用双重式聚合酶链反应技术检测鼠疫现场材料的应用研究

采用双重式聚合酶链反应（Ｐｌａ－Ｆ１－ＰＣＲ）技术，对山县鼠疫现场部分材料经８％Ｃｌｅｘｅ－１００）处理后进行扩增，以探讨本法在现场的应用，结果从采集的１１份材料（鼠类１０份，病人淋巴穿刺液１份）中扩增出４份阳性，高于常规实验诊断，提示本法可为鼠疫诊断提供新的检测手段。     

重庆市巫山县鼠疫疫源地调查

目的了解三峡库区巫山县段鼠疫主要宿主动物和媒介蚤类的种类构成、数量分布以及宿主动物感染鼠疫菌的情况,判断当地是否存在鼠疫疫源地。方法采用笼捕法,对捕获鼠类及检获蚤类进行鉴定;计算鼠带蚤率和蚤指数;用间接血凝试验(IHA)检测鼠疫F1抗体。结果捕获鼠形动物63只,鼠密度为1.26%;共梳检鼠蚤132只,染蚤率49.21%,蚤指数2.10;布放粘蚤纸1 217张,未捕获地面蚤;对捕获的活体鼠形动物全部进行鼠疫血清抗体检测,结果均为阴性。结论巫山县虽然未曾发生鼠疫,也不是鼠疫疫源地,但从地理景观、宿主动物、媒介昆虫等方面分析,均存在鼠疫疫源地的条件,有发生鼠疫疫情的可能性。     

甘宁阿拉善黄鼠鼠疫疫源地1991～2000年鼠疫监测报告

1991－2000年对某宁阿拉善黄鼠鼠疫疫源地连续开展了10年鼠疫监测，结果表明该疫源地动物鼠疫散在流行，其主要宿主黄鼠密度0．7－2．3只／hm^2，鼠体蚤指数为2．5，洞干蚤指数为0．3，巢蚤指数为3．9。剖检各种动物材料34240份，检出鼠疫菌4株，昆虫材料37719份，结果阴性，做间接血凝44499份，判定阳性90份。10年来在动物鼠疫流行较为活跃的情况下，连续38年未发生人间鼠疫。     

天山山地鼠疫自然疫源地鼠疫媒介非透明标本分类方法简介

我国现已判定11块鼠疫自然疫源地,共发现蚤类583种,有51种可自然感染鼠疫菌,天山山地鼠疫自然疫源地在自然条件下携带鼠疫菌的跳蚤有9种。我们在鼠疫监测和鼠疫防治工作中,对主要传播鼠疫的媒介蚤进行分类鉴定很重要,方法是对采集的跳蚤进行清除内脏、消毒、脱水等一系列措施后     

应用聚合酶链反应检测蚤体中鼠疫菌

鼠疫菌主要感染啮齿动物,并通过蚤从感染的宿主传播给未感染的宿主,人可通过接触染疫动物或被疫蚤叮咬而感染鼠疫。因此,发现和判定鼠疫菌在这些动物和其寄生蚤中的存在是鼠疫监测的重要组成部分。从蚤体中分离鼠疫菌,通常采用的细菌学方法和动物实验方法,此法虽然可靠,但耗时长,检出率低。近年来,国内外学者应用ＰＣＲ技术诊断鼠疫菌取得了可喜的进展［１,２］。本文应用此技术,直接检测蚤体内鼠疫菌。１材料与方法１．１菌株 ＥＶ７６ｐ为全国鼠疫布氏菌病防治基地保存。１．２实验动物和蚤 均为全国鼠疫布氏菌病防治基地动物室…     

耿马县孟定镇鼠疫流行病学调查

１９９６年４－５月，云南省耿马县孟定镇发生鼠疫流行。经流行病学调查，病原学及血清学检验确诊腺鼠疫患者１例。从黄胸鼠体内分离到鼠疫菌４株，印鼠客蚤体内分离到鼠疫菌１株，鼠类脏器查出Ｆ１抗原阳性３份。     

