远志皂苷调控miR-325-5p/GADD45B对高糖诱导小鼠足细胞损伤的影响及其机制

目的探讨远志皂苷(TEN)对高糖诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5损伤的影响及分子作用机制。方法将MPC5细胞分为正常对照(NG)组、高糖刺激(HG)组、TEN低中高3个浓度实验组,NG组用5 mmol/L D-葡萄糖处理,HG组用30 mmol/L D-葡萄糖处理,实验组用低中高(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)TEN进行处理,实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测MPC5细胞中miR-325-3p和GADD45BmRNA的表达,Western印迹检测GADD45B、podocin和nephrin蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-325-3p与GADD45B的关系。结果TEN可使高糖诱导的小鼠足细胞MPC5中miR-325-3p、podocin、nephrin和B细胞淋巴瘤(Bcl)-2含量显著升高(P<0.05),GADD45B、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达量及细胞凋亡率显著降低(P<0.05),抑制高糖诱导的小鼠足细胞MPC5损伤和凋亡;miR-325-3p靶向负调控GADD45B的表达;过表达miR-325-3p可抑制高糖诱导的MPC5损伤,并抑制细胞凋亡;抑制miR-325-3p表达逆转了TEN对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用。结论远志皂苷通过调控miR-325-3p/GADD45B减轻高糖诱导的小鼠肾脏足细胞MPC5的损伤,抑制细胞凋亡。     

LncRNA BDNF-AS靶向miR-335-5p调控高糖诱导的小鼠足细胞损伤的分子机制

目的探讨脑源性神经营养因子反义因子(BDNF-AS)对高糖(HG)诱导的小鼠足细胞损伤的影响及其分子机制。方法用终浓度为30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激细胞MPC5作为HG组,同时以终浓度为5 mmol/L的D-葡萄糖溶液处理细胞作为正常对照(NG)组。将si-NC、si-BDNF-AS、miR-NC、miR-335-5p分别转染至MPC5细胞中再用HG处理,记为HG+si-NC组、HG+si-BDNF-AS组、HG+miR-NC组、HG+miR-335-5p组。将pcDNA、pcDNA-BDNF-AS、si-NC、si-BDNF-AS转染至MPC5细胞中,记为pcDNA组、pcDNA-BDNF-AS组、si-NC组和si-BDNF-AS组。将si-BDNF-AS与anti-miR-NC、annti-miR-335-5p分别共同转染至MPC5细胞中再用HG处理,记为HG+si-BDNF-AS+anti-miR-NC组、HG+si-BDNF-AS+antimiR-335-5p组。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-335-5p和BDNF-AS的表达水平;Western印迹检测podocin、nephrin、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;荧光素酶实验检测LncRNABDNF-AS和miR-335-5p的靶向关系。结果HG作用的小鼠足细胞中LncRNA BDNF-AS表达水平显著升高,miR-335-5p表达水平显著降低,podocin、nephrin蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率显著升高,Bcl-2蛋白表达水平显著降低,Bax、酶切caspase3蛋白表达水平显著升高(均P<0.05);干扰LncRNA BDNF-AS表达和miR-335-5p过表达小鼠足细胞中podocin、nephrin蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率显著降低,Bcl-2蛋白表达水平显著升高,Bax、酶切caspase3蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。LncRNA BDNF-AS靶向调控miR-335-5p的表达,抑制miR-335-5p表达逆转了干扰LncRNA BDNF-AS表达对HG诱导的小鼠足细胞损伤的保护作用。结论HG作用的小鼠足细胞中LncRNA BDNF-AS低表达,过表达LncRNA BDNF-AS可抑制细胞凋亡,保护HG诱导的小鼠足细胞损伤,其机制可能与miR-335-5p的表达相关。     

