莪术油对人直肠癌细胞株SW1463细胞增殖及免疫因子的影响

目的:研究莪术油对直肠癌细胞(SW1463)增殖作用及免疫因子的影响,检测白细胞介素-2(IL-2),转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达及对死亡因子配体(Fas L),半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达的影响。方法:水蒸气蒸馏法提取黔产莪术挥发油,配制质量浓度40,80,120,160,200,240,280 mg·L-1,干预SW1463细胞24,48,72 h,噻唑蓝(MTT)比色法检测药物对SW1463细胞的增殖抑制率,倒置显微镜观察药物作用细胞的形态变化,并采用姬姆萨(Giemsal)染色观察不同浓度的莪术油对SW1463细胞凋亡形态学的影响;酶联免疫吸附(ELISA)法检测IL-2,TGF-β1的表达,免疫印迹(Western blot)法检测细胞内Fas L,Capase-3,MMP-9蛋白表达。结果:莪术油对SW1463细胞有一定的增殖抑制作用,并呈现时间-剂量依赖性,半数抑制率(IC50)为128.49 mg·L-1;Giemsal染色细胞可见典型的凋亡形态学特征;与正常组比较IL-2和TGF-β1的含量随着莪术油浓度的增加表达减少(P0.05,P0.01);Western blot表明,莪术油处理SW1463细胞24 h后,Caspase-3,Fas L的蛋白表达上调,MMP-9的蛋白表达下调。结论:黔产莪术油能明显抑制SW1463细胞,而Caspase-3与MMP-9的表达呈现负相关性,其机制可能与Fas L上调诱导的细胞相关免疫因子有关。     

黔产莪术油对人直肠癌细胞血管生成因子表达的影响

目的:通过黔产莪术油对人直肠癌SW1463细胞血管内皮生长因子(VEGF)和趋化因子(chemokine,CXC)蛋白表达的影响,探讨莪术挥发油对肿瘤血管生成的作用机制。方法:将经水蒸气蒸馏提取的黔产莪术挥发油,配制成80,120,160,200 mg·L-1不同质量浓度,干预直肠癌SW1463细胞24 h后,倒置显微镜下观察不同浓度莪术油对直肠癌SW1463细胞的形态学影响;采用免疫细胞化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测直肠癌SW1463细胞中VEGF,白细胞介素-8(IL-8)和CXC趋化因子受体2(CXCR2),CXC趋化因子受体3(CXCR3)蛋白的表达。结果:经莪术油处理直肠癌SW1463细胞24 h后,与空白组比较,莪术挥发油组细胞中VEGF,IL-8,CXCR2蛋白表达量明显下调(P0.05,P0.01),莪术油能抑制肿瘤细胞中VEGF,IL-8,CXCR2蛋白的表达;莪术挥发油组细胞中CXCR3蛋白表达量明显上调(P0.05,P0.01),莪术油能促进肿瘤细胞CXCR3蛋白的表达。结论:黔产莪术油可能通过下调促血管生成相关因子的表达,上调抑制性血管生成相关趋化因子的表达,从而抑制肿瘤血管生成,起到抑制肿瘤细胞的增殖作用。     

板蓝根含药血清对病毒感染RAW264.7细胞的TLR3信号通路的影响

目的:研究板蓝根含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染RAW264.7细胞中干扰素-β(IFN-β),Toll样受体3(TLR3),TBK1,干扰素调节因子3(IRF3)表达的影响,阐释其可能的抗RSV机制,为临床使用提供实验依据。方法:本实验分为6组,分别为空白组,RSV感染细胞模型组,板蓝根含药血清低、中、高体积分数组(40%,50%,60%板蓝根含药血清),利巴韦林含药血清组(70%利巴韦林含药血清)。除空白组外,其余各组接种RSV造成病毒感染模型,采用板蓝根含药血清或利巴韦林含药血清进行干预,12 h后收集细胞及其上清液,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞上清液中IFN-β含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测RAW264.7细胞中TLR3,TBK1,IRF3和IFN-βmRNA的表达;蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测TLR3,TBK1,IRF3和p-IRF3蛋白的表达。结果:RSV感染RAW264.7细胞12 h后,与空白组比较,模型组TLR3,TBK1和IFN-βmRNA的表达显著升高,IFN-β,TLR3,TBK1和p-IRF3蛋白的表达也显著升高(P0.01),IRF3 mRNA和蛋白均无明显变化;与模型组比较,板蓝根含药血清中、高体积分数组能够显著下调RSV诱导的TLR3,TBK1和IFN-βmRNA的高表达(P0.05,P0.01),同时明显下调RSV诱导的TLR3,TBK1和p-IRF3蛋白的高表达(P0.05,P0.01),板蓝根含药血清各体积分数组的下调作用低于利巴韦林含药血清组,两者对IRF3 mRNA和蛋白均无明显调控作用。结论:RSV能够诱导TLR3信号转导通路的激活从而促进IFN-β的表达,而板蓝根含药血清通过下调TLR3信号通路关键信号分子TLR3,TBK1,p-IRF3使IFN-β适度表达。     

