肝细胞移植治疗肝硬化合并小肝综合征大鼠模型的效果观察

目的观察肝细胞移植对大鼠肝硬化合并小肝综合征的治疗效果。方法对40只雄性SD大鼠用四氯化碳皮下注射加乙醇饮用建立肝硬化大鼠模型。从肝硬化大鼠模型中随机抽取30只,分为A组(术前3 d进行肝细胞移植)、B组(手术时行肝细胞移植)、C组(不进行肝细胞移植处理),每组10只,进行70%肝脏切除,术后观察各组大鼠生存率、不同时点血生化以及肝脏HE染色病理切片变化情况。符合正态分布的计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两组间比较,方差齐采用LSD-t检验,方差不齐采用Games-Howell检验。生存率比较采用log-rank检验。结果 A组术后存活率(90%,9/10)明显高于B组(50%,5/10)和C组(30%,3/10)(χ~2=6.440,P=0. 04)。术后24 h A、B、C 3组ALT平均值分别为(860. 1±39. 9)U/L、(904. 6±35. 6)U/L、(927. 4±17. 0)U/L(F=6.808,P=0. 007),AST平均值分别为(896. 3±44. 7)U/L、(923. 8±31. 6)U/L、(950. 0±16. 3)U/L(F=3666,P=0. 047),Alb平均值分别为(25. 6±0. 5)g/L、(24. 8±0. 6)g/L、(23. 4±0. 4)g/L(F=26.577,P0. 001),A组的恢复情况均有好于B、C两组的趋势,但差异不全有统计学意义。至术后240 h 3组ALT平均值分别为(97. 8±10. 0)U/L、(128. 2±20. 7)U/L、(150. 5±14. 8)U/L(F=13.816,P=0. 001),AST平均值分别为(108. 7±10. 8)U/L、(142. 0±14. 1)U/L、(161. 0±21. 2)U/L(F=17.220,P0. 001),Alb平均值分别为(29. 1±0. 6)g/L、(28. 0±0. 2)g/L、(27. 0±0. 2)g/L(F=15.629,P=0. 001)。术后72 h肝组织病理学检查结果显示,C组大鼠肝索结构消失,大块肝细胞坏死及炎性细胞浸润,A组仅见肝细胞气球样病变,点状细胞坏死,少量炎性细胞浸润。结论肝细胞移植可有效促进肝硬化大鼠术后小肝综合征肝功能恢复及提高生存率,且治疗效果可能与细胞移植的时间点有关。     

软脉灵对大鼠非酒精性脂肪肝的预防作用

目的:观察软脉灵对非酒精性脂肪性肝病大鼠模型的预防作用.方法:采用高脂膳食喂养方式建立大鼠非酒精性脂肪性肝病模型.♂SD大鼠90只,随机分为模型组、药物组与空白对照组,每组30只.模型组应用高脂饲料喂养,药物组在高脂饲料喂养同时应用软脉灵灌胃,空白对照组应用基础饲料喂养.每组均于8,12及16 wk时各处死10只,观察肝脏指数,血清与肝组织生化指标及肝组织病理改变.结果:16 wk时与模型组相比较,药物组肝脏指数显著降低(F=51.626,P=0.000);血清胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c),丙氨酸转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)水平明显降低(2.27±0.38 mmol/L VS 3.09±0.45 mmol/L;0.83±0.13 mmol/L vs 1.03±0.18 mmol/L;0.41±0.06 mmol/L vs 1.09±0.27 mmol/L;52.0±6.50 U/L vs 79.0±4.72 U/L;182.9±26.43 U/L vs 326.5±28.21 U/L;均P<0.01),但血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平提高(0.76±0.17 mmol/L vs 0.55±0.11 mmol/L,P<0.01);肝组织丙二醛(MDA)水平降低明显(167.2±14.00 mmol/g vs 263.6±26.84 mmol/g,P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)活力增加显著(9.95±0.33 U/g vs 4.36±0.46 U/g,P<0.01),肝组织脂肪变性程度(χ~2 =19.828-20.470,均P=0.000)和炎症活动度(F =10.170,P=0.000)明显减轻.结论:软脉灵具有预防大鼠非酒精性脂肪性肝病的作用.     