miR-138-5p对高糖诱导的人肾小管上皮细胞间充质转化的影响

目的研究miR-138-5p对高糖诱导的人肾小管上皮细胞间充质转化(EMT)的影响。方法将HK-2细胞分为正常组(NG,5mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(HG,30mmol/L D-葡萄糖)、HG+miR-138-5p抑制剂转染组及HG+抑制剂对照转染组。RT-PCR检测高糖处理对miR-138-5p表达的影响;Western blot检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、同源盒蛋白A13(HOXA13)、骨形成蛋白7(BMP-7)、转化生长因子β1(TGF-β1)和Smad7等的表达;荧光素酶活性实验检测miR-138-5p与HOXA13的靶向关系。结果高糖刺激后,miR-138-5p表达升高约1.5倍(P0.05),α-SMA表达升高1.8倍,而E-cadherin表达下降;高糖促进TGF-β1的表达,抑制HOXA13、BMP-7和Smad7的表达(P0.05)。miR-138-5p抑制剂转染组α-SMA和E-cadherin的表达均接近NG组,且miR-138-5p抑制剂转染组TGF-β1表达下降约1.1倍,同时HOXA13、BMP-7和Smad7表达升高(P0.05)。结论抑制MiR-138-5p表达可通过靶向调节HOXA13的表达,提高BMP-7和Smad7水平,抑制TGF-β1信号通路,进而抑制高糖诱导的HK-2细胞EMT的发生。     

维生素D受体对高糖环境下足细胞凋亡及Caspase-3活化水平的影响及机制

目的探讨维生素D受体(VDR)对高糖环境下足细胞凋亡及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3活化水平影响及机制。方法用高糖处理足细胞,qRT-PCR、Western印迹测定VDR mRNA和蛋白水平。在足细胞中转染VDR真核表达载体,qRT-PCR、Western印迹测定转染后细胞中VDR mRNA和蛋白水平。用高糖培养液培养过表达VDR后的足细胞,膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)双染法测定细胞凋亡,用比色法测定细胞中Caspase-3活性,Western印迹法测定细胞中信号转导与转录因子(STAT)3、磷酸化的STAT3(p-STAT3)、p38、磷酸化的p38(p-p38)蛋白水平。结果高糖作用后足细胞中VDR mRNA和蛋白水平明显低于常规培养的足细胞(P0.05)。VDR真核表达载体转染后足细胞中VDR mRNA和蛋白水平明显高于不做转染的细胞(P0.05)。高糖作用后足细胞凋亡率明显升高,细胞中Caspase-3活性和p-p38、p-STAT3蛋白水平也升高,与常规培养的细胞相比差异有统计学意义(P0.05)。VDR过表达后足细胞经高糖培养后,细胞凋亡率和Caspase-3活性有所降低,细胞中pp38、p-STAT3蛋白水平有所降低,与单纯高糖培养的细胞相比差异有统计学意义(P0.05)。结论高糖作用后足细胞中VDR水平升高,且VDR拮抗高糖诱导的足细胞凋亡,降低高糖环境中细胞中Caspase-3活性,作用机制可能与STAT3、p38有关。     

核受体相互作用蛋白140及其相关核受体辅助因子在足细胞高糖损伤中的表达分析

目的探讨核受体相互作用蛋白140(RIP140)及其相关核受体辅助因子在足细胞高糖损伤中的表达及可能作用。方法分离培养小鼠原代肾脏足细胞,分为对照组(Con)、浓度为25mmol/L甘露醇高渗组(MT)及浓度为25mmol/L葡萄糖高糖组(HG),流式细胞仪检测细胞凋亡率。分别提取细胞mRNA、总蛋白、核蛋白及胞浆蛋白,RT-PCR检测辅助活化因子PGC-1α、PGC-1β、SRC-1、SRC-2、SRC-3、PCAF及辅助抑制因子N-COR1、RIP140表达,Western blot分析细胞总蛋白、核内蛋白及胞浆蛋白内RIP140表达。结果 HG组足细胞凋亡率明显增加(t=6.72,P0.01),HG组足细胞内核辅助活化因子PGC-1α(t=6.22,P0.01)、PGC-1β(t=11.41,P0.01)、SRC-1(t=4.92,P0.01)、SRC-2(t=5.40,P0.01)及PCAF(t=6.57,P0.01)mRNA表达下降,RIP140 mRNA表达(t=6.36,P0.01)升高,辅助活化因子SRC-3及辅助抑制因子N-COR1表达差异无统计学意义(P0.05)。HG组足细胞总蛋白及胞浆蛋白中RIP140表达增加,而胞核内RIP140表达下降。结论 RIP140及其相关核受体辅助因子表达变化可能参与调控高糖对足细胞的损伤。     

