特异,快速,简便,经济的淋病检测试剂盒的研制

本研究成功地制备了多株淋球菌主要外膜蛋白的单抗，并以胶体金标记，制备兔抗外膜蛋白多抗。在硝酸纤维素膜条上下打点包被多抗，加经处理的被检样品和胶体金标记的单抗，直接显色，与细菌培养法一同检测标本３１２例，两法检测结果符合率为９９．３６％。结果表明两者特异性，灵敏度基本一致，本试剂稳定性，重复性好，且操作简便，不用仪器，１５分钟内即可得到结果。     

胶体金免疫层析检测犬、猫抗狂犬病病毒IgG抗体的研究

目的建立检测犬、猫抗狂犬病病毒(RV)IgG抗体的胶体金免疫层析方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金用以标记SPA,同时将重组RVN蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,制备一种检测犬、猫抗RVIgG抗体的胶体金检测卡,进行了特异性和灵敏度试验,并与ELISA同时检测临床样品、统计结果。结果 GICA试纸条检测灵敏度为0.5IU/mL,与犬瘟热病毒、犬细小病毒等阳性血清无交叉反应,并与ELISA相比,两者的符合率为94.6%。结论成功建立了检测犬、猫抗RVIgG抗体的通用型胶体金免疫层析方法 ,该方法灵敏度高,特异性强,检测速度快,操作简便,可广泛应用于基层。     

牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基单克隆抗体胶体金标记试纸条制备

目的 本研究通过优化牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚单位单克隆抗体的性能,制备胶体金标记检测牛乳腺炎无乳链球菌的试纸条。方法 利用pET30a(+)-BP重组质粒表达蛋白纯化物免疫小鼠,无菌取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选杂交瘤细胞,制备单克隆抗体,对单克隆抗体进行胶体金标记后制备检测试剂盒,并确定其灵敏度、特异性等技术指标。结果 经数轮筛选,获得1株阳性杂交瘤细胞株,抗体效价达到1∶256 00。胶体金标记试纸条灵敏度量达到10⁶ CFU/mL。特异性测试结果表明,胶体金标记试纸条与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌、化脓性链球菌培养物人工污染的牛乳样均无阳性反应,只与无乳链球菌乳样出现阳性结果。结论 该胶体金标记免疫层析试纸条,具有实际应用价值,将为牛乳腺炎的筛查检测提供新型、便捷的技术产品。     

弓形弓形虫抗原检测方法的研究

本研究制备了与多种寄生虫抗原无交叉反应的抗弓形虫单抗B6C3和兔抗弓形虫多抗,多抗为捕获抗体,单抗为检测抗体,建立单-多抗夹心ELISA方法。用亲和素连接分别标记生物素的抗体和酶,建立ABC(avidin-biotin-peroxidase complex)-ELISA[D1]方法。同样用亲和素连接标记生物素的抗体和DNA片段,利用PCR反应对DNA片段巨大的扩增能力,提高检测灵敏度,发展单-多抗夹心ELISA为免疫-PCR(I-PCR)检测弓形虫抗原。单-多抗夹心ELISA检测弓形虫抗原最低浓度为0.6μg/ml,ABC-ELISA检测最低浓度为0.075μg/ml。I-PCR检测最低浓度为0.1ng/ml,检测弓形虫抗原灵敏度高于传统ELISA法6000倍,高于ABC-ELISA法750倍。     

夹心免疫-PCR检测旋毛虫循环抗原的研究(英文)

目的建立以多抗为捕获抗体和单抗为检测抗体的夹心免疫-PCR检测旋毛虫循环抗原。方法利用杂交瘤技术制备抗旋毛虫单抗;旋毛虫抗原免疫家兔,分离纯化兔血清,制备兔抗旋毛虫多抗。多抗作为捕获抗体包被酶标板,单抗为检测抗体,选择适宜多抗和单抗浓度,建立夹心ELISA方法,再利用亲和素和生物素的高结合力连接起标记了生物素的抗体和DNA片段,将抗原抗体特异反应的免疫技术同无限扩增DNA片段的基因检测技术结合,利用PCR反应对DNA片段的扩增能力,提高检测灵敏度。结果制备了兔抗旋毛虫多抗,间接ELISA法筛选出与多种寄生虫抗原无交叉反应的单抗F4C6,夹心ELISA检测旋毛虫抗原最低浓度为0.05μg/ml,免疫PCR方法检测最低浓度为0.1ng/ml。结论首次建立夹心免疫-PCR检测旋毛虫抗原的方法,检测旋毛虫抗原的灵敏度高于传统ELISA方法104倍。     