蓝莓对免疫性肝纤维化大鼠细胞色素P4502E1表达的影响

目的 观察蓝莓对大鼠免疫性肝纤维化的预防作用及其对细胞色素P4502E1 (CYP2E1)表达的影响.方法 将50只健康清洁级Wistar大鼠随机分为正常对照组(A组)、肝纤维化模型组(B组)、蓝莓原浆预防组(C组)、复方鳖甲软肝片预防组(D组)、蓝莓原浆加复方鳖甲软肝片预防组(E组)共5组,每组10只.除正常对照组外,其余各组均腹腔注射猪血清制备大鼠肝纤维化模型,各预防组在造模同时分别给予蓝莓原浆或(和)复方鳖甲软肝片灌胃,1次/d,共12周.12周末处死大鼠,行肝脏病理组织学检查,测定各组大鼠血清ALT水平、肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)及羟脯氨酸(Hyp)含量,采用实时荧光定量聚合酶联反应、Western blot和免疫组织化学法检测大鼠肝组织CYP2E1的mRNA及蛋白质表达. 结果 12周末处死大鼠,A、B、C、D、E各组大鼠血清ALT水平分别为(37.9±4.5) U/L、(49.2±9.8) U/L、(39.9±6.3) U/L、(40.5±5.7) U/L及(38.2±8.4)U/L,各组间差异无统计学意义;各预防组大鼠肝纤维化程度较B组明显减轻(F=95.097,P＜0.05); C、D、E各组大鼠肝组织匀浆Hyp分别为(472.7±44.1)μg/g、(416.1±39.4)μg/g和(429.5±55.1)μg/g,低于B组的(603.2±68.9) μg/g,F=39.315,P＜0.05,差异有统计学意义; SOD水平分别为(2.5±0.4) U/mg、(2.0±0.5)U/mg、(2.2±0.2) U/mg,高于B组的(1.6±0.4) U/mg,F=25.557,P＜0.05,差异有统计学意义;MDA分别为(0.83±0.06) mol/mg、(0.96±0.08) nmol/mg、(0.85±0.06)nmol/mg,低于B组的(1.24±0.15)nmol/mg,F=46.376,P＜0.05,差异有统计学意义;B、C、D、E组大鼠肝组织CYP2E1的mRNA及蛋白质表达高于A组,C、D、E组大鼠肝组织CYP2E1的mRNA及蛋白质表达低于B组,但差异均无统计学意义.结论 蓝莓对猪血清所致大鼠肝纤维化有一定的预防作用;免疫性肝纤维化时,大鼠肝组织CYP2E1的表达无明显改变;蓝莓对CYP2E1的表达无明显影响.     

经门静脉骨髓基质细胞移植治疗肝纤维化

目的: 探讨移植骨髓基质细胞(BMSCs)减轻小鼠肝纤维化的作用.方法: BALB/c小鼠BMscs分离培养及经门静脉移植到BALB/c小鼠肝脏,二乙基亚硝胺诱导肝纤维化.60只小鼠随机分为对照组.模型组及治疗组.3 mo后测定ALT、AST、透明质酸酶(HA)和层黏连蛋白(LN)浓度,及肝脏羟基脯氨酸(Hyp)含量.免疫组化检测肝脏a.平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,及荧光原位杂交鉴定移植的BMSCs向肝细胞的分化.结果: BMsCs在添加肝细胞生长因子(HGF)的培养基中体外培养能分化为肝细胞样细胞.与模型组相比.移植BMscs能显著降低血清ALT、AST、HA和LN的水平以及肝脏Hyp含量和α-SMA的表达(208±44 U/L 341±66 U/L,372±84 U/L vs 506±81 U/L,289±74μg/L vs 362±83 μg/L,178±48 μg/L vs 232±63 ug/L,900±141 mg/g liver vs1255±205mg/g liver,,均p<0.01).荧光原位杂交显示DEN诱导的损伤肝脏中有骨髓来源的肝细胞,3 mo后10%的肝细胞来源于BMSCs.结论: 在肝纤维化模型中,经门静脉移植的BMscs能分化为肝细胞,有效地恢复肝功能和减轻肝纤维化.     