回回甘松饮含药血清对高糖诱导的小鼠足细胞上皮间质转化相关信号通路的影响

目的研究回回甘松饮(HGY)对高糖诱导的小鼠足细胞TGF-β1、Smad3、Smad7基因及蛋白表达的影响。方法体外培养小鼠足细胞,分为正常对照组、高糖组、坎地沙坦(阳性)组、HGY高、中、低剂量组。采用酶联免疫吸附法检测TGF-β1、Smad3、Smad7的蛋白表达水平。结果高糖(25 mmol/L)使足细胞中TGF-β1、Smad3基因及蛋白表达量升高(P0.01),Smad7蛋白表达量下降(P0.01);HGY含药血清可下调高糖诱导的足细胞中TGF-β1、Smad3的蛋白表达量(P0.01或0.05),并使Smad7蛋白表达量升高(P0.01或0.05),且HGY与坎地沙坦含药血清的调控结果接近,无显著差异。结论 HGY含药血清可调控高糖环境中的足细胞中TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达水平,这可能是其延缓早期糖尿病肾病所致肾纤维化进程的机制之一。     

蛋白激酶Cβ_2通过调控PPARα介导高糖诱导的人内皮细胞损伤

目的 研究蛋白激酶C(PKC)β_2、PPARα在高糖诱导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA中的作用及相互关系.方法 将培养的HUVECs分为以下8组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)组、渗透压对照(L,NG+20 mmol/L L-葡萄糖)组、正常糖卒载体转染(NN,NG+Ad5-null)组、高糖PKCβ_2转染(HB,HG+Ad5-PKCβ_2)组、高糖+非诺贝特(HF,HG+40 μmol/L非诺贝特)组、高糖PKCβ_2转染+非诺贝特(HBF,HB+40μmol/L非诺贝特)组,另以非诺贝特共孵育20 min作为HF20组,以上各组细胞均培养6 d.以RT-PCR 检测VEGF、VCAM-1 mRNA的表达水平,用Western印迹法测定PPARα蛋白表达,采用激光共聚焦检测PKCβ_2蛋白的表达和转位.结果 (1)HG组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.91倍和1.56倍(均P<0.05);HB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达较HG组进一步增加,分别为NG组的2.59倍和2.07倍(均P<0.05).HF组VEGF、VCAM-1 mRNA表达则明显下调,分别为HG组的68%和74%(均P<0.05);与HG组相比,HF20组VEGF、VCAM-1 mRNA表达差异无统计学意义.(2)HG组PPARa蛋白表达较NG组减少了20%,HB组PPARα蛋白水平进一步下降,为HG组的78%,与HG组相比,HF组PPARα蛋白水平上调了13%(P<0.05).(3)HG诱导PKCβ_2核转位激活,定量分析示HG组浆/核荧光强度比值较NC组降低37%(P<0.05),HB组PKCβ_2核转位与HG组相比更加明显.结论 高糖通过诱导HUVECs PKCβ_2核转位,进而调控PPARα表达,增加VEGF、VCAM-1 mRNA的表达.     

槲皮素对高糖诱导的系膜细胞活性氧簇类及单核细胞趋化蛋白1表达影响的研究

目的观察槲皮素(QUE)对高糖诱导的大鼠系膜细胞氧化应激、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)及细胞外基质表达的影响,探讨QUE治疗糖尿病肾脏疾病(DKD)的理论基础。方法培养大鼠系膜细胞,将系膜细胞分为对照组(Con)、高糖组(HG)和高糖+QUE组(HG+QUE)。采用流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS)的表达,采用ELISA检测细胞培养上清MCP-1、转化生长因子β1(TGF-β1)和纤连蛋白(FN)的表达。结果培养48h,HG组FN、TGF-β1、MCP-1及ROS表达量均高于HG+QUE组及Con组(P0.01);与HG组比较,QUE可抑制高糖条件下系膜细胞FN、TGF-β1、MCP-1及ROS的表达(P0.01)。结论 QUE可通过抑制高糖条件下系膜细胞氧化应激和炎症因子的表达,减少细胞外基质的合成,发挥肾脏保护作用。     