萆薢总皂苷对尿酸钠诱导THP-1细胞Toll样受体/核转录因子-κB(TLR/NF-κB)信号通路的影响

目的:研究萆薢总皂苷(TSD)对尿酸钠(MSU)诱导THP-1细胞Toll样受体/核转录因子-κB(TLR/NF-κB)信号通路的影响,探讨其抗痛风性关节炎的可能作用机制。方法:佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,分为正常组,模型组,TSD低、中、高质量浓度组(1,3,10 mg·L~(-1))和秋水仙碱组(0.2 mg·L~(-1)),除正常组外,其余各组均用400 mg·L~(-1)MSU刺激6 h,诱导体外炎症反应。噻唑蓝(MTT)比色法检测TSD对细胞活力影响;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液炎性因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的分泌水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TLR4,髓样分化因子88(MyD88)及NF-κB蛋白表达;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测TLR4,NF-κB及IL-1β前体(Pro-IL-1β)mRNA表达水平;免疫荧光法检测NF-κB p65的核位移情况。结果:0～32 mg·L~(-1)TSD对细胞活力基本无影响;与正常组比较,模型组炎性因子TNF-α及IL-1β的分泌水平显著升高(P0.01),通路关键蛋白(TLR4,MyD88及NF-κB)和基因(TLR4,NF-κB及Pro-IL-1β)的表达显著升高(P0.01);与模型组比较,1～30 mg·L~(-1)TSD可显著下调炎性因子TNF-α及IL-1β的分泌(P0.01),通路关键蛋白(TLR4,MyD88及NF-κB)和基因(TLR4,NF-κB及Pro-IL-1β)的表达明显降低(P0.05,P0.01),细胞核内NF-κB p65叠加减少,部分转位至胞浆,抑制NF-κB p65核转位。结论:TSD可能通过下调TLR4,NF-κB及Pro-IL-1βmRNA的表达,减少炎性因子TNF-α及IL-1β分泌而发挥抗炎作用。     

柴竭抑肝纤对大鼠肝星状细胞增殖和TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:研究保肝护肝中药复方柴竭抑肝纤(CJYGX)通过肝星状细胞治疗肝纤维化的作用机制。方法:培养肝星状细胞T6(hepatic stellate cell T6,HSC-T6),设空白组、秋水仙碱1.0 mg·L~(-1)组和200,100,50,25,12.5,6.25 mg·L~(-1)质量CJYGX组,作用24 h后通过细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)检测HSC-T6细胞的增殖情况,筛选合适的CJYGX药物浓度;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测CJYGX(200,100,50 mg·L~(-1))作用HSC-T6细胞24 h后转化生长因子-β1(TGF-β1),信号转导蛋白Smad2,Smad3,Smad4,Smad7 mRNA表达变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CJYGX(200,100,50 mg·L~(-1))作用HSC-T6细胞24 h后TGF-β1,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化。结果:(1)与空白组比较,200,100,50 mg·L~(-1)CJYGX对HSC-T6细胞具有显著的抑制增殖作用(P0.05)。(2)200,100,50 mg·L~(-1)CJYGX显著下调TGF-β1,Smad2,Smad3 mRNA的表达(P0.05);200,100 mg·L~(-1)CJYGX显著下调Smad4 mRNA表达,并显著上调Smad7 mRNA表达(P0.05)。(3)200,100 mg·L~(-1)CJYGX显著下调HSC-T6细胞TGF-β1和α-SMA蛋白表达(P0.05)。结论:CJYGX能抑制HSC-T6细胞的增殖,其作用机制与TGF-β1/Smad通路有关。     