银杏叶提取物与秋水仙碱对大鼠肝纤维化预防作用的比较

目的比较银杏叶提取物(GBE)和秋水仙碱对实验性大鼠肝纤维化的预防作用。方法SD雄性大鼠40只随机分为4组:正常组(n=10)、模型组(n=10)、秋水仙碱预防组(n=10)及GBE预防组(n=10)。模型组、秋水仙碱预防组及GBE预防组给予500 mL/L CCl4腹腔注射,1 mL/kg,每周2次,共8周,秋水仙碱预防组每天同时给予秋水仙碱灌胃,0.2 mg/kg,GBE预防组每天同时给予GBE灌胃,0.3 g/kg。实验结束后,心脏取血分离血清行肝功能生化指标检测,处死动物取肝脏甲醛固定,常规行HE染色,免疫组化检测α-SMA和TGF-β1。结果光镜下组织学检查纤维化分级GBE预防组低于秋水仙碱预防组(P0.05),肝功能生化指标检测GBE预防组优于秋水仙碱预防组[ALT:(168.4±34.6)U/Lvs(210.6±40.8)U/L;AST:(318.8±62.5)U/Lvs(511.2±53.2)U/L;ALB:(31.0±2.1)g/Lvs(28.1±2.0)g/L;P均0.05],免疫组化检测α-SMA及TGF-β1蛋白表达GBE预防组低于秋水仙碱预防组(α-SMA:29.3±1.5vs5.1±2.2;TGF-β1:14.5±0.9vs28.6±0.9)。结论GBE预防大鼠肝纤维化的作用优于秋水仙碱,GBE作为一种新的抗肝纤维化药物有很好的研究和应用前景。     

小茴香精油对肝纤维化大鼠抗氧化应激损伤作用的研究

目的 评价小茴香精油在肝纤维化大鼠模型中抗氧化应激损伤及抗肝纤维化的作用.方法 肝纤维化模型的构建.SD大鼠皮下注射4ml/kg四氯化碳橄榄油溶液,同时给予高脂低蛋白饲料共5周.设空白对照组(A组)8只,正常饲养;预防阶段模型对照组(B组)10只,造模同时给予等渗盐水灌胃;小茴香预防组(C组)10只,造模同时给予小茴香精油灌胃,剂量为3 ml/kg ;治疗阶段模型对照组(D组)22只,造模后给予等渗盐水灌胃;小茴香治疗组(E组)22只,造模后给予小茴香精油灌胃,剂量为3 ml/kg;扶正化瘀对照组(F组)22只,造模后给予扶正化瘀胶囊与等渗盐水悬混液灌胃,剂量为0.4 g/kg.分别于第5周末处死A、B、C组大鼠,第6、7、8、9周末处死D、E、F组各4～6只大鼠.检测血清ALT、AST、透明质酸、层黏蛋白、8-羟基-2-脱氧鸟嘌呤含量,肝组织匀浆超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛.肝组织行HE染色、马松染色和α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色.计量资料先进行正态性检验和方差齐性检验,满足方差分析条件时采用两因素析因设计的方差分析,差异有统计学意义后两两比较采用LDL检验.不满足方差分析条件和等级资料采用秩和检验.结果A、B、C3组超氧化物歧化酶活力差异有统计学意义(286.33±37.90) U/mg、(242.22±33.21) U/mg、(323.78±53.16) U/mg, F=8.649,P=0.002);谷胱甘肽过氧化物酶分别为(297.25±54.29) U/mg、(148.62±15.57) U/mg、(221.65±53.39)U/mg(F=26.468,P=0.000);丙二醛分别为(1.01±0.37) nmol/mg、(4.29±1.85) nmol/mg、(2.00±0.42) nmol/mg (F=18.13,P=0.000);8-羟基-2-脱氧鸟嘌呤含量含量为(35.44±2.19) ng/L、(50.25±8.29) ng/L、(39.20±4.00) ng/L(F=16.332,P=0.000).炎症活动度在C组明显低于B组(Z=-2.29,P=0.022);E组轻于D组(Z=-2.51P=0.012),F组轻于D组(Z=-2.30,P=0.021);纤维化分期E组与D组差异有统计学意义(Z=-2.81,P=0.005),F组与D组比较差异有统计学意义(Z=-2.59P=0.015).结论 小茴香精油具有减轻肝脏炎症反应、防治肝纤维化进展的作用,其机制可能与抗氧化应激损伤有关.     