西格列汀对高糖下系膜细胞细胞外基质表达的影响

目的探讨高糖对肾小球系膜细胞细胞外基质表达的影响,以及西格列汀(SIT)对其的干预作用。方法培养肾小球系膜细胞,分为对照(Con)组、高糖(HG)组,以及高糖联合不同浓度的SIT组(HG+S1组、HG+S5组、HG+S10组和HG+S20组)。培养24 h、48 h后,用MTT法测定细胞增殖程度,ELISA检测细胞培养上清层粘连蛋白(LN)、大鼠Ⅳ型胶原蛋白(Col-Ⅳ)、转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白表达的变化。结果高糖培养24 h、48 h后,可观察到不同浓度的SIT均可抑制高糖诱导的系膜细胞增殖;SIT组与HG组比较,差异有统计学意义;Con组肾小球系膜细胞可分泌一定量的LN、Col-Ⅳ和TGF-β1,高糖刺激后LN、Col-Ⅳ和TGF-β1分泌增加,而SIT对系膜细胞分泌物的抑制随其浓度的升高而增强。结论SIT可抑制高糖条件下系膜细胞的增殖,且能降低高糖条件下LN、Col-Ⅳ、TGF-β1的表达,SIT可能对糖尿病患者的肾脏有一定的保护作用。     

高糖状态下肾脏系膜细胞葡萄糖转运蛋白1的表达及氟伐他汀的干预研究

目的观察高糖环境中大鼠肾脏系膜细胞（MC）葡萄糖转运蛋白1（GluT-1）及转化生长因子1（TGF-β1）mRNA表达变化以及氟伐他汀（Flu）的干预作用，探讨其保护肾脏的可能机制。方法原代培养MC分为正常对照（NG）组、甘露醇（MG）组、高糖（HG）组及HG＋Flu组，RT-PCR法检测细胞中GluT-1mRNA和TGF-β1 mRNA的表达，放免法测定各组细胞培养上清液中Ⅳ型胶原含量。结果HG组各时相点GluT-1mRNA、TGF-β1 mRNA表达量均高于NC组（P〈0．01），从48h开始HG组细胞上清液Ⅳ型胶原的含量较NC组增高（P〈0．05），而HG＋Flu组GluT-1 mRNA表达量、TGF-β1 mRNA的表达、细胞上清液Ⅳ型胶原含量均较同时点HG组明显降低（P〈0．01）。结论高糖刺激使MC内GluT-1 mRNA表达增高，TGF-β1 mRNA表达上调，Ⅳ型胶原分泌增多。高糖状态下，Flu抑制细胞外基质积聚的作用可能与其抑制高糖引起MC GluT-1过表达、减少TGF-β1的合成有关。     

龙胆苦苷通过调控miR-218表达减轻高糖诱导的小鼠肾脏足细胞损伤

目的 探讨龙胆苦苷(GPS)对高糖诱导的小鼠肾脏足细胞(MPC5)损伤的影响及其可能的作用机制。方法 高糖诱导MPC5细胞建立细胞损伤模型(HG组),正常培养的MPC5细胞记为Con组，用不同剂量(8、40、200μg/μl)GPS处理高糖诱导的MPC5细胞(HG+GPS-L组、HG+GPS-M组、HG+GPS-H组),anti-miR-NC、anti-miR-218转染至MPC5细胞后加入30 mmol/L D-葡萄糖处理24 h(HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-218组),miR-NC、miR-218 mimics分别转染至MPC5细胞后加入200μg/μl GPS与30 mmol/L D-葡萄糖共同处理24 h(HG+GPS+miR-NC组、HG+GPS+miR-218组);流式细胞术检测细胞凋亡率；qRT-PCR法检测miR-218相对表达量；Western印迹法检测肾素(nephrin)、足突蛋白(podocin)、剪切的胱天蛋白酶(cleaved-caspase)3、cleaved-caspase9蛋白相对表达量。结果 HG组nephrin、podo...     

