粉尘螨1类变应原重组融合表位免疫治疗小鼠哮喘的效果分析

目的 目的 探讨粉尘螨1类变应原重组融合表位对哮喘小鼠的免疫治疗效果。 方法 方法 将40只小鼠随机分为阴性 对照组、 哮喘组、 Der f 1治疗组和重组融合变应原Der f 1A治疗组等4组。哮喘组、 Der f 1治疗组和Der f 1A治疗组小鼠 用粉尘螨提取液于第1、 7、 14 d进行3次腹腔注射致敏, 并于第21 d开始雾化吸入激发, 持续7 d。其中治疗组于雾化吸 入前30 min, 分别用Der f 1、 Der f 1A进行特异性免疫治疗。对照组用磷酸盐缓冲液 （PBS） 进行腹腔注射和雾化吸入。完 成雾化吸入激发后, 计数支气管肺泡灌洗液 （BALF） 中白细胞总数; 观察肺组织病理切片; 检测BALF与脾细胞培养上清 液 （SCCS） 中IL?5、 IFN?γ和血清中特异性IgE、 IgG2a水平。 结果 结果 与哮喘组相比, 免疫治疗组小鼠肺部炎症明显减轻, 且 BALF中白细胞总数明显降低; 免疫治疗组小鼠BALF和SCCS中IL?5水平显著降低, IFN?γ水平则显著升高; 血清中变应 原的特异性IgE抗体水平显著降低, IgG2a抗体水平则显著升高 （P均< 0.01）。 结论 结论 粉尘螨1类变应原重组融合表位能 够有效减轻小鼠的哮喘症状, 为诊断和治疗过敏性哮喘奠定了基础。     

布鲁氏菌Omp2b优势T-B联合抗原表位的免疫应答特点研究

目的 通过生物信息技术预测分析Omp2b蛋白的优势B细胞表位和T细胞表位,筛选T-B联合抗原表位,探讨其免疫原性和激发免疫应答的特点,为开发有效的布鲁氏菌疫苗奠定基础。方法 1)利用生物信息学软件ProtParam,SOMPA,SWISS-MODEL,Rasmol,DNAStar,SYFPEITHI和IEDB来分析Omp2b蛋白的结构,预测T细胞和B细胞的优势表位以及T-B联合表位;2)ELISPOT法检测细胞中IFN-γ阳性细胞数;3)ELISA检测布鲁氏菌病患者血清中针对Omp2b蛋白的T-B联合肽的特异性IgG抗体水平。体外培养免疫细胞,检测上清液中的穿孔素和颗粒酶B。结果 生物信息软件综合分析Omp2b蛋白并筛选出了1个T-B细胞联合抗原表位的潜在区段196-216;患者组中分泌IFN-γ细胞数(SFU)较健康对照组增高(F=25.413,P<0.01),布鲁氏菌病患者血清中的IgG抗体、穿孔素和颗粒酶B的浓度也增加(F=13.653,P<0.01)。结论 Omp2b蛋白的T-B联合抗原表位可以产生特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答,为布鲁氏菌表位疫苗的筛选与构建提供参考。     

羊种布鲁氏菌OMP16蛋白结构的生物信息学分析

目的 使用生物信息学方法预测羊布鲁氏菌OMP16蛋白的结构特点,并预测可能的B细胞和T细胞优势表位。方法 从NCBI数据库中获取羊布鲁氏菌的OMP16蛋白的氨基酸序列。通过ProtParam分析OMP16蛋白的理化性质;利用DNAstar和SOMPA分析OMP16蛋白二级结构;利用Phyre2和Rasmol构建并分析OMP16蛋白三级结构;利用IEDB、DNAStar、ABCpred和BepiPred预测OMP16蛋白的B细胞抗原表位;利用SYFPEITHI和IEDB预测OMP16蛋白的T细胞抗原表位。结果 OMP16蛋白有426个氨基酸序列,理论等电点为9.72,原子组成为C2026H3209 N499O536S17,为稳定性疏水性蛋白。二级结构显示α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别是40.61%,19.01%,8.45%和31.92%。预测出4个B细胞优势表位,分别是93-102,183-187,273-289,294-301;5个CTL细胞优势表位,分别是69-77,175-183,267-275,373-381,408-416;5个Th细胞优势表位,分别是4-20,32-46,63-77,316-330,352-366。结论 羊布鲁氏菌OMP16蛋白结构中有4个B细胞优势表位,5个CTL细胞优势表位和5个Th细胞优势表位,为进一步为布鲁氏菌诊断和疫苗研究的奠定基础。     