Em18重组抗原特异性抗体的制备及对循环抗原检测的初探

目的 用Em18重组抗原ReEm18制备特异性抗体,建立双抗体夹心ELISA,检测患者血清中的循环抗原.方法 ReEm18经亲和纯化,免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,分别制备单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗).用获得的单抗和多抗建立双抗体夹心ELISA,检测患者血清中Em18循环抗原.结果 免疫兔血清抗ReEm18抗体效价达1∶204 800以上.经ReEm18和多房棘球蚴病(AE)患者血清及健康人血清阻断ELISA试验双重筛选融合细胞,共获得14株抑制率＞50%的特异性阳性细胞克隆.将特异性单抗和多抗自由组合进行双抗体夹心ELISA,结果以9号单抗与多抗的配对检测抗原为最优,检测ReEm18的灵敏度达3 ng/m1.用建立的双夹心ELISA方法检测血清,11份AE血清中6份为阳性.结论 获得针对ReEm18的特异性单抗和多抗,建立了敏感的双抗体夹心ELISA方法,血清学初步检测结果表明AE血清中存在可检测的Em18循环抗原.     

布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立

目的建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法。方法利用胶体金免疫层析技术,以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原,以金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁氏菌抗体,并分析方法的敏感性和特异性。结果以粒径为40nm胶体金制备的试纸条检测布鲁氏菌抗体的敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.2,SPA蛋白最适标记量为6μg/ml。交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应,特异性高。试纸条检测结果与琥红平板试验方法的符合率为92%。结论制备的布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,可用于鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫,并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染,可在基层推广使用。     

胶体金标记单抗诊断包虫病初探

胶体金标记单抗诊断包虫病初探林文玉，周学良，曹和洵，于继岗胶体金是新近发展的新一代标记物。由于胶体金制备方法简单，能和多种蛋白质交联，标记物稳定，影响因素少以及灵敏度高而发展很快，胶体金标记技术主要用于组织切片的免疫组织化学染色。针对我国西北地区人兽...     

人卡他莫拉单克隆抗体胶体金试纸的制备及初步应用

目的制备抗UspA1蛋白单克隆抗体,研制能快速、灵敏、准确检测卡他莫拉菌的胶体金免疫层析试纸,以期用于人卡他莫拉菌的临床检测。方法将重组UspA1-His蛋白作为抗原,免疫小鼠,并制备单克隆抗体;通过Western blot技术以及免疫荧光技术鉴定抗体的特异性;以双抗体夹心的原理研制胶体金免疫层析检测试纸条,并对其特异性、敏感性及稳定性进行评价分析。结果筛选出两株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,经腹水制备纯化得到单克隆抗体,并验证了两种抗体均能特异性识别天然UspA1蛋白;利用双抗夹心原理制备的胶体金试纸能在10 min内快速检测卡他莫拉菌,检测灵敏度高(1×10~5 CFU/ml)、特异性强,与其他常见9种的呼吸道病原菌诸如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌等无交叉反应;试纸条在37℃保存有良好的重复性和稳定性;200份临床样品检测结果与平板培养法的阳性符合率为93.3%。结论本研究制备了特异性强的抗UspA1蛋白单克隆抗体;以此研制的胶体金免疫层析试纸可快速、简便、灵敏的检测卡他莫拉菌,适用于呼吸道感染的临床快速检测。     