TGF-β1/Smad2信号通路参与海水淹溺肺损伤引起的细胞凋亡

目的探讨TGF-β1/Smad2信号通路是否参与海水淹溺肺损伤引发的细胞凋亡过程。 方法体外培养A549人肺癌细胞,用浓度为20%、40%、60%的海水进行处理,根据MTT实验结果,筛选出最适浓度的海水用于后续研究;用抑制剂SB431542预处理细胞后,再用最适浓度的海水进行处理,然后采用Real-time PCR与Western blot检测凋亡相关指标Cleaved Caspase-3的表达水平、流式细胞术与Hoechst染色观察细胞凋亡情况,同时应用Real-time PCR与Western blot对TGF-β1、Smad2和p-Smad2的表达水平进行检测。 结果随着海水浓度的增加,A549细胞的活力逐渐降低,最终选用浓度为40%的海水进行后续研究;海水处理可使细胞发生明显的凋亡现象,而抑制剂SB431542可明显恢复由海水引发的凋亡水平;同时,发现海水使TGF-β1的表达水平显著上调,抑制剂SB431542处理后这种异常上调可显著被缓解,而Smad2的表达水平无显著性变化,但海水可使p-Smad2表达水平显著上调,且抑制剂SB431542处理后p-Smad2的表达水平可明显被抑制。 结论海水淹溺肺损伤可能通过激活TGF-β1/Smad2信号通路,调节凋亡执行蛋白Caspase-3的活性,从而促使肺组织细胞发生凋亡。     

转化生长因子β1信号通路对胚胎肝前体细胞分化的诱导作用

目的探讨TGFβ1对胚胎肝前体细胞(HPC)分化的影响。方法体外培养HPC-E14. 5细胞株并以细胞免疫荧光染色法鉴定。将细胞分为对照组(HPC)、HPC+TGFβ1组和HPC+SB431542组。HPC+TGFβ1组滴加外源性TGFβ1,HPC+SB431542组加入TGFβ1受体抑制剂SB431542,处理72 h后通过qRT-PCR法和Western Blot法分别检测AFP、Alb、细胞角蛋白19(CK19)mRNA及蛋白的表达情况;糖原染色法检测细胞分化后的功能。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Dunnett's t检验。结果 qRT-PCR检测结果:对照组的AFP mRNA表达量高于其他两组(F=128. 937,P 0. 01),HPC+TGFβ1组的CK19 mRNA表达量高于其他两组(F=414. 467,P 0. 01),HPC+SB431542组的Alb mRNA表达量最高(F=794. 929,P 0. 01)。Western Blot法检测结果:对照组的AFP蛋白表达量高于其他两组(F=269. 000,P 0. 01),HPC+TGFβ1组的CK19蛋白表达量高于其他两组(F=93. 010,P 0. 01),HPC+SB431542组的Alb蛋白表达水平均较其他两组明显升高(F=1086. 000,P 0. 01)。糖原染色法结果:对照组的糖原染色表达阳性面积比例小于其他两组(F=79. 251,P 0. 05)。结论 TGFβ1信号诱导HPC向有功能的胆管细胞分化,而阻断TGFβ1信号通路后HPC具有向成熟肝细胞分化的趋势,分化后的胆管细胞和肝细胞具有正常的糖原储存和合成功能,这些细胞可能能够参与代谢活动。     

中药复方筋脉通对高糖培养SD大鼠背根神经元凋亡及NGF表达的影响

目的通过高糖培养大鼠背根神经节神经元(DRGn)细胞模型,探讨中药筋脉通含药血清对DRGn凋亡及NGF表达的影响。方法采用混合酶分步消化法培养DRGn。将体外培养的24 h的DRGn分为正常对照组(Con)、高糖组(HG,45 mmol/L葡萄糖)、筋脉通组(JMT)、牛磺酸组(Tau),加入含药血清(浓度均为10%)干预24 h后,DRGn细胞凋亡率采用TUNEL试剂盒进行检测,NGF的蛋白及mRNA的表达采用免疫印迹法及实时荧光定量聚合酶链式反应法进行检测。结果与HG组比较,JMT组和Tau组的细胞凋亡率均显著降低(P<0. 01);与HG组比较,JMT组NGF蛋白及mRNA的表达显著升高(P<0. 01);与Tau组比较,JMT组NGF蛋白表达显著升高(P<0. 01)。结论筋脉通含药血清可降低高糖培养DRGn细胞凋亡率,增加NGF蛋白及mRNA的表达,且升高NGF蛋白表达的作用优于牛磺酸。     