长尾黄鼠感染鼠疫菌越冬试验初报

在人工条件下,进行了长尾黄鼠感染鼠疫菌后的带菌越冬试验。两年共感染黄鼠９０只,其中４０只冬眠,冬眠期死亡鼠仅从局部淋巴腺体培养到鼠疫菌;冬眠结束后,将醒眠鼠处死,未培养到鼠疫菌;抗体检查阳性率为６８％,抗体滴度主要在１：３２～１：６４之间。提示长尾黄鼠可以带菌进入冬委但其带菌越冬的可能性不大,在保存鼠疫菌越冬的作用上,可能低于其主要寄生蚤－方形黄鼠蚤。     

聚合酶链反应在我国各生态型鼠疫菌检测中的应用

应用聚合酶链反应对我国各生态型鼠疫菌进行检测，结果被试的３７株鼠疫菌扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析均呈现单一ＤＮＡ带，其分子量大小与预期结果下符合。而假结核菌、结肠炎菌等均末见扩增带。     

鼠疫菌pYC质粒标识基因在动物及蚤检测中的应用

目的评价云南鼠疫菌pYC质粒标识基因的特异性及在鼠疫监测中的应用。方法应用pYC质粒标识基因引物yd1，yd2并以鼠疫菌特异性基因pla，fra作为对照进行PCR实验，观察实验室感染标本和现场样品的检出情况。结果共检测实验感染动物脏器8份，均为阳性。检测现场收集的黄胸鼠脏器22份，阳性6份，阳性率27.27%。检测感染的蚤类67份，阳性13份，阳性率19.40%，试验引物yd1，yd2与对照引物pla，fraPCR检测结果其特异性和敏感性均一致。结论将yd1，yd2引物，联合pla，fra引物，建立鼠疫PCR快速诊断方法，应用于云南、广西、贵州判断鼠疫菌、监测鼠疫信息，具有重要的实际意义。     

普洱县鼠疫复燃与控制

普洱县于1995年4月,以县城为中心的2个乡(镇),5个疫点鼠疫流行,共检出鼠疫菌14株、其中从黄胸鼠检出9株,印鼠客蚤检出3株,缓慢细蚤检出1株,人的淋巴穿刺液检出1株。RIHA阳性6份,人血清学检验阳性2份(其中1例淋巴穿刺液检出鼠疫菌株)。犬血清阳性4份,本次鼠疫流行在鼠、蚤、犬、人体内都证明被鼠疫菌感染,经疫区处理基本控制疫情。调查与控制结果如下     

快速检测细菌并革兰分型的半巢式聚合酶链反应及其初步应用

目的以半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细菌及作革兰阴、阳性分型,并与细菌培养法比较。方法以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物(pm1,pm3)和一条革兰阴性型特异性引物(pm2),以半巢式PCR方法扩增实验室保留菌株的DNA并作出革兰染色分型;以人类外周血白细胞基因组DNA、HBVDNA阳性血清以及白假丝酵母菌为对照,检测此方法的特异性;采用倍比稀释菌液作敏感性实验;与细菌培养法比较,验证此方法检测临床标本的敏感性。结果对17个实验室保留菌株进行检测,以通用引物对作第1次PCR均得到371bp长度的DNA片段;再以革兰阴性菌特异引物对(pm2,pm3)作第2次PCR,9种阴性菌均得到353bp的DNA片段,而8种阳性菌未被扩增。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明,采用半巢式PCR可检测出3个CFU的细菌。对120份临床标本检测,半巢式PCR检测阳性率(29.2%)显著高于细菌培养法检测阳性率(17.5%)。结论此半巢式PCR检测细菌方法,具有特异、敏感、快速的特点,并能对细菌进行革兰阴性、阳性分型,可用于临床感染性疾病的初步诊断。     

从动物和土壤中直接检测鼠疫耶尔森氏菌

目的　探讨用防污染的 PCR- EL ISA(U DPE)技术检测人为污染的土壤和感染的动物标本的可行性。方法　根据鼠疫耶尔森氏菌 Cafl和 Pla基因分别设计了 3条引物 ,组合成 3对引物 ,建立 U DPE检测技术。结果　利用该实验体系可以检出每克土壤中 10 0 0个鼠疫耶尔森氏菌的污染。比检测纯细菌的敏感性低 2 0 0倍 ,说明土壤中有抑制 PCR反应的因子。对 2 0只实验组动物 40份标本 (肝脏和脾脏 )的培养、U DPE和 PCR-电泳检测表明 ,3种方法的检出吻合率为 10 0 % ,均能从 40份标本中检出靶细菌 ,而用 3种方法检测对照组动物的 2 0份肝脏和脾脏均为阴性。结论　利用 UDPE技术可以被用于动物脏器中鼠疫耶尔森氏菌的检测     

