进行区分,说明不同产地的川芎存在质量差异,但同一产地不同批次质量较为稳定。15批川芎饮片标准汤剂共有模式下4种主要成分分别为阿魏酸,洋川芎内酯Ⅰ,洋川芎内酯A和藁本内酯;以洋川芎内酯A(0.176 3~0.249 8 g·L~(-1))和洋川芎内酯Ⅰ(0.065 2~0.103 4 g·L~(-1))在标准汤剂中含量较高,藁本内酯(0.040 0~0.089 8 g·L~(-1))次之,阿魏酸(0.022 0~0.042 3 g·L~(-1))最低,4个成分的转移率依次为6.63%~11.82%,33.32%~55.98%,1.26%~3.73%,16.39%~33.05%;15批川芎饮片标准汤剂的干膏得率12.69%~19.78%,pH 4.54~4.82。结论:该研究建立了各产地多批次川芎饮片标准汤剂的指纹图谱和多成分含量测定方法,适用于川芎饮片标准汤剂的质量控制。     

当归4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆与组织表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)为高等植物苯丙烷代谢途径关键酶之一,在当归阿魏酸的生物合成中起调控作用。研究利用同源克隆结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归4CL编码基因全长cDNA序列,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析4CL基因在当归幼苗生长过程中根、茎、叶组织中的表达特征。结果表明,获得的4CL cDNA序列(在GenBank已注册,登录号为KT880508) 全长1 815 bp,含有1个1 632 bp 的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码544个氨基酸的多肽链。4CL基因在当归幼苗不同生长阶段的根、茎、叶组织中均有表达,随着苗龄增大,茎、叶中的相对表达量显著增加(P<0.05),而根中表达量变化不大,表明4CL基因在当归幼苗中的表达具有明显的时空性。该研究为进一步研究4CL基因的结构与功能,解析当归阿魏酸的合成代谢机制和时空调控的分子基础奠定了工作基础。     

川芎质量标准的研究

目的建立川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的质量标准。方法对28批不同等级川芎药材开展杂质、水分、灰分、浸出物、重金属和有害元素残留量、农药残留量及主要成分(阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A和藁本内酯)的含量测定,并利用主成分分析各项指标与川芎药材等级之间的相关性。结果不同等级川芎药材的质控指标具有较明显的区分,规定川芎优质药材测定限为每千克药材40个以内,单个质量平均不低于20 g,水分≤12.0%,醇溶性浸出物限度不得小于25.0%;含阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、藁本内酯不得少于0.10%、0.04%、0.02%、0.40%、1.60%。结论该方法准确稳定,重复性好,可用于川芎的质量控制。     

当归、川芎配伍闪式提取工艺优选

目的:优选当归、川芎配伍提取工艺,比较川芎、当归单提和共提液中阿魏酸的含量变化.方法:以阿魏酸为指标,HPLC测定阿魏酸含量,选取提取时间、提取电压、乙醇用量及乙醇体积分数为考察因素,采用正交试验设计优选当归-川芎配伍闪式提取工艺,并用该优选工艺分别提取当归和川芎,比较单提、共提液中阿魏酸含量变化,探讨当归-川芎配伍的增效机制.结果:最佳提取工艺为20倍量65％乙醇于100 V电压下闪式提取1.5 min;当归-川芎共提液中阿魏酸的含量与单提液之和相近.结论:该优选工艺简单、经济,证实了当归、川芎配伍药理作用增强的原因并非阿魏酸含量的提高引起.     

基于UPLC-Q-TOF-MS技术的不同品种当归代谢组学分析

目的:建立当归不同品种间差异代谢物,为当归新品种育种、引种、区划栽培和生态种植提供参考依据。方法:对同一产地、同期采收的5个当归品种岷归1号(MG1),岷归2号(MG2),岷归4号(MG4),岷归5号(MG5)和岷归6号(MG6)进行非靶向代谢组学综合分析。取各品种药材50%甲醇提取物,采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLCQ-TOF-MS)技术,结合软件Progenesis QI,通过主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)等方法找出各品种间差异代谢物;依据相对分子质量,二级碎片,KEGG数据库和HMDB数据库以及相关文献信息,对差异代谢物进行鉴定。结果:5个当归品种的代谢物存在明显差异(P 0. 05),MG2,MG4,MG5和MG6中的绿原酸、阿魏酸、色氨酸、阿魏醛等含量显著低于MG1含量(P 0. 05),而藁本内酯、香豆素、牛角苷、棕榈素、原儿茶醛、亚麻酸等含量显著高于MG1(P 0. 05)。MG2,MG5及MG6中的代谢物相近,与MG4的代谢物差异较大,此外,还鉴定出38个显著差异代谢物,涉及7种潜在的靶向代谢通路,不同品种当归都可能通过苯丙素类生物合成、类倍半萜烯类化合物的代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、类胡萝卜素、亚麻酸、亚油酸等代谢途径调节代谢物的合成。结论:应用UPLC-Q-TOF-MS和Progenesis QI代谢组学技术从整体水平比较不同品种当归的化学成分,发现其中的差异性及其规律,为当归质量控制、引种、栽培及当归育种和生态种植提供参考依据。