高血氨致大鼠急性肝损伤新模型的建立与初步分析

目的 依次建立大鼠急性肝衰竭模型,D-氨基半乳糖(D-gal)急性肝损伤模型和氯化铵(NH4Cl)诱导急性肝损伤模型,探索肝衰竭中高血氨再次诱导肝细胞损伤机制.方法 (1)大鼠急性肝衰竭动物模型建立:将雄性SD大鼠36只分为等渗盐水对照组(n=10),12h急性肝衰竭模型组(n=10),24h急性肝衰竭模型组(n=16);D-gal 400 mg/kg+脂多糖50μg/kg混合剂量给予各组大鼠腹腔注射,分别在给药后12h或24h处死各组大鼠.(2) NH4C1所致肝脏损伤动物模型的建立:将雄性SD大鼠40只分为3组:NH4Cl模型组(n=20),D-gal肝脏损伤组(n=10)和等渗盐水对照组(n=10);NH4C1模型组每8h给予NH4C1 10 ml/kg灌胃,急性D-gal肝脏损伤组则于大鼠腹腔每6d注射1次D-gal (800 mg/kg),对照组为等渗盐水10 ml/kg灌胃,30d后处死各组大鼠.(3)分别检测大鼠血氨,血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AS2);凝血酶原时间活动度比率(PT-A),甲胎蛋白(AFP),γ-谷氨酰转移酶(GGT);肝脏HE染色后观察病理变化和细胞凋亡指数;统计学分析采用秩和检验.结果 在大鼠急性肝衰竭动物模型中,12h后出现转氨酶升高[ALT和AST分别为(1202.51±282.00) U/L和(1560.14±298.98) U/L],血氨随之升高[(165.9±23.6)μmol/L],24h检测ALT、AST和血氨分别为(774.40±207.65) U/L、(967.60±121.94)U/L和(143.4±18.1)μmol/L,与等渗盐水对照组比较,P值均＜0.05.24h后转氨酶和血氨下降,但未发现AFP(除急性肝衰竭24h组外)、GGT变化;肝脏病理检查显示各组肝细胞出现片状弥漫性出血性坏死,淤血,并有灶状出血,伴随细胞凋亡指数逐渐上升.但在NH4C1所致急性肝脏损伤中,6h后即检测到血氨升高,ALT和AST同比增加,30d后检测血氨,ALT和AST进一步升高,但AFP,GGT与对照组相比,无明显差异;HE染色未见肝细胞明显变性、坏死和淋巴细胞浸润,无肝细胞再生或纤维组织增生.另外,30 d NH4Cl模型组和D-gal肝损伤组内肝组织均见较多的凋亡细胞,但D-gal肝损伤组可见明显炎性细胞侵润.除血氨外,其余检测指标与NH4C1组差异均无统计学意义.结论 在急性肝衰竭模型中,血氨随着肝细胞坏死而升高,相同血氨浓度可以导致大鼠肝脏再次损伤,但这种损伤与D-gal诱导肝损伤明显不同:不是通过肝细胞坏死,炎症细胞侵润实现,而是可能通过细胞凋亡途径,抑制肝细胞再生,进一步导致肝细胞功能受阻.     

绞股蓝皂苷和银杏叶提取物混合物对2型糖尿病并NAFLD大鼠血瘦素、脂联素和肝组织丙二醛、超氧化物歧化酶的影响

目的观察绞股蓝皂苷(gypenosides,GPS)和银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,GBE)混合物对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)并非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)大鼠血浆瘦素(leptin,LP)、脂联素(adiponectin,APN)和肝组织甘油三酯(TG)沉积量、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的影响。方法 40只SPF级雄性SD大鼠(体质量为220~250 g)随机分为空白对照组(空白组,n=7),T2DM并NAFLD模型组(n=33)。造模周期8周。将T2DM并NAFLD模型大鼠随机分为GPS治疗对照组[简称对照组,给予GPS 0.5 g/(kg·d)灌胃,n=10],GPS和GBE混合物治疗组[简称治疗组,给予GPS 0.5 g/(kg·d)联合GBE 0.1 g/(kg·d),n=10],模型对照组(简称模型组,给予同等体积的纯净水灌胃,n=10)。继续给予高糖高脂饲料,自由饮水,治疗周期为6周,实验共计14周。检测各组LP、APN、肝组织TG、MDA、SOD水平。结果①肝组织MDA变化:空白组(3.01±0.10)nmol/ml、模型组(4.78±0.12)nmol/ml、治疗组(3.60±0.09)nmol/ml、对照组(4.29±0.11)nmol/ml,治疗组低于对照组(t=15.35,P=0.000)。②肝组织SOD变化:空白组(268.4±15.2)U/ml、模型组(140.6±16.8)U/ml、治疗组(224.8±15.4)U/ml、对照组(180.6±16.0)U/ml,治疗组低于对照组(t=6.29,P=0.000)。③血APN变化:空白组(7.98±0.96)ng/ml、模型组(4.01±0.88)ng/ml、治疗组(5.92±0.12)ng/ml、对照组(5.11±0.10)ng/ml,治疗组低于对照组(t=16.40,P=0.000)。④血LP变化:空白组(2.82±0.58)ng/ml、模型组(7.89±0.68)ng/ml、治疗组(4.68±0.86)ng/ml、对照组(5.89±0.76)ng/ml,治疗组低于对照组(t=3.73,P=0.004)。⑤肝组织TG:空白组(30.26±2.48)mg/g、模型组(228.46±8.48)mg/g、治疗组(153.12±9.98)mg/g、对照组(196.24±9.78)mg/g,治疗组低于对照组(t=9.76,P=0.000)。结论 GPS和GBE混合物通过抑制脂质过氧化,调整LP/APN平衡,以减少TG在肝组织的沉积。     