改良菌落PCR法筛选、鉴定DHBV部分核衣壳蛋白基因的重组克隆

目的优化并验证改良菌落PCR程序的有效性。方法经常规PCR扩增DHBV编码核衣壳蛋白与DNA多聚酶重叠区的部分核苷酸片段(DHBc-dp),纯化特异性扩增产物并连入pMD 18-T载体,转化DH5α感受态细胞后涂布于Amp加倍的LB平板,记为亲代样品(PS),37℃培养12h,室温放置4h～8h。无菌操作挑取细菌转入优化的PCR反应液扩增、鉴定;余菌体室温放置完成二次生长。PS剩余PCR鉴定产物继代转化并涂布LB平板,记为继1代样品(F1S),同样进行菌落PCR鉴定。选取PS和F1S中PCR强阳性样品进行扩增及菌液PCR、质粒PCR、质粒酶切和测序鉴定。结果挑菌后的菌落二次生长成面积扩大的菌苔;优化菌落PCR反应体系保持、甚或提高了原有方法的高度特应性和稳定性;携外源目的片段的重组质粒在菌落PCR反应过程中能保持结构完整,并能在继代转化宿主细胞中忠实复制与扩增。结论改进的菌落PCR程序,继承了既有菌落PCR程序鉴定重组克隆的特异性和高效性,并能有效预防阳性转化子的丢失;同时,在增加优势抗性菌落生长量的前提下有效地抑制了卫星菌落的生长。     

人呼吸道腺病毒通用特异检测试剂的研究及应用

目的 建立一种特异性强,灵敏度高,操作简便的呼吸道腺病毒榆测方法 ,为临床呼吸道腙病毒通用特异诊断试剂的研发奠定实验基础.方法 用生物信息学软件DNAMAN 5.2.2,Gene Runner 3.05,BLAST对GenBank中已收录的10个型别人呼吸道腺病毒核酸伞序列进行比对分析,找出高度保守序列,设计5对腺病毒通用特异引物,同时确保PCR产物具有型别特异性.用NP-40裂解法制备模板,对引物的有效性,特异性及灵敏性进行验证,并应用于64例急性呼吸道感染患儿咽拭子标本的榆测,阳性标本的PCR产物直接测序鉴定血清型.将阳性标本接种HeLa细胞,光镜下观察细胞病变,电镜下观察病毒形态.结果 BLAST结果 表明,5对引物与其他病毒,细菌及人类基因组等无高度同源性,是腺病毒特异性引物.用5对引物扩增人3型腺病毒DNA,均出现阳性H的条带,但不能检测呼吸道合胞病毒柯萨奇病毒,验证了引物的有效性和腺病毒特异性.模板稀释,病毒稀释均可检测列10-5梯度,说明引物具有较高的灵敏性,同时验证了NP-40裂解法的稳定性.64例临床叫拭子标本中检测出2例阳性标本,阳性率为3.13%(2/64).阳性标本接种HeLa细胞,光镜下可见细胞变圆,聚集成葡萄串状,脱落等腺病毒所致细胞病变,电镜下可见细胞核内有典型的晶格状排列的腺病毒颗粒.PCR产物测序结果 表明,2株病毒均为B组腺病毒.结论 成功设计了腺病毒通用的,特异的,同时扩增产物又具有腺病毒型别特异性的引物.用该引物建立的PCR方法 检测呼吸道标本中的腺病毒DNA具有灵敏和特异的特点,适用丁临床常规诊断腺病毒感染.     

双重式PCR检测鼠疫流行现场动物脏器的结果分析

目的探讨双重式聚合酶链反应(Pla-FI-PCR)技术在鼠疫流行现场检测动物脏器的应用。方法应用双重式PCR技术，采用简单的加热法处理模板，对罗平县的50份动物脏器进行检测。结果检出阳性22份，阳性率为44％，其中活鼠脏器阳性11份。结论提示双重式PCR检测活鼠材料作为早期发现疫情具有一定的应用价值。     

Genetic characterization and transovarial transmission of a typhus-like rickettsia found in cat fleas.