流感病毒受体结合表位真核载体的构建及表达

目的构建甲型流感病毒血凝素(HA)信号肽(SP)与HA唾液酸受体结合部位(RB)所含T、B表位的基因片段(RBT、RBB)真核表达质粒,研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将HA的SP分别与RB、RBT、RBB通过一段多肽接头Gly4Ser融合为SP-RB、SP-RBT和SP-RBT,将其分别插入pcD-NA3.1(+)载体,构建质粒,鉴定正确后转染MDCK细胞,RT-PCR、免疫荧光、MTT检测该质粒的表达和分泌。结果融合基因真核表达质粒构建成功,在MDCK细胞中成功表达,转染细胞培养上清能刺激淋巴细胞增殖。结论SP-RB、SP-RBT、SP-RBB真核表达载体成功构建,表达产物能刺激淋巴细胞增值,为流感病毒唾液酸受体结合部位的T、B细胞表位免苗研究提供初步依据,也为流感核酸疫苗的研制奠定了基础。     

结核杆菌抗原Ag85A HLA-A*0201限制性CD8+ CTL表位的预测和鉴定

目的预测结核杆菌（Mtb）抗原Ag85A的HLA-A＊0201限制性CD8^＋细胞毒性T细胞（CTL）表位，并对其进行鉴定。方法应用数据库SYFPEITHI预测可能存在的HLA—A＊0201的限制性CD8^＋CTL表位，并经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A＊0201的亲合力，经时间荧光分辨法检测结核（TB）患者外周血单个核细胞（PB-MC）对抗原肽的增殖反应，再通过细胞毒实验研究抗原肽诱导的T细胞毒杀伤活性，逐步鉴定Ag85A的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果位于Ag85A氨基酸序列7（48-56aa）和5（242-250aa）的表位与HLA—A＊0201分子具有较高的亲和力，并能刺激HLA-A＊0201阳性结核患者PBMC增殖，诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽7GLPVEYLQV（48—56aa）和肽5KLIANNTRV（242—250aa）是Mtb抗原Ag85A的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。     

粉尘螨1类变应原T和B细胞表位嵌合基因的构建与表达

目的 目的 构建粉尘螨1类变应原 （Der f 1） 的T和B细胞表位嵌合基因原核表达载体。方法 方法 将Der f 1包含的5个 T细胞表位 （T1～T5） 和６个B细胞表位 （B1～B6）, 以B1?T1?B2?T2?B3?T3?B4?T4?B5?T5?B6和B1?B2?B3?B4?B5?B6?T1?T2? T3?T4?T5连接方式直接合成表位嵌合基因, 并分别命名为Der f 1A和Der f 1B。构建原核表达重组质粒pET?28a （+） ?Der f 1A和pET?28a （+） ?Der f 1B, 双酶切及测序验证的阳性克隆转化到E.coli BL21 （DE3） 后诱导表达。SDS?PAGE分析表达 产物后进行纯化, 并进行Western blotting鉴定。ELISA法检测嵌合蛋白对粉尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合力。结 结 果 果 双酶切及测序结果表明, 成功构建了原核表达重组质粒pET?28a （+） ?Der f 1A和pET?28a （+） ?Der f 1B; SDS?PAGE分 析表明, Der f 1A和Der f 1B诱导并纯化成功, Western blotting结果进一步证实纯化了Der f 1A和Der f 1B嵌合蛋白。与 Der f 1相比, Der f 1A和Der f 1B嵌合蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE抗体的结合能力显著降低 （P均＜0.05）, 但Der f 1A 和Der f 1B间差异无统计学意义 （P＞0.05）。结论 结论 成功表达了Der f 1的T和B细胞表位嵌合蛋白, 为粉尘螨过敏的特异 性免疫治疗奠定了基础。     

粉尘螨3类变应原的B细胞线性表位预测及鉴定

目的 目的 预测并鉴定粉尘螨3类变应原 （Der f 3） 中的B细胞线性表位。方法 方法 运用生物信息学技术， 从抗原性、 表 面易接近性、 柔韧性、 亲水性、 β转角等5个方面在线预测Der f 3的B细胞线性抗原表位。同时， 采用人工合成法合成相应B 细胞表位肽分别与由12份螨性过敏性哮喘患者血清组成的3个血清池共同作用， 明确其中的强阳性表位肽序列。结果 结果 成功预测了Der f 3中的8个B细胞表位肽。其中， 在过敏性患者血清与变应原特异性IgE结合试验中确认了33 KAKAG? DCP40 、 86 HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110 、 118 LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144 、 199 DVANGGVDSCQGDSGGPV? VD218 和156 QEGSYSLP163 5个强阳性表位肽序列。结论 结论 成功确认了Der f 3变应原中5个B细胞线性表位序列， 为尘螨过敏 性哮喘的诊断和治疗奠定基础。     

