随机扩增多态性DNA基因分型对铜绿假单胞菌克隆菌株的分析

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomorlas aeruginosa,PA)的基因分型及克隆菌株在医院内感染中所占的比例.方法 通过随机扩增多态性DNA基因分型对69株PA进行克隆菌株的分析.结果 69株PA基因分型36型,有33株菌是同源菌.结论 切断患者之间、患者和护工、患者和护士、医生之间交叉感染可降低PA感染率,加强医院感染控制措施有可能成为降低感染率最重要的关键因素之一.     

实时荧光PCR检测MRSA对减少儿科ICU病区医院感染的效果观察

目的观察实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对减少儿科ICU病区医院感染的效果。方法选取2011-07~2012-06实时荧光PCR法检测的儿科ICU病区标本856份,其结果与分离培养药敏试验法的检测结果进行比较;另与2009-07~2010-06 MRSA医院感染率进行比较。结果实时荧光PCR法与分离培养药敏试验法对金葡菌检测的一致率为100%,均检测出33株金葡菌阳性株。实时荧光PCR法与分离培养药敏试验法检测MRSA的符合率为93.9%。分离培养药敏试验法检测为阴性而实时荧光PCR法检测为阳性的2株待检菌的测序结果显示为阳性。利用实时荧光PCR法检测MRSA后,医院感染率从36.4%下降到16.7%。结论实时荧光PCR法能更及时、更准确发现MRSA,从而早隔离、早治疗,减少MRSA医院感染。     

志贺菌属肠毒素ShET1/ShET2的基因型PCR分析

目的 对福氏2a志贺菌肠毒素ShET1和肠毒素ShET2进行基因分型，提高福氏2a志贺菌同源克隆鉴定系统的分析水平。方法 对93株分离自不同地区、不同时间的福氏2a志贺菌用PCR法检测志贺菌肠毒素ShET1／ShET2基因并进行基因分型。结果 93株福氏2a志贺菌按志贺菌肠毒素ShET1／ShET2基因分为4种基因型，即12株ShET1(-)／ShET2( )，14株ShET1( )／ShET2(-)，59株ShET1( )／ShET2( )，8株ShET1(-)／ShET2(-)。结论 福氏2a志贺菌肠毒素ShET1／ShET2基因PCR检测可用于福氏2a志贺菌的初步筛检。     

单增李斯特菌三重实时荧光PCR检测的建立及其毒力基因在分离菌株中分布

目的建立同时检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)溶血素基因hlyA、内化素基因inlA和磷脂酶C基因plcB的TaqMan-MGB三重实时荧光PCR检测方法,并对101株单增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB基因进行了检测,分析3个毒力基因在多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)聚类群组中的分布情况。方法根据单增李斯特菌毒力基因hlyA、inlA和plcB的保守序列设计引物和小沟结合物(minor groove binder,MGB)探针建立三重荧光PCR方法,对其特异性、灵敏度和可重复性进行了测试,并对分离的101株单增李斯特菌进行三重PCR检测。结果建立的三重实时荧光PCR方法特异于单增李斯特菌的检测,重复性良好,组内Ct值变异系数均小于1.5%,灵敏度可达100CFU/mL。对101株单增李斯特菌的hlyA、inlA和plcB的检出率分别为98%、75%和98%。在可被MLST分型的89株菌株中,groupI的30株菌株有20株均缺失inlA基因;groupII的57株菌株中有56株三个基因均检出;groupIII的菌株hlyA、inlA和plcB三个基因均未检出。结论本文建立的三重实时荧光PCR方法能准确、快速、稳定的检测单增李斯特菌,101株单增李斯特菌的hlyA、inlA、plcB三个毒力基因的检出情况与单增李斯特菌的MLST分型聚类有较一致的关系,对分析单增李斯特菌毒力的强弱有重要参考意义。     