适于HIV-1 p24抗原检测试剂的单抗制备与筛选

目的制备抗HIV-1p24单克隆抗体(单抗,McAb),并利用双抗体夹心ELISA法建立HIV-1p24抗原检测试剂。方法以基因工程原核重组抗原HIV-1p24蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备单克隆抗体,单抗经纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测p24蛋白的最佳配伍单抗以期建立HIV-1p24抗原检测试剂。结果成功筛选到16株稳定分泌抗HIV-1p24单抗的杂交瘤细胞株,并从中筛选出最佳单抗配伍组合“16G12+2F2b-HRP”,该组合对p24蛋白的检测灵敏度为20pg/mL,对感染性克隆pNL4-3表达的HIV病毒培养上清检测呈阳性,对100份HIV阴性人血清无非特异性反应,显示出良好的检测灵敏度和特异性。结论本研究初步成功地建立了HIV-1p24抗原的检测试剂,并为最终建立HIV第四代诊断试剂(HIV Ag/Ab Assay)奠定了坚实的基础。     

抗博尔纳病病毒磷蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的以重组的博尔纳病病毒(BDV)磷蛋白(p24)为免疫原制备单克隆抗体,并鉴定其特异性。方法以纯化后的重组BDVp24免疫小鼠,将骨髓瘤细胞与其脾细胞进行融合,经ELISA法筛选出分泌抗p24单抗的细胞株,并对其进行克隆与亚克隆培养,将最终获得的其中2株细胞株分别注入小鼠腹腔制备单抗,经亲和纯化法纯化后,采用ELISA法测定效价,利用蛋白免疫印迹和免疫荧光鉴定其特异性。结果建立了2株稳定分泌抗p24单抗的杂交瘤细胞株,抗体亚类均为IgG1型。纯化后的腹水抗p24单抗纯度为98%和93%,ELISA效价在1∶81 000以上,该抗体均能识别重组p24蛋白和BDV感染人类少突胶质细胞(Oligodendroglia cell,OL细胞)所表达的p24蛋白。结论成功制备了灵敏性高、特异性好的抗BDVp24单抗,为博尔纳病病毒诊断方法的研制及感染机理的研讨提供依据。     

胶体金标法快速检测鼠疫F1抗体的现场应用

目的了解胶体金标快速检测试剂盒检测鼠疫FI抗体的现场应用。方法按鼠疫快速诊断盒(胶体金标法)的使用说明进行,并与间接血凝微量法(IHA)进行比较。结果检测了来自云南家鼠鼠疫流行区和非流行区血清共335份,检出腺鼠疫病人血清阳性32份,与IHA法结果一致。结论胶体金标鼠疫FI抗体快诊盒诊断鼠疫简便、快速、特异、敏感,便于现场鼠疫监测应用。     

金标免疫层析法与间接血凝法在鼠疫诊断中的比较

目的 了解胶体金快速检测试剂盒检测鼠疫Fl抗体的应用.方法 按鼠疫胶体金快速检测试剂盒的使用说明进行,并用间接血凝法(IHA)进行比较.结果 检测了采集于青海鼠疫疫源地内及非疫源地血清共3 079份,检出阳性血清268份,对照组血清14份,结果均为阴性,与IHA结果基本一致. 结论胶体金快速检测试剂盒诊断鼠疫简便、快速、特异、敏感,最适宜现场鼠疫检测.     

电泳和免疫印迹分析副溶血弧菌和溶藻弧菌主要外膜蛋白和多糖抗原

目的　考察副溶血弧菌和溶藻弧菌的主要外膜蛋白 (MOMP)及其多糖抗原 (PSA)在不同菌株间的结构特征及其免疫学特性 ,从而进一步揭示其共同的保护性抗原。方法　一步超速离心法和蛋白酶K消化法分别制备 10株副溶血弧菌和7株溶藻弧菌的MOMP和PSA ,SDS -PAGE和免疫印迹分析其结构特点。结果　两种细菌的MOMP和PSA的结构和形态菌株间差别明显 ,但也有MOMP一致的菌株 ,免疫印迹显示 ,全部的 10株副溶血弧菌和 5株溶藻弧菌都具有分子量约为36kD的主要外膜蛋白 ,他们能够被副溶血弧菌全菌抗血清所识别 ,是两种细菌共同的具有强免疫原性的主要抗原。PSA分析未见经典LPS的O侧链结构。多糖成份在菌株间的交叉反应有限 ,可能受弧菌自身表面抗原复杂性的影响 ,凝集反应结果与免疫印迹试验结果不完全一致。此外 ,副溶血弧菌与溶藻弧菌的PSA也会产生免疫学上的交叉反应。结论　 36kD的MOMP是广泛存在于副溶血弧菌和溶藻弧菌的高丰度蛋白 ;与主要外膜蛋白相比 ,多糖抗原在菌株间具有更大的异质性 ;副溶血弧菌和溶藻弧菌的MOMP可能比PSA更具研制疫苗潜力。     