知母总皂苷对Aβ_(25~35)诱导的PC12细胞Bax表达的影响

目的观察知母总皂苷对Aβ25³5诱导PC12细胞凋亡及凋亡相关基因Bax表达的影响。方法培养PC12细胞,实验分为6组:正常组、模型组、知母低剂量组、知母中剂量组、知母高剂量组、西药组。20μmol/L Aβ2535诱导PC12细胞凋亡及凋亡相关基因Bax表达的影响。方法培养PC12细胞,实验分为6组:正常组、模型组、知母低剂量组、知母中剂量组、知母高剂量组、西药组。20μmol/L Aβ25³5作用PC12细胞48 h,诱导其凋亡。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率的变化;采用RT-PCR检测各组细胞中Bax mRNA表达水平的变化;采用Western印迹技术检测各组细胞中Bax蛋白的表达水平的变化。结果和模型组比较,知母总皂苷能显著降低Aβ2535作用PC12细胞48 h,诱导其凋亡。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率的变化;采用RT-PCR检测各组细胞中Bax mRNA表达水平的变化;采用Western印迹技术检测各组细胞中Bax蛋白的表达水平的变化。结果和模型组比较,知母总皂苷能显著降低Aβ25³5诱导的凋亡(P<0.05),能显著性降低凋亡基因Bax mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。结论知母总皂苷能降低Aβ2535诱导的凋亡(P<0.05),能显著性降低凋亡基因Bax mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。结论知母总皂苷能降低Aβ25³5诱导的PC12细胞凋亡率,其机制可能是降Bax mRNA及蛋白表达水平。     

miR-142-5p靶向调控TGF-β2促进人巨噬细胞凋亡

目的探讨miR-142-5p在动脉粥样硬化组织中的表达及对人巨噬细胞凋亡的作用。方法构建动脉粥样硬化大鼠模型,qRT-PCR检测动脉粥样硬化组织中miR-142-5p的表达水平。50μg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激人巨噬细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)、内皮细胞24 h后,提取细胞RNA,qRT-PCR检测细胞中miR-142-5p的表达水平。靶基因预测软件预测miR-142-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因鉴定靶基因的正确性。细胞转染miR-142-5p mimic、mimic control、miR-142-5p inhibitor、inhibitor control,Western blot和qRT-PCR检测miR-142-5p对靶基因的调控作用,流式细胞仪检测miR-142-5p和靶基因对巨噬细胞凋亡的作用。结果 miR-142-5p在动脉粥样硬化组织中表达上调,与正常组织相比差异显著(P0.01)。血管平滑肌细胞和内皮细胞经ox-LDL刺激后miR-142-5p的表达水平与刺激前没有明显变化,而巨噬细胞经ox-LDL刺激后miR-142-5p的表达水平较刺激前明显升高(P0.01)。预测miR-142-5p的靶基因为转化生长因子β2(TGF-β2)。miR-142-5p mimic与TGF-β2共转染后荧光素酶活性最低;miR-142-5p mimic组TGF-β2蛋白和mRNA的表达水平与mimic control组相比明显下降,miR-142-5p inhibitor组TGF-β2蛋白和mRNA的表达水平与inhibitor control组相比明显升高(P0.01);miR-142-5p mimic组细胞凋亡率明显高于mimic control组,TGF-β2 siRNA组细胞凋亡率明显高于siRNA control组(P0.01)。结论 miR-142-5p在动脉粥样硬化中过度表达,miR-142-5p通过下调靶基因TGF-β2促进人巨噬细胞凋亡。     

吡非尼酮抑制转化生长因子β1诱导肺成纤维细胞胶原合成的实验研究

目的:探讨吡非尼酮对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肺成纤维细胞胶原合成的影响及机制。方法 :以人胚胎肺成纤维MRC-5细胞为研究对象,用p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号抑制剂SB203580和吡非尼酮处理TGF-β1诱导的肺成纤维细胞,MTT检测细胞增殖, Western blot检测细胞中Ⅲ型胶原酶(ColⅢ)、I型胶原酶(ColⅠ)蛋白表达和p38MAPK磷酸化水平。结果:TGF-β1诱导处理后的肺成纤维细胞增殖能力升高,细胞中ColⅢ、ColⅠ和p38MAPK磷酸化水平升高。吡非尼酮处理可以降低TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖能力,减少细胞中ColⅢ、ColⅠ和p38MAPK磷酸化蛋白表达。p38MAPK信号抑制剂SB203580处理具有协同吡非尼酮降低TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖和表达蛋白ColⅢ、ColⅠ及p38MAPK磷酸化水平的作用。结论:吡非尼酮通过抑制p38MAPK信号,从而抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞胶原合成。     