乙型肝炎病毒基因型(A-F)多引物PCR分型法的初步建立

目的：建立一种简便易行的乙型肝炎病毒基因分型方法（只需PCR）。方法:对GenBank中查获的114例HBV全序列进行比较分析，找出每种基因型相对于其他5种基因型的独特序列，并根据这些独特序列设计出6对分别针对A－F基因型的特异引物。用这6对引物分别对标本进行PCR，根据阳性结果判断出标本的基因型。进一步简化该方法，用多引物对PCR法（PCR with several primer sets in a single tube,Multiplex PCR)将B，C，D3种基因型的特异引物混合进行PCR，根据扩增片断的大小判断基因型。用此方法对已鉴定的B，C，D型标本进行比较和验证。结果：单引物对PCR与多引物对PCR的分型结果一致，且与以前用PCR－RFLP法的分型结果一致。结论：用多引物对PCR分型法准确易行，灵敏性高，便于推广应用。     

鉴定单增李斯特菌4b血清型亚型的多重PCR方法的建立

目的利用多重PCR（multiplex PCR）技术,建立针对单增李斯特菌4b血清型亚型（ECI、ECII、ECIV,non-EC）的鉴定方法。方法以LMOf2365—2798、LMOh7858—0487、0RF2110和gtcA作为靶基因设计引物,建立同时鉴别ECI、ECII、ECIV、non-EC的多重PCR反应体系,并对16株4b血清型单增李斯特菌进行亚型鉴定。结果16株4b血清型单增李斯特菌可用本方法进行分型：其中ECI亚型11株,ECII亚型1株,ECIV亚型2株,非流行克隆群（non—EC）2株。结论本方法能准确鉴定单增李斯特菌4b血清型菌株的4个亚型,可用于食品、临床标本的病原学诊断和疫情暴发的溯源调查。     

福氏2a志贺菌肠毒素ShET1/ ShET2基因分型在同源克隆鉴定系统中的应用

目的　对福氏 2a志贺菌肠毒素ShET1和肠毒素ShET2进行基因分型 ,提高福氏 2a志贺菌同源克隆鉴定系统的分析水平。方法　综合运用质粒DNA分析、16srRNA基因探针分析及随机PCR分析方法对 93株分离自不同地区 ,不同时间的福氏 2a志贺菌进行多生物学标志分型 ,同时引入志贺菌肠毒素ShET1/ShET2基因PCR分析法检测福氏 2a志贺菌。结果　质粒DNA分析、RAPD分析、16srRNA基因探针分析三种方法联合运用 ,可将 93株S flexneri 2a分成 19个克隆群 ,克隆分辨率为 2 0 4 3% (19/ 93) ,引入毒素ShET1/ShET2基因PCR分析 ,可新增加 8个克隆群 ,克隆分辨率为 2 9 0 3% (2 7/ 93) ,克隆分辨率提高 8 6 0 % (8/ 93)。 93株福氏 2a志贺菌按志贺菌肠毒素分为 4种基因型 ,即 12株ShET1(- ) /ShET2 ( ) ,14株ShET1( ) /ShET2 (- ) ,5 9株ShET1( ) /ShET2 ( ) ,8株ShET1(- ) /ShET2 (- )。结论　在应用多生物学标志进行福氏 2a志贺菌同源克隆鉴定系统研究时 ,肠毒素ShET1/ShET2基因PCR分析是不可或缺的分析指标。     

香港海鸥形菌多重PCR及嵌合荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立香港海鸥形菌(Laribacer hongkongensis, LH)的多重PCR(multi-PCR)及嵌合荧光法(SYBR Green I)PCR检测方法,并对其在临床及环境微生物方面的应用前景进行评价。方法 通过对62株香港海鸥形菌16S RNA 基因和16S-23S rRNA基因间隔区(16-23S rRNA intergenic spacer region, ISR)进行PCR扩增和多序列比对,设计两对特异性引物,建立多重PCR体系,用15种细菌性腹泻标准菌株及临床菌株进行PCR特异性和敏感性检验;并在此基础上针对两对引物分别用嵌合荧光PCR法进行浓度梯度检测,以确定最低检测限。结果 香港海鸥形菌多重PCR法特异性为100%,最低检出限为5×10³ CFU/mL菌液;而嵌合荧光PCR法两对引物的最低检出限均达到5×10² CFU/mL菌液。结论 该法的建立为临床及环境微生物学提供了一种快速和灵敏的香港海鸥形菌检测手段。     