人体疟原虫乳酸脱氢酶基因多态性及B细胞表位预测

目的　分析4种人体疟原虫乳酸脱氢酶（Plasmodium lactate dehydrogenase, pLDH）基因多态性并预测pLDH 肽链B细胞抗原表位。方法　收集传染病报告信息管理系统中登记的云南省疟疾病例血样和流行病学等信息。采用巢式PCR技术扩增4种人体疟原虫pLDH基因并测序,应用MEGA 7.0.26和DnaSP 5.10软件分析4种人体疟原虫pLDH基因DNA序列多态性,并采用免疫表位数据库（IEDB）预测pLDH 肽链B细胞抗原表位。结果　分别从153份间日疟、29份恶性疟、17份卵形疟和11份三日疟患者血样中获得间日疟原虫LDH（PvLDH）、恶性疟原虫LDH（PfLDH）、卵形疟原虫LDH（PoLDH）、三日疟原虫LDH（PmLDH）基因测序序列,分别定义15、2、4、2种单倍型,核苷酸多样性指数（π）为0.104。PoLDH基因种内分化程度较高,π为0.012;PvLDH、PfLDH和PmLDH基因π值均 < 0.001。4种人体疟原虫pLDH肽链可预测到4～5个/链的B细胞抗原活性区,活性得分约0.430;其中活性区短肽“86⁃PGKSDKEWNRD⁃96”为4种人体疟原虫共有的B细胞抗原表位,“266⁃GQYGHS(T)⁃271”仅出现在PvLDH和PoLDH肽链,PvLDH、PfLDH肽链特有的B细胞抗原表位分别是“212⁃EEVEGIFDR⁃220”和“208⁃LISDAE⁃213”。结论　PoLDH基因多态性可能来自微弱的负向纯化选择,PvLDH、PfLDH、PmLDH基因则可能维持了相对保守状态。pLDH肽链近C端可能存在可区分间日疟、恶性疟原虫感染的B细胞抗原表位“212⁃EEVEGIFDR⁃220”和“208⁃LISDAE⁃213”。     

慢性乙型肝炎病毒感染者HBcAg特异性细胞毒性T细胞克隆的建立

目的建立HLA-A*2402限制的HBcAg特异性CTL细胞克隆。方法取HLA-A*2402阳性的慢性HBV感染者的PBMC,用限制性表位肽(HBV core117-125,EYLVSFGVW)和重组HBcAg刺激,并以有限稀释法对活化的T细胞进行克隆化,用免疫荧光染色、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果PBMC经表位肽激活后,特异性细胞毒活性达到43.7%;从活化细胞获得11株T细胞克隆;除2株是CD4+T细胞克隆外,其余9株为CD8+T细胞克隆,其中2株为Tc1,3株为Tc2和4株为Tc0。9株CD8+T克隆在效/靶比例为2.5:1时均具有HBcAg特异性靶细胞溶解活性(33.9%～90.2%)。结论用HBVcore117-125能激活HLA-A*2402阳性的慢性HBV感染者外周血CD8+T细胞,随之建立的9株CD8+T克隆均具有HBcAg表位特异性细胞毒活性。     

B细胞表位预测的研究进展

表位,又称抗原决定簇,是指免疫应答中被特异的效应 分子或T、B淋巴细胞识别的抗原分子的特定结构位点。B细 胞表位是指抗原中可被B细胞抗原受体(BCR)或抗体特异 性识别并相互结合的线性片段或空间构象型结构。B细胞表 位的预测对免疫原性多肽和新型疫苗分子的设计都有很大 的帮助,并有利于诊断试剂的开发以及临床疾病的诊断。     

腐食酪螨第3组分过敏原的分子结构、理化性质及抗原表位分析

目的 分析腐食酪螨第3组分过敏原(Tyr p 3)的结构、理化性质、B/T细胞抗原表位.方法 从美国国家生物信息技术中心(NCBI)数据库中索引到Tyr p 3蛋白的氨基酸序列.运用网络在线数据库ProtScale tools分析了Tyr p 3蛋白的一级结构;采用SOPMA网络在线服务器分析Tyr p 3蛋白的二级结...     

刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

梅毒螺旋体TprF蛋白B细胞表位的预测与鉴定

目的 预测和鉴定梅毒螺旋体(Tp) 膜蛋白TprF氨基端保守区(TprF^N)的优势B细胞表位,为深入研究梅毒多价表位疫苗提供依据。方法 从GenBank获取TprF^N的氨基酸序列,采用Mobyle、ABCpred和IEDB在线软件综合分析预测TprF^N的B细胞表位并人工合成多肽;表达重组蛋白TprF^N并经Western blot鉴定后免疫兔,获取血清并测定抗体效价;以TprF^N免疫兔血清、梅毒患者血清(设正常人血清和正常兔血清为阴性对照),间接ELISA测定预测的7条人工合成的B细胞表位多肽的免疫反应性和特异性。结果 软件综合预测TprF^N的P1 (43-62AA)、P2(57-71AA)、P3(81-88AA)、P4(89-103AA)、P5(125-138AA)、P6(231-251AA)、P7(268-279AA)可能为B细胞表位;表达一可溶性蛋白,WB鉴定为目的 蛋白,其免疫抗体效价为1∶12 800以上;ELISA结果显示,预测表位P1、P3与TprF^N免疫兔血清及梅毒患者血清均呈阳性反应,而与对照血清均不反应。结论 P1、P3为TprF潜在的优势B细胞表位。     

日本血吸虫病诊断分子B细胞表位的预测与鉴定

目的应用生物信息学技术对日本血吸虫病常用诊断分子进行B细胞表位的预测,筛选出具有潜在诊断价值的表位分子,采用基因工程方法制备目的表位的融合蛋白并进行抗原性鉴定.方法将日本血吸虫膜蛋白22 kDa(Sj22)、膜蛋白23 kDa(Sj23)、信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)、谷胱甘肽S转移酶(Sj26)分子的全基因序列输入BioSun软件的工作区,经多参数比较筛选可能的B细胞表位,克隆、表达预测表位,用表达的融合蛋白作为抗原与血吸虫病人血清反应,以筛选和鉴定具有抗原性的表位.结果经预测分析,Sj22的B细胞表位可能在56～62位和127～133位氨基酸区域,Sj23的B细胞表位可能在149～156位和160～167位氨基酸区域,Sj14-3-3的B细胞表位可能在118～225位和130～137位氨基酸区域,Sj26的B细胞表位可能在143～149位和191～197位氨基酸区域.克隆、表达并纯化这8个表位的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测抗原性,筛选出分别来自于Sj22、Sj14-3-3、Sj26的3条具有较强抗原性的表位片段.结论生物信息学技术结合分子生物学方法可用于筛选具有潜在诊断价值的表位.     

粉尘螨3类变应原的T细胞表位预测及鉴定

目的 目的 预测并鉴定粉尘螨3类变应原 （Der f 3） 的T细胞表位。方法 方法 运用生物信息学分析软件预测Der f 3的T 细胞抗原表位, 并人工合成所预测的T细胞表位肽。采用改良MTT法, 用预测表位肽刺激致敏鼠脾淋巴细胞进行脾淋巴 细胞增殖试验; 酶联免疫吸附试验检测脾细胞培养上清液中白细胞介素?2 （IL?2）、 γ干扰素 （IFN?γ）、 IL?4及IL?5水平。结 结 果 果 成功预测了Der f 3的5个T细胞表位肽, 通过脾淋巴细胞增殖试验, 其中3个表位肽序列可促进脾淋巴细胞增殖并 刺激细胞因子IL?2和IFN?γ的分泌, 抑制细胞因子IL?4和IL?5的分泌。其序列分别为37 GDCPYQISLQSSSHFCGG54 、 98 IY? QHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMT123 和164 SELQRVDIDVVSREQCDQLYS184 。结论 结论 初步鉴定了Der f 3变应原中3个T细 胞表位序列, 为后续过敏性哮喘的诊断和特异性免疫治疗奠定基础。     