基于HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路考察木瓜提取物对脊髓损伤大鼠的保护作用

目的:探讨木瓜醇提取物对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)大鼠神经功能的保护作用,并初步探讨其可能机制。方法:制备SCI大鼠模型,根据处理方式分为假手术组(Sham组),模型组(SCI组),木瓜提取物治疗组(Pap组);重组高迁移率族蛋白B1(high mobility group histone B1,HMGB_1)处理组(rHMGB_1组);重组HMGB_1+木瓜提取物处理组(rHMGB_1+Pap组)。应用basso beattie bresnahan(BBB)评分评估大鼠后肢运动功能;检测脊髓组织含水量评估脊髓水肿情况;应用苏木素-伊红(HE)染色进行组织学评估;运用酶联免疫吸附检测白细胞介素-1β(interleuki-1β,IL-1β),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-6(interleuki-6,IL-6)水平;原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测脊髓组织细胞凋亡情况;应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测组织中HMGB_1,Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4),核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65蛋白表达情况;Western blot检测半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白;应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测HMGB_1,TLR4,NF-κB p65 mRNA表达情况。结果:与Sham组比较,SCI组大鼠BBB评分明显降低(P0.05)。SCI组和rHMGB_1组脊髓组织松散,呈现嗜中性粒细胞浸润的组织学损伤;而Pap组和rHMGB_1+Pap组中组织学损伤情况得到明显改善。与Sham组比较,SCI组大鼠脊髓组织中含水量,HMGB_1,TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平,IL-1β,IL-6,TNF-α水平,凋亡阳性细胞数,Caspase-3蛋白表达水平均明显增加(P0.05)。Pap组和rHMGB_1+Pap组含水量,HMGB_1,TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平,IL-1β,IL-6,TNF-α水平,凋亡阳性细胞数,Caspase-3蛋白表达水平均明显低于SCI组(P0.05)。rHMGB_1+Pap组含水量,HMGB_1,TLR4,NF-κB p65 mRNA和蛋白表达水平,IL-1β,IL-6,TNF-α水平,凋亡阳性细胞数,Caspase-3蛋白表达水平明显低于rHMGB_1组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:木瓜提取物能够通过抑制HMGB_1/TLR4/NF-κB p65信号通路活化,减轻SCI后的炎症反应、减少脊髓组织细胞凋亡,从而诱导脊髓组织修复和运动功能恢复。     

抵当汤及其拆方对糖尿病大鼠心肌TGF-β1,TGF-β RⅡ及Smad7蛋白表达的影响

目的:探讨糖尿病对大鼠心肌转化生长因子-β1(TGF-β1),转化生长因子-β受体Ⅱ(TGF-βRⅡ)及人信号转导分子7(Smad7)蛋白表达的影响及抵当汤及其拆方的干预作用。方法:105只SD雄性大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型。成模后分为模型组、抵当汤干预组、水蛭虻虫组、桃仁大黄组和缬沙坦组,以12只正常SD雄性大鼠作为正常组,分别给予相应处理。8周末,利用全自动生化仪检测空腹血糖(FBG),HE染色观察心肌病理形态学变化,Western blot法检测TGF-β1,TGF-βRⅡ及Smad7蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠心肌组织细胞肥大,炎症细胞浸润较明显,心肌TGF-β1及TGF-βRⅡ蛋白表达明显升高,Smad7蛋白表达明显降低(P0.01);与模型组比较,抵当汤可以明显减轻糖尿病大鼠心肌组织的病理改变,抵当汤明显下调大鼠心肌TGF-β1蛋白及TGF-βRⅡ蛋白表达,明显上调Smad7蛋白表达(P0.05,P0.01)。拆方组大鼠与糖尿病模型大鼠组比较,TGF-β1蛋白下调,心肌组织损伤也有好转,但均不如全方明显。结论:抵当汤可减缓糖尿病大鼠心肌纤维化病变,其机制可能与下调糖尿病大鼠心肌中TGF-β1和TGF-βRⅡ蛋白表达,上调Smad7蛋白的表达有关,同时表明,抵当汤全方对DCM病变的防治作用优于拆方,"泻热化瘀通络"治法与抑制TGF-β1/Smad7信号转导通路有关。     

荔枝核总黄酮对结肠癌细胞株HT29的抑制作用及相关机制

目的:探讨不同浓度的荔枝核总黄酮(total flavone of Litchi Semen,TFLS)对人的结直肠癌细胞株HT29的体外抑制作用及对该细胞系中核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB);Toll样受体4(Toll-like receptors,TLR4);白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL~(-1)β)mRNA和蛋白表达的影响。方法:体外培养HT29细胞株,给予TFL(0,0.16,0.32,0.64,1.28,2.56 g·L~(-1))干预,给药后24,48,72 h,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分别检测TFLS对HT29增殖的影响,采用逆转录PCR检测各组NF-κB,TLR4,IL~(-1)βmRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测NF-κB,TLR4,IL~(-1)β蛋白表达情况。结果:MTT检测结果显示TFL对HT29增殖呈良好的时间依赖性和剂量依赖性,以作用72 h,质量浓度为2.56 g·L~(-1)抑制率最高。与空白组比较,TFL组作用72 h后,HT29细胞系中NF-κB,IL~(-1)β基因和蛋白表达水平均降低,尤以TFL 0.64,2.56 g·L~(-1)组较明显(P0.05)。TFL组TLR4基因表达较空白组差异明显(P0.05),蛋白表达差异不明显。结论:TFL在体外对HT29细胞系的增殖具有抑制作用,NF-κB可能为TFL抑制HT29细胞系增殖的关键因子。     