北京市西城区2005-2007年志贺菌毒力相关基因的检测与分析

目的对西城区2005-2007年来收集的志贺菌进行毒力相关基因检测并分析其分布情况,同时建立多重PCR方法检测志贺菌。方法利用志贺菌中四个主要毒力相关基因ipaH、ial、set1A、set1B的引物分别对所收集的志贺菌进行PCR方法检测与分析,并且建立了毒力相关基因多重PCR方法的反应条件。结果ipaH基因存在于所有志贺菌中,set1A、set1B基因仅存在福氏志贺菌中,ial基因在反复复苏的菌株中检出率有所下降,尤其以宋内缺失率高(49%);多重PCR方法检测志贺菌方便快捷,而且可以初步分型。结论志贺菌菌型分布发生了变化,毒力相关基因的分布也相应地有所不同;多重PCR具有志贺菌的快速诊断价值。     

特异引物PCR和基因型特异探针杂交法在HBV基因分型中的临床应用

分别采用特异引物PCR和基因型特异探针杂交（试剂盒）对99例慢性乙肝病毒感染（慢乙肝）患者血清HBV进行基因分型。结果特异引物PCR法鉴定为B型34株，C型59株，D型1株，AB混合型1株，BC混合型3株，未被分型1株；特异探针杂交法鉴定为B型33株，C型61株，D型1株，BC混合型3株，未被分型1株。两种分型方法一致率为95．96％（95／99）。认为两种分型方法各有优缺点，特异引物PCR法较为适用且经济。     

陕西省O157出血性大肠杆菌分布研究

目的了解陕西省家禽家畜O157大肠杆菌带菌和致病力情况以及市售食品的污染状况,分析对人群可能造成的威胁。方法根据我省不同地域选择监测点,采集监测点内养殖场或个体养殖户养殖的动物粪便1657份;集贸市场和超市销售的7类食品样品877份进行O157大肠杆菌监测,应用PCR技术对分离菌株进行毒力基因检测和流行病学分析。结果从动物粪便中分离出64株O157大肠杆菌,总带菌率3.86%,其中奶牛带菌率最高,达10.89%。从食品样品中分离出6株,总污染率0.68%。70株分离菌通过PCR检测发现,大多数O157大肠杆菌不携带H7鞭毛素fliCH7基因以及stx1、stx2、eaeA、hlyA4种毒力基因,含有fliCH7基因的9株菌则全部携带有stx2、eaeA、hlyA毒力基因,表现为fliCH7基因与已知毒力基因的相关性及分离菌株毒力基因图谱的一致性。结论陕西省猪、牛、鸡动物存在有O157大肠杆菌,并且食品已受到污染,所显示的毒力基因图谱单一,提示陕西省存在有O157大肠杆菌感染的威胁,有造成O157大肠杆菌流行或局部暴发流行的可能。     

黏质沙雷菌随机扩增多态性DNA法基因分型及意义

目的 探讨黏质沙雷菌（SM）随机扩增多态性DNA（RAPD）法基因分型及意义。方法 以优化的反应体系及单一随机引物AV15对临床分离的109株SM进行RAPD分析并按指纹图上DNA条带数及片段大小绘制基因分型图谱。结果 109株SM共得78种RAPD型。结论 RAPD法可用于SM的基因分型。     

Diagnosis and genotyping of Helicobacter pylori by polymerase chain reaction of bacterial DNA from gastric juice