E型沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

目的 表达E型沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)并制备其兔源多克隆抗体.方法 诱导表达实验室构建的MOMP/pGEX6p-1重组质粒,通过胶回收进行目的蛋白的纯化.MOMP免疫新西兰家兔制备多克隆抗体,ELISA法测定抗体效价,Western印迹、细胞免疫荧光方法鉴定抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中成功表达融合蛋白谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-MOMP.ELISA法检测抗体的效价达到1∶12 800,Western印迹结果显示抗体可与原核表达的MOMP特异性结合,细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与体外培养的沙眼衣原体特异性结合.结论 成功表达了E型沙眼衣原体的MOMP,并制备了高效价、高特异性的抗MOMP抗体,为沙眼衣原体的检测和临床研究提供依据.

Abstract：

Objective To express major outer membrane protein (MOMP) of Chlamydia trachomatis E and to prepare rabbit polyclonal antibody. Methods The recombinant plasmid MOMP/ pGEX6p-l prepared by our lab was introduced into E. coli. The protein was expressed and purified by gel recycling, then was injected into New Zealand rabbits to produce polyclonal antibodies. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the titer of antibody. The antibody specificity was identified by Western blot and immunofluorescence. Results The fusion recombinant protein glutathione S-transferase (GST)-MOMP was successfully expressed in E. coli. The titer of antibody recombinant protein detected by Western blot and to the endogenous MOMP of Chlamydia trachomatis in vitro detected by immunofluorescence. Conclusions The recombinant MOMP is successfully expressed and the MOMP antibody with high titer and high specificity is obtained. which will be helpful for Chlamydia trachomatis detection and related clinical research.     

甲状腺素运载蛋白时间分辨免疫荧光试剂盒的制备和效能评价

目的制备甲状腺素运载蛋白(transthyretin,TTR)的时间分辨免疫荧光(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)试剂盒并对其性能进行评价。方法将抗TTR的4H2单克隆抗体作为包被抗体包被至96孔板,用Eu^3+标记3E4单克隆抗体作为检测抗体,制备双抗体夹心TRFIA试剂盒,应用该试剂盒对42例川崎病(Kawasaki disease,KD)患儿及13名健康儿童的血清进行检测,以稀释回收率、准确度、精密度、稳定性等指标对试剂盒的效能进行评价。结果该研究制备的TTR TRFIA试剂盒与Western blot法同时检测42份KD临床样本和13份健康样本,两方法的结果符合率为100%,特异性强。试剂盒的最低检出浓度为0.05μg/ml,稀释回收率为88.00%~111.00%,分析内精密度为8.01%~9.17%,分析间精密度为8.88%~11.82%。稳定性实验表明该试剂盒可在4℃稳定保存6个月,37℃稳定保存7 d。结论该研究制备的TTR TRFIA试剂盒具有准确性高、方便快捷等优点,适用于大批量临床KD血清样品的TTR检测,为快速区分丙种球蛋白敏感型和无反应型的KD患儿提供了方法。     

GENSCREENULTRA HIV抗原抗体酶联免疫诊断试剂盒的敏感性评价

目的评价BIO-RAD公司开发研制的人类免疫缺陷病毒（HIV1＋2）抗原抗体酶联免疫诊断试剂盒（GENSCREEN~ ULTRA HIVAg-Ab）,对不同来源样本检测的敏感性。方法以法国生物梅里埃公司生产的HIV1＋2抗原/抗体ELISA检测试剂为参比试剂,分别使用评价试剂和参比试剂检测621例样本,分析两种试剂检测HIV抗原/抗体的敏感性。结果评价试剂和参比试剂检测502份HIV感染者/AIDS患者临床血浆标本均为阳性,符合率为100%,敏感性为100%。评价试剂和参比试剂检测92份HIV分离培养上清液,评价试剂检出89份阳性、参比试剂检出31份阳性,表明评价试剂检测HIV-1p24抗原的敏感性高于参比试剂。另外,又检测了27份HIV抗原系列稀释样本,计算出评价试剂检测HIV抗原的敏感性是参比试剂的4～8倍。结论评价试剂检测HIV抗体的效果与参比试剂相同,检测HIV-1p24抗原的敏感性高于参比试剂。     