肾素血管紧张素系统在非酒精性脂肪性肝病发病机制中的实验研究

目的 探讨肝组织肾素血管紧张素系统在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病机制中的作用.方法 取Wistar大鼠24只均分为模型组和对照组.对照组予正常饮食,模型组予高脂饮食,8周后处死大鼠,测定血清肝功能、血脂、血糖和胰岛素,分别以HE染色和苦味酸-天狼星红染色进行肝组织病理学观察,ELISA法测定肝组织血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)浓度,免疫组织化学法测定肝组织转化生长因子(TGF)-β1表达水平.结果 模型组大鼠高脂喂养8周后,体质量、肝指数、肝功能、血脂、血胰岛素显著高于对照组[体质量:(463.50±22.72)g比(405.12±10.32)g;肝指数:(3.75±0.21)比(2.66±0.15);ALT:(79.8±8.6)U/L比(58.8±11.6)U/L; AST:(200.01±51.72) U/L比(150.30±37.27)U/L;胆固醇:(3.67±0.48)mmol/L比(1.50±0.23)mmol/L;三酰甘油:(2.06±0.40) mmol/L比(0.71±0.34) mmo1/L;胰岛素:(17.37±2.89)pmol/L比(11.08±2.12) pmol/L],差异均有统计学意义(均P＜0.01).模型组大鼠病理组织学均出现明显的肝脂肪变性,且部分出现小叶内和汇管区炎性反应,部分肝组织出现明显的纤维化改变.模型组大鼠肝组织AngⅡ[(32.80±2.81) pg/ml]较对照组[(22.83±1.75)pg/ml]高(t=9.559,P＜0.01).免疫组织化学检测显示模型组TGFβ1表达量明显高于对照组(Z=--2.540,P=0.011).Spearman相关性分析显示,大鼠肝组织内AngⅡ浓度增加程度与肝脂肪变积分(r=0.644,P=0.002)和TGF-β1表达量(r=0.470,P=0.037)均呈正相关.结论 AngⅡ和TGF-β1在NAFLD模型大鼠的肝组织内浓度明显增加,肾素血管紧张素系统可能参与了NAFLD的发生和发展.     

红景天苷对原代培养脂肪变性大鼠肝细胞细胞色素P4502E1蛋白表达的抑制作用

目的研究红景天苷对原代培养大鼠脂肪变性肝细胞细胞色素P4502E1(CYP2E1)蛋白表达的抑制作用。方法体外分离、原代培养SD大鼠肝细胞,选取培养48 h的大鼠肝细胞,加入0.25 mmol/L棕榈酸诱导肝细胞脂肪变性,同步加入150μg/ml的红景天苷继续培养24 h,检测培养肝细胞上清液ALT、AST、丙二醛(MDA)和肝细胞甘油三酯(TG)含量的变化。采用油红O染色观察肝细胞脂滴沉积,采用蛋白质印迹法检测CYP2E1蛋白表达的变化。结果以0.25 mmol/L棕榈酸和150μg/ml红景天苷同步培养细胞24 h,红景天苷干预组细胞培养上清ALT[(11.3±1.0)U/L、AST(3.7±0.5)U/L、MDA(1.7±0.2)nmol/ml和TG(105.7±16.8)μg/mg protein]均显著低于棕榈酸模型组[ALT(13.5±1.2)U/L,P0.05;AST(5.9±0.7)U/L,P0.05;MDA(4.2±0.9)nmol/ml,P0.01;TG(268.3±25.8)μg/mg protein,P0.01];油红O染色显示红景天苷处理肝细胞脂滴明显减少,蛋白质印迹法显示红景天苷能有效抑制脂肪变性肝细胞CYP2E1蛋白表达的上调。结论红景天苷抑制细胞CYP2E1蛋白表达可能是其防治肝细胞脂肪变性的主要机制之一。