BACKGROUND: Efficient and accurate detection of Helicobacter pylori infection as well as identification of virulence-associated alleles are important for the treatment of gastroduodenal diseases caused by this gastric pathogen. The present study was performed to test the efficiency of gastric juice polymerase chain reaction (PCR) method for the rapid detection of H. pylori infection and to determine the bacterial genotypes without the need for culture, which is often not feasible especially in developing countries. METHODS: DNA was extracted from gastric juice samples collected from 45 subjects and was used to amplify urease B gene (ureB) for H. pylori. Results obtained from this method were further confirmed by rapid urease test (RUT), histology and culture. Genotypes of the infected strains predicted from gastric juice PCR were compared to the genotype data obtained from the isolated strains. RESULTS: Among 45 cases, 32 were positive by RUT, 37 by histological examination, 25 by gastric juice PCR method, while culture yielded positive results for 19 samples. Except for one case, all the 19 culture-positive strains gave the same genotype with the gastric juice PCR result. It was found that the gastric juice PCR is more efficient for detection of multiple-strain infection as compared to genotype data obtained from strains isolated as pooled culture. CONCLUSIONS: This moderately sensitive technique could be employed with good efficiency, particularly in cases where it is difficult to obtain biopsy. Moreover, with this method bacterial genotype could be obtained.     

Prevalence of Escherichia coli possessing the eaeA gene of enteropathogenic E. coli (EPEC) or the aggR gene of enteroaggregative E. coli (EAggEC) in traveler's diarrhea diagnosed in those returning to Tama, Tokyo from other Asian countries

To elucidate the importance of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enteroaggregative E. coli (EAggEC) as etiological agents in traveler's diarrhea, the detection of the eaeA and aggR gene in E. coli strains isolated from overseas travelers with diarrhea in Tama, Tokyo was carried out using a PCR method. Of 192 travelers who were mostly adults and had visited Asian countries from April 1998 to March 1999, aggR-positive E. coli strains were detected in 26 (13.5%). These strains represent the second predominant enteropathogen following enterotoxigenic E. coli (ETEC), whereas eaeA-positive E. coli strains were confirmed in seven subjects (3.6%). In 13 cases with aggR and four cases with eaeA, the organisms were detected in stool samples of patients as the only potential enteric pathogen. The clinical symptoms of these patients were similar to those in patients with ETEC; however, the severity of illness was milder than that associated with ETEC alone. Three strains with eaeA and five strains with aggR were typed as six different kinds of O serogroups, of which four strains belonged to the classical EPEC serogroups (O55, O114, O119, and O127a). These findings suggest that aggR-positive E. coli (EAggEC) is a significant causative agent in traveler's diarrhea. In addition, it was demonstrated that eaeA-positive E. coli (EPEC) is markedly correlated with diarrhea in adults.     

澳门地区鸡源性产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌基因型检测

目的 了解澳门地区鸡源性产超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)大肠埃希菌的基因型。方法 采用方便抽样的方法购买澳门地区市售的69个鸡源性产品,从中分离鉴定出103株产ESBLs大肠埃希菌,分别用CTX-M、TEM、OXA和SHV的引物对其进行PCR扩增,以此来判断它们的基因型,并用限制性片段长度多态性(RFLP)的方法对CTX-M型的产ESBLs大肠埃希菌进行初步分群, 并以纸片扩散法进行药敏试验。结果 澳门地区89.8%(62/69)鸡源性产品检测出产ESBLs大肠埃希菌,103株产ESBLs大肠埃希菌,经PCR扩增后,非重复株有84株,结果显示CTX-M型、TEM型、OXA型和SHV型分别占98.8%(83/84)、25.0%(21/84)、3.6%(3/84)和0.0%(0/84);其中23.8%(20/84)同时携带CTX-M型和TEM型,3.6%(3/84)同时携带CTX-M型和OXA型。83株CTX-M型的产ESBLs大肠埃希菌中66.3%(55/83)为CTX-M-G1,31.3%(26/83)为CTX-M-G9,CTX-M-G2和CTX-M-G8的检出率均为1.2%(1/83)。药敏试验中亚胺培南和美罗培南全部菌株敏感, 氨苄西林耐药率最高达98.8%, 其次为四环素83.3%(70/84)和阿米卡星78.6%(66/84)。结论 澳门地区鸡源性产ESBLs大肠埃希菌的检出率较高,其基因型以 CTX-M型为主,其次为TEM型,其中CTX-M型分群中以CTX-M-G1为主, 多重耐药的ESBLs大肠菌株普遍存在。     