美洲鲎G因子α亚基的原核表达及临床深部真菌感染检测方法的构建

目的验证美洲鲎来源的G因子α亚基(G Factorαsubunit,GFαSub)用于侵袭性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)检测的应用价值。方法原核表达并纯化美洲鲎G因子α亚基活性结合区域(葡聚糖天然配基),以该活性结构域包被96孔板作为捕捉元件,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的G因子α亚基作为检测显色元件,正交法构建G因子α亚基夹心法,检测36例肺部IFI患者、52例肺部细菌感染患者和40例健康人血清中(1,3)-β-D-葡聚糖,评估夹心法的检测效能及其与G试验对阳性病例测得值的相关性进行分析。结果根据NCBI提供的数据库,合成pET30a-GFαSub252-668表达质粒,并通过IPTG诱导表达、Ni-NAT柱纯化GFαSub252-668蛋白,并使用商品化HRP标记试剂盒对其进行标记。通过正交法确定包被GFαSub252-668蛋白浓度和检测HRP标记的GFαSub252-668蛋白浓度分别为8 ng/ml和16 ng/ml。运用此夹心法检测128例临床血清标本(1,3)-β-D-葡聚糖含量,肺部IFI患者组(175.2±65.8)ng/ml,与细菌感染组(46.3±17.7)ng/ml和健康组(39.4±14.9)ng/ml差异有统计学意义(F=160.1,P<0.001);根据ROC曲线计算其灵敏度和特异度分别为91.67%(95%CI:77.53%-98.25%)和82.61%(95%CI:73.3%-89.72%);其与G试验36例IFI患者血清中检测(1,3)-β-D-葡聚糖水平具有良好相关性(R2=0.7592)。结论建立的双GFαSub252-668蛋白夹心法检测(1,3)-β-D-葡聚糖具有较高的灵敏度和特异度,有望成为一种新型的IFI检测手段。     

用HIV抗原/抗体联合试剂筛查吸毒者中窗口期HIV感染者

目的筛查窗口期艾滋病病毒(HIV)感染者,并验证HIV抗原/抗体联合试剂(第四代试剂)的检测性能。方法用HIV抗原/抗体联合试剂对经HIV抗体筛查呈阴性反应的吸毒者样本进行检测,并与HIV抗原检测及HIV-1 RNA检测的结果作比较,以证实其为窗口期感染样本。结果1 934份HIV抗体阴性样本中发现3例窗口期HIV感染者;所用第四代试剂检出窗口期样本的敏感性为100%,特异性为99.28%,假阳性率为0.77%。结论用第四代试剂检测虽然可以在某种程度上缩短检测窗口期,但该试剂有一定的假阳性结果,尤其是在S/CO值较低时其假阳性比率增高,故检测时应注意S/CO值的高低,如有条件可进一步做HIV-1 RNA检测。     

抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体,为建立快速准确的狂犬病病毒抗原检测方法奠定基础。方法将狂犬病病毒Flury LEP株N基因克隆至pGEX-6P-1表达载体中,将纯化后的pGEX-6P-1-RV-N蛋白免疫BALB/c小鼠3次。取小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞融合后,用pET-32a-RV-N重组蛋白作为筛选抗原,经3次亚克隆筛选后得到1D9、2B6、3C5、6B5及5F2 5株单克隆抗体细胞株。亚类鉴定结果表明,其中1D9、2B6、6B5 3株亚类为IgG1,3C5、5F2的亚类为IgM。间接ELISA方法检测2B6单抗细胞腹水效价可达1∶106。经Protein G亲和层析柱纯化和脱盐后可得到浓度为2.5mg/mL的高纯度的单克隆抗体。其免疫荧光试验结果表明5株单克隆抗体均能特异地与狂犬病病毒结合。结论制备的单抗具有良好的特异性和敏感性,为后期诊断方法的建立奠定了基础。