黄连素对Aβ25-35诱导的HT22细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨黄连素对β-淀粉样蛋白25-35(β-amyloid protein25-35,Aβ_(25-35))诱导的HT22细胞的保护作用及对Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:培养HT22细胞,孵育不同浓度的黄连素(0,5,10,20,40,80μmol·L~(-1)),24 h后行甲基噻唑基四唑法确定黄连素的保护浓度。随后将HT22细胞分为空白组,Aβ组,黄连素组,TAK242组。空白组加入培养基,Aβ组加入Aβ_(25-35)(40μmol·L~(-1)),黄连素组和TAK 242组加入黄连素(20μmol·L~(-1)),TAK 242(1μmol·L~(-1))预处理1 h后加入Aβ_(25-35)(40μmol·L~(-1))。共作用24 h后行乳酸脱氢酶释放实验检测细胞生存率,并行Hoechst33342染色检测细胞凋亡率蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测TLR4,磷酸化(p)-NF-κB和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-1β(IL~(-1)β)的蛋白水平。结果:与空白组比较,20μmol·L~(-1)的黄连素促进细胞增值,40μmol·L~(-1)和80μmol·L~(-1)的的黄连素抑制细胞增值(P0.01),在各药物组中,20μmol·L~(-1)的黄连素组的细胞增殖率最高(P0.01);与空白组比较,Aβ组的细胞生存率降低(P0.01),与Aβ组比较,黄连素组和TAK 242组的细胞生存率升高(P0.01);与空白组比较,Aβ组的细胞凋亡率升高(P0.01),且染色质凝集,核萎缩,凋亡小体增多,与Aβ组比较,黄连素组和TAK 242组的细胞凋亡率降低(P0.01),且染色质凝集,核萎缩和凋亡小体较少;与空白组比较,Aβ组的TLR4,p-NF-κB和TNF-α和IL~(-1)β的表达增多(P0.01),与Aβ组比较,黄连素组和TAK 242组的TLR4,p-NF-κB和TNF-α和IL~(-1)β的表达减少(P0.01)。结论:黄连素可能通过抑制HT22细胞中由Aβ_(25-35)活化的TLR4/NF-κB通路,从而减少神经元的凋亡起到保护作用。     

补肺益肾方对TGF-β1/BMP-4诱导的肺血管平滑肌细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的:探讨补肺益肾方对转化生长因子-β1(TGF-β1)/骨形成蛋白-4(BMP-4)诱导的肺血管平滑肌细胞增殖及TGF-β1/Smad信号传导的影响,并探讨其相关的作用机制。方法:应用TGF-β1/BMP-4诱导人肺动脉平滑肌细胞增殖。细胞分为正常组(10%正常大鼠血清),诱导增殖组(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4的10%正常大鼠血清),4%补肺益肾方含药血清(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,6%正常大鼠血清及4%补肺益肾大鼠血清),6%补肺益肾方含药血清(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,4%正常大鼠血清及6%补肺益肾大鼠血清)及8%补肺益肾方含药血清组(含7.5μg·L-1TGF-β1与5.0μg·L-1BMP-4,2%正常大鼠血清及8%补肺益肾大鼠血清)。24 h后,显微镜下观察细胞的密度,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U)法检测细胞增殖,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Smad1,2,3和5以及p-Smad2/3蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1),结缔组织生长因子(CTGF),分化抑制因子-1(ID-1)和ID-2 mRNA的表达。结果:TGF-β1/BMP-4作用24 h后,细胞密度增加、细胞增殖率显著增加(P0.05),补肺益肾方抑制TGF-β1/BMP-4诱导的细胞增殖,显示出浓度依赖性,其中8%浓度显著抑制细胞增殖(P0.01)。TGF-β1/BMP-4及补肺益肾方均不影响Smad1,2,3和5蛋白的表达;但TGF-β1/BMP-4诱导p-Smad2/3的表达(P0.05),8%补肺益肾方显著抑制TGF-β1/BMP-4诱导的p-Smad2/3表达(P0.05)。TGF-β1/Smad2通路的下游效应基因的检测发现,TGF-β1/BMP-4及补肺益肾方均不影响PAI-1,ID-1和ID-2 mRNA的表达;但TGF-β1/BMP-4诱导后,CTGF mRNA表达水平的显著增加(P0.01),8%补肺益肾方抑制TGF-β1/BMP-4诱导的CTGF mRNA的表达(P0.05)。结论:补肺益肾方抑制TGF-β1与BMP-4合用诱导的肺动脉平滑肌细胞的增殖,抑制p-Smad2/3/CTGF通路的活化是可能的作用途径。