糖尿病患者医院感染病原菌分布与影响因素分析

目的调查医院感染糖尿病患者病原菌类型及分布情况,分析患者感染相关影响因素。方法收集2019年本院收治的1059例糖尿病患者临床资料,调查患者感染部位。收集患者空腹血糖、血脂、血压等临床指标,经统计学分析影响患者各部位感染发生的相关因素。收集感染患者的标本,采用全自动微生物鉴定仪鉴定病原菌类型。挑取白色念珠菌的单菌落,经PCR验证分型。结果1059例糖尿病患者中,感染患者数407例,感染率为38.43%。其中男性患者感染190例,女性患者感染217例。患者主要发生呼吸、泌尿、皮肤软组织以及消化系统感染。各部位感染的糖尿病患者临床指标(空腹血糖、血脂、血压)不稳定者较多。性别、空腹血糖、血脂、血压是糖尿病患者发生泌尿系统、呼吸系统、皮肤软组织以及消化系统感染的影响因素(P<0.05)。从泌尿系统、皮肤软组织、消化系统感染者中分离的病原菌主要为革兰阴性菌,呼吸系统感染者中主要为革兰阳性菌。共分离147株病原菌。75株革兰阴性菌中,以大肠埃希菌为主(31株);46株革兰阳性菌中,以表皮葡萄球菌为主(26株);26株真菌中,白色念珠菌18株。白色念珠菌中,10株(55.56%)为A型,5株(27.78%)为B型,3株(16.67%)为C型,未检出D型和E型白色念珠菌。结论女性糖尿病患者发生泌尿系统感染者居多,呼吸系统感染患者数次之。临床中应注意预防女性患者发生泌尿系统感染。A型白色念珠菌检出率较高,应给予重视。     

广州东部HPV基因型分布及其优势基因型E6／E7核酸序列分析

目的研究广州东部人乳头瘤病毒基因型分布特征,并获取优势基因型早基因E6／E7的核酸序列,进行变异分析,为本课题组下一步新型分子诊断方法的研发提供目标序列。方法通过导流杂交基因芯片技术进行宫颈脱落细胞标本的人乳头瘤病毒基因分型检测,分析本地区基因型分布特征,确定优势基因型;根据GenBank序列设计特异性引物,用于扩增优势基因型的早基因E6／E7的编码区序列,克隆后测序并对序列进行变异分析。结果通过导流杂交基因芯片技术进行宫颈脱落细胞标本的分型检测,检测了536份宫颈脱落细胞标本,HPV阳性占27.2％（146／536）,其中多基因型感染占29.5％（43／146）,高危型感染中52型为优势基因型,频数达23.3％（37／159）。HPV感染与52型HPV感染的年龄分布显示低年龄组（即A组,≤25岁）妇女最高。3份52型HPV感染阳性标本的核酸模板,通过特异性引物均成功扩增出大小接近750bp的目的序列;分别克隆到T载体上并测序,得到3条人乳头瘤病毒52型早表达基因E6／E7的编码区序列,克隆后测序并对序列进行变异分析;3条序列经BLAST分析,与GenBank数据库HPV52型序列（Accession：X74481）的E6／E7编码区序列一致性均为99％,三条序列（EU924143、EU924144、EU924145）存在6种碱基置换,其中2种可引起所编码的相应氨基酸残基改变。结论本研究可确认广州东部地区妇女宫颈感染HPV中A组（17-25岁）具有最高的感染率;宫颈感染HPV的优势基因型为52型;我们通过克隆策略得到了与HPV高危型52型X74481高度相似的E6／E7编码序列,为课题组后续进行的HPV致病机制和新型分子检测方法研究提供了重要基础。     