The identification of apparently fastidious microorganisms is often problematic. DNA from a rickettsia-like agent (called the ELB agent) present in cat fleas could be amplified by PCR with conserved primers derived from rickettsial 17-kDa common protein antigen and citrate synthase genes but not spotted fever group 190-kDa antigen gene. Alu I sites in both the 17-kDa and citrate synthase PCR products obtained with the rickettsia-like agent and Rickettsia typhi were different even though both agents reacted with monoclonal antibodies previously thought specific for R. typhi. The DNA sequence of a portion of the 17-kDa PCR product of the rickettsia-like agent differed significantly from all known rickettsial sequences and resembled the 17-kDa sequences of typhus more than spotted fever group rickettsiae. The rare stable transovarial maintenance of this rickettsia in cat fleas has important implications for the disease potential of cat fleas.     

Bartonella henselae infection in domestic cat and dog fleas

We studied on the infection of domestic cat and dog fleas with Bartonella henselae by polymerase chain reaction (PCR). A total of 62 fleas (36 Ctenocephalidis felis from cats, 24 C. felis from dogs and 2 Ctenocephalidis canis from dogs), stored in 70% ethanol, were analyzed by PCR for B. henselae specific DNA. Of the 62 fleas, C. felis from cats and dogs were positive for B. henselae specific DNA in 12 of the 36 (33.3%) and in 5 of the 24 (20.8%), respectively, and C. canis from dogs was positive in 2 of the 2 (100%). Our results demonstrated that pet fleas were infected with B. henselae, and suggest that flea transmission of B. henselae between cats or dogs may occur, and direct transmission of B. henselae from pet fleas to human may cause cat scratch disease.     

High infection rate of Wolbachia endobacteria in the sand flea Tunga penetrans from Brazil

Tunga penetrans is an ectoparasite causing considerable morbidity in endemic communities. Recently, endobacteria of the genus Wolbachia were identified also in T. penetrans. Since Wolbachia were suggested as targets for intervention of insect pests and human filariasis, sand fleas were collected from infested humans, dogs and rats in a hyperendemic area in northeastern Brazil, and screened for Wolbachia infections. Twenty-one adult fleas and four batches of flea eggs were examined by PCR using primers targeting the 16S rDNA, the DNA coding for FtsZ cell-cycle protein or a Wolbachia surface protein (WSP-1). Wolbachia were detected in all examined samples from eggs, free-living male and female fleas and from neosomic female fleas. No Wolbachia DNA was detected in two samples containing flea faeces. In addition, Wolbachia were labelled by immunohistology in the ovaries of 37 female fleas using antisera raised against WSP-1 of Wolbachia the filarial parasite Dirofilaria immitis. In the vicinity of the embedded fleas containing the Wolbachia, infiltrations of neutrophils and macrophages were observed. This study showed that Wolbachia endobacteria are abundant in T. penetrans and that all examined fleas were infected by these endobacteria. Our findings may have important implications for the future development of control strategies for human tungiasis.     

多重PCR快速鉴定大肠杆菌O157

目的根据GenBank中编码大肠杆菌16SrRNA的基因、rfbE(O157抗原基因)、vt1(Vero毒素1基因)、vt2(Vero毒素2基因)和eaeA(紧密素基因)5种基因的特异性序列,设计合成5对引物,建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法。该方法的检测敏感度为细菌纯培养物为104CFU/ml,含菌3-4CFU/g鸡肉组织样品经预增菌8h后能检出。用此方法检测2000-2004年间从动物组织和粪便中临床分离的64株菌株,结果10株鉴定为大肠杆菌O157,与血清凝集试验结果完全吻合。其中8株能扩增上述5条特异性条带,与预期产物完全一致,2株能扩增出除vt1基因外的4条特异性条带,其它54株菌株只能扩增出大肠杆菌16SrRNA。该方法能直接鉴定产多种毒力因子的大肠杆菌O157,特异性强,为检测和鉴定大肠杆菌O157提供了一个新方法。