急性乙型肝炎HBcAg特异性CTL克隆建立及初步分析

目的建立急性乙型肝炎（乙肝）患者的HBcAg特异性CD8^＋T细胞克隆。方法一例急性乙肝患者经用序列特异引物聚合酶链反应分型技术,测得其人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-A基因型为1101,其外周血单个核细胞采用重组HHBcAg和合成的HLA—A＊1101限制性表位肽（HBV croe88—96）刺激,并以有限稀释法对活化的T细胞进行克隆化,建立HBcAg特异性的CD8^＋T细胞克隆。用免疫荧光染色、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验鉴定所获克隆。结果获得13株HBcAg＋特异性CD8^＋咖胞克隆（6侏为Tc1,3株为Tc2,4株为Tc0）。其中12株具有明显的特异性细胞毒沂陛（37．5％-85．5％,效／靶比为2．5：1）,1株（A10株,Tc0）细胞毒活性仅为10．2％。结论应用HLA—A＊1101限制性表位肽（HBV croe88—96）刺激急性乙肝患者的外周血单个核细胞,建立了13株肽表位特异性的CD8^＋T细胞克隆,为进一步研究打下基础。     

中国莱姆病螺旋体菌株bmpA基因中人B细胞表位多态性分析

目的 研究我国伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato),即莱姆病螺旋体菌株中bmpA基因及其人B细胞表位区的序列多态性。方法 选取61株莱姆病螺旋体分离株,PCR扩增其bmpA基因并测序后,结合4种基因型参考菌株序列,与从免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)中查询到的B细胞表位序列进行比对分析。结果 中国B.garinii基因型菌株的cluster2、cluster3以及B.afzelii和B.valaisiana基因型所有菌株与参考序列比对后发现分别有3、9、5和18个异义突变。B细胞表位改变主要发生在B.afzelii基因型全部分离株和B.garinii基因型的cluster3及5株非成簇菌株。B.afzelii基因型菌株在B细胞表位区的异义突变A125S影响了2个B细胞表位;B.garinii基因型的cluster3和5株非成簇菌株B细胞表位区的3个异义突变导致5个B细胞表位均发生改变。结论 中国莱姆病螺旋体bmpA基因在4种基因型间和B.garinii基因型内存在较大多态性。     

C基因型HBV较B基因型HBV易引起肝炎慢性化的机制

目的探讨HBVC基因型较B基因型易引起肝炎慢性化的机制。方法从GenBank分别下载C基因型和B基因型小S蛋白的氨基酸序列（即HBsAg），用CLustalW2．0生物软件分别比较C基因型和B基因型小S蛋白氨基酸序列的相似性；用神经网络的方法预测同基因型不同的小S蛋白氨基酸序列之间的T细胞表位的差异。结果通过分别比较C基因型和B基因型小S蛋白的氨基酸序列的相似性，C基因型小S蛋白的氨基酸序列之间的相似性为（90～100）％，B基因型小S蛋白的氨基酸序列之间的相似性为（94～100）％；同基因型不同的小S蛋白氨基酸序列之间的T细胞表位存在明显差异。结论C基因型小S蛋白的氨基酸序列之间较大的变异和同基因型不同的小S蛋白氨基酸序列之间的T细胞表位的差异可能是HBVC基因型较B基因型易引起肝炎慢性化的原因或部分原因。     

寄生虫病表位疫苗研究进展

寄生虫病不仅严重威胁人类健康，而且也给畜牧业造成巨大经济损失。目前研制安全有效的疫苗是寄生虫病预防控制的策略之一。表位疫苗具有特异性高、安全性好、设计灵活、易于生产和储存等优点，可同时诱导机体体液免疫和细胞免疫。近年来寄生虫病表位疫苗研究取得了较大进展，本文对寄生虫病表位设计及相关疫苗研究进展进行综述，旨在为高效疫苗的研制提供参考。     

HBV细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体在真核细胞中的表达及其腺病毒载体的构建

目的：构建乙型肝炎病毒表面抗原细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体（HBsAg-SCT）真核表达载体，在真核细胞293T中表达，并构建含HBsAg-SCT的腺病毒载体。方法：合成H-2L。限制的HBsAg细胞毒性T细胞表位寡核苷酸，与H-2L“分子融合，构建含HBsAg—SCT的真核表达载体，并转染293T细胞，采用流式细胞技术观察HB—sAg-SCT在细胞表面的表达。将HBsAg—SCT亚克隆到腺病毒载体，转染293A细胞，包装产生携带HBsAg-SCT的重组腺病毒。结果：成功构建了HBsAg-SCT真核表达载体，并在真核细胞中表达。利用重组腺病毒载体制备出高滴度的重组腺病毒。结论：合HBsAg—SCT的真核表达载体能够在真核细胞表面有效表达，获得合HBsAg-SCT的重组腺病毒，为研究HBsAg—SCT免疫治疗HBV感染打下基础。