原花青素对Aβ25-35诱导PC12细胞周期紊乱的保护作用

目的 观察原花青素(PAC)对β-淀粉样肽(25-35) (Aβ25-35)诱导体外血清饥饿培养的PC12细胞周期紊乱与凋亡的保护作用,并探讨其可能的作用机制.方法 采用血清饥饿培养使PC12细胞同步于G0期,PAC预处理后加入Aβ25-35,通过流式细胞仪分析细胞周期与凋亡,RT-PCR和Western印迹从mRNA及蛋白水平检测p21、Cyclin D1、pRb和E2F1基因表达的变化.结果 与Aβ25-35诱导组比较,PAC保护组S期细胞百分率明显减少,凋亡率明显降低(P＜0.05);p21 mRNA和蛋白表达增加(P＜0.05),Cyclin D1、E2F1 mRNA和Cyclin D1、pRb蛋白表达降低(P＜0.05).结论 PAC对Aβ25-35诱导的PC12细胞周期紊乱与凋亡起保护作用,其机制可能与上调p21表达,下调Cyclin D1、pRb、E2F1表达有关.     

DNA甲基化转移酶1介导体外高糖刺激诱导的小鼠足细胞损伤的实验观察

目的研究高糖刺激对体外培养的小鼠足细胞DNA甲基化转移酶(Dnmts)表达的影响及Dnmt1在高糖刺激诱导的小鼠足细胞损伤中的作用。方法以体外培养的小鼠永生化足细胞为研究对象,分为正常糖对照组、高糖刺激组、甘露醇组及高糖+干预组(DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷,Dnmt1-siRNA),培养48h,RT-PCR检测其Dnmts mRNA表达;免疫印迹检测Dnmt1、nephrin及podocin蛋白表达;Transwell转板迁移实验观察不同处理后足细胞迁移数目。结果与正常糖对照组比较,高糖刺激组足细胞Dnmt1mRNA及蛋白表达增加(P0.01),Dnmt3a及Dnmt3bmRNA表达未见明显改变。经5-氮杂-2′-脱氧胞苷或Dnmt1-siRNA处理48h后,高糖刺激组导致Dnmt1高表达得到抑制,降低的足细胞裂孔膜蛋白podocin、nephrin表达增加(P0.01)。结论高糖上调足细胞Dnmt1蛋白表达,Dnmt1参与体外高糖诱导的小鼠足细胞损伤。     

转化生长因子-β1受体依赖的心肌纤维化伴随大电导钙激活钾通道的表达和功能下调

目的:探讨大电导钙激活钾通道(BKCa)是否参与转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的心肌纤维化过程,以及在这一过程中的作用机制。方法:分离培养乳大鼠心室成纤维细胞,并根据TGF-β1的不同浓度(5 ng/ml组、10 ng/ml组),以及在10 ng/ml TGF-β1基础上加入不同浓度TGF-β1受体特异阻断剂SB431542(0.1μmol/L组、1μmol/L组、10μmol/L组)进行分组,处理后提取蛋白及RNA,应用蛋白免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测各组TGF-β1受体蛋白,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)、BKCa蛋白和信使RNA(m RNA)的表达情况。单通道及全细胞膜片钳技术记录TGF-β1作用24 h前后的BKCa电流特点及其变化情况。结果:TGF-β1 5 ng/ml组和10 ng/ml组均上调TGF-β1受体蛋白,α-SMA、 CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白和m RNA的表达,10 ng/ml组TGF-β1下调BKCa蛋白和m RNA的表达。与TGF-β1 10 ng/ml组相比,在10 ng/ml TGF-β1基础上加入SB431542 1μmol/L组、10μmol/L组下调TGF-β1受体蛋白,α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白和m RNA的表达,加入SB431542 10μmol/L组上调BKCa蛋白和m RNA的表达,差异均具有统计学意义。此外,单通道及全细胞膜片钳技术记录结果表明TGF-β1预处理24 h后可明显抑制成纤维细胞上BKCa电流。结论:BKCa可能参与了TGF-β1诱导乳大鼠心室成纤维细胞纤维化通路,其机制可能是TGF-β1抑制了成纤维细胞上BKCa的电流。这提示BKCa可能是防治心肌纤维化的潜在靶点。