自发性细菌性腹膜炎病原菌大肠埃希菌74株药敏分析

目的分析肝病患者自发性细菌性腹膜炎病原菌大肠埃希菌的药敏检测,以供临床治疗参考。方法回顾性分析74例肝病患者经腹水培养筛选出的74株大肠埃希菌,按照院内感染和非院内感染检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）阳性菌株,采用Kirby—Bauer法检测药物敏感性。结果74株大肠埃希菌中,36株为院内感染,38株为非院内感染,两组患者年龄、性别、病情严重程度比较无显著性差异,ESBLs阳性株分别为21株（58．3％）和18株（47．4％）,两组比较无显著性差异（P=0．3450）。大肠埃希菌产ESBLs率高,产酶大肠埃希菌呈多重耐药,对氟喹诺酮类药物、三代和四代头孢菌素耐药率高,对亚胺培南、阿米卡星、头孢美唑敏感率高。除复方新诺明外,院内感染和非院内感染的大肠埃希菌对常用抗菌素耐药率间无显著性差异。结论无论院内感染还是非院内感染,引起重型肝病患者自发性细菌性腹膜炎的常见病原菌大肠埃希菌对常用抗菌素的耐药性明显较高,氟喹诺酮类药物、三代和四代头孢菌素耐药率高,加用β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂敏感率可提高,头孢美唑、亚胺培南可作为首选抗菌素。     

两种新发现的乙型肝炎病毒/C基因亚型的鉴定

目的 了解我国西部新发现的两种HBV C/D基因型重组体的基因型特点.方法 采用PCR对来自我国西部地区的17株HBV全基因组序列进行扩增,并利用生物信息学软件对其全基因组结构、遗传距离及重组位点进行分析.结果 两种HBV C/D基因型重组体与HBV基因型A、B、D、E、F的异质性>8%,而与C基因型的异质性为3.8%～8.0%.进化树分析发现,所有C/D重组体与基因型C形成一个大分支,但又独立于C基因型的其他5种哑型而形成明确的另外两个分支,即两个新的HBV/C基因亚型.结论 两种HBVC/D重组体从遗传距离分析属于与C1～C5亚型不同的新的HBV/C基因亚型.     

医院获得性血流感染395例临床分析

目的 了解医院获得性血流感染的临床特点、病原菌分布及其耐药性.方法 参照卫生部医院感染诊断标准.对复旦大学附属华山医院 1995年1月至2004年12月所有血培养阳性的患者病史进行回顾性调查分析.按常规方法进行细菌分离、鉴定,细菌药物敏感试验采用Kirby-Bauer纸片扩散法,WH()NET 5.0进行分析.结果 华山医院1995到2004年十年间病史资料完整的医院获得性血流感染患者共395例.共分离获435株病原菌,其中革兰阳性菌占47.4%、革兰阴性菌占45.1%、真菌占7.6%.最常见的病原菌依次为凝固酶阴性葡萄球菌(21.4%)、金黄色葡萄球菌(17.9%)、大肠埃希菌(13.6%)、肺炎克雷伯菌(10.8%)、念珠菌属(7.4%)、肠球菌属(6.0%)、假单胞菌属(6.0%)及不动杆菌属(3.7%).金黄色葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌中甲氧西林耐药菌株分别占62.8%和87.1%.大肠埃希菌和克雷伯菌属对头孢噻肟和头孢他啶的敏感度为46.0%～78.0%和27.7%～40.4%.结论 医院获得性血流感染病原菌中革兰阳性菌检出率略高于革兰阴性菌.对常用抗菌药物耐药程度高.念珠菌属在血流感染中占有重要地位.