细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞免疫功能的影响

目的探讨不同剂量细粒棘球蚴感染对小鼠脾脏NKT细胞(natural killer T cells)免疫功能的影响。方法经肝门静脉注射细粒棘球蚴建立C57BL/6小鼠感染模型,对照组注射生理盐水。感染组分为低剂量组(50个原头蚴,LD)、中剂量组(500个原头蚴,MD)和高剂量组(2 000个原头蚴,HD)。于造模后12周采集小鼠肝脏和脾脏标本,采用HE及Masson染色检查肝脏病灶和纤维化程度;采用流式细胞术检测小鼠脾脏NKT细胞表型、不同NKT亚群比例,以及相关细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-10及IL-17A)的表达情况。结果不同剂量细粒棘球蚴感染组小鼠肝脏均可见囊泡结构样病灶,病灶周围出现胶原沉积,对照组肝脏仅汇管区可见少量胶原沉积。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT细胞比例分别为(1.34±0.27)%和(1.33±0.21)%,与对照组(2.54±0.43)%和低剂量组(2.41±0.53)%比较差异有统计学意义(F=16.451,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+CD4~+ NKT细胞比例分别为(15.6±2.00)%和(17.5±3.98)%,与对照组(11.1±2.82)%和低剂量组(11.1±1.31)%比较差异有统计学意义(F=8.130,P0.05)。高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+CD8~+ NKT细胞比例为(70.1±7.52)%,与对照组(85.3±2.68)%和低剂量组(83.1±3.90)%比较差异有统计学意义(F=12.42,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏CD69~+DN NKT细胞比例分别为(29.3±2.02)%和(27.2±5.20)%,与对照组(35.6±4.26)%比较差异有统计学意义(F=3.277,P0.05)。中、高剂量感染组小鼠脾脏NKT1型细胞分泌IFN-γ比例低于对照组和低剂量组(F=40.00,P0.01)。高剂量感染组小鼠脾脏NKT2型细胞分泌IL-4比例高于对照组、低剂量组和高剂量组(F=10.54,P0.001)。中、高剂量感染组脾脏NKT17型细胞分泌IL-17A比例低于对照组和低剂量组(F=13.00,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏NKT10型细胞分泌IL-10比例高于对照组(F=45.59,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT1型细胞分泌IFN-γ比例分别为(14.55±2.12)%和(10.43±0.85)%,与对照组(25.88±6.82)%和低剂量组(22.13±4.36)%比较差异有统计学意义(F=16.73,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT2型细胞分泌IL-4比例分别为(10.14±1.00)%、(10.64±0.73)%和(12.97±1.66)%,与对照组(7.07±0.72)%比较差异有统计学意义(F=19.99,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT17型细胞分泌IL-17A比例分别为(2.46±0.72)%和(2.26±0.57)%,与对照组(4.11±1.07)%和低剂量组(4.56±0.91)%比较差异有统计学意义(F=10.54,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD4~+NKT10型细胞分泌IL-10比例分别为(8.42±1.38)%、(12.65±4.19)%和(15.7±3.72)%,与对照组(4.66±0.87)%比较差异有统计学意义(F=15.78,P0.01)。中、高剂量感染组脾脏CD8~+NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=20.08,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏CD8~+NKT型细胞分泌IL-10与高于对照组比较差异有统计学意义(F=24.41,P0.01或P0.001)。中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IFN-γ比例与对照组和低剂量组比较差异有统计学意义(F=26.82,P0.01)。低、中、高剂量感染组脾脏DN NKT型细胞分泌IL-10比例与对照组比较差异有统计学意义(F=22.96,P0.05)。结论细粒棘球蚴感染中期,不同剂量感染诱导小鼠机体产生的细胞免疫反应由NKT1型和NKT17型模式转向NKT2型和NKT10型亚群优势,导致NKT细胞亚群之间的偏移失衡,造成细粒棘球蚴在宿主体内慢性寄生。     

泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8+ T细胞免疫功能耗竭的影响

目的　观察不同时间、不同剂量泡球蚴感染对小鼠脾脏CD8+ T细胞免疫功能耗竭的影响。方法　采集泡球蚴原头蚴虫体,经肝门静脉建立低（50个原头蚴）、中（500个原头蚴）和高剂量（2 000个原头蚴）泡球蚴感染小鼠模型,并设生理盐水对照组。于感染后早（2周）、中（12周）、晚期（24周）分别取小鼠脾脏,研磨分离淋巴细胞。流式细胞术检测不同实验组小鼠脾脏中记忆性CD8+ T细胞表型、免疫抑制性分子2B4表达水平,及其分泌γ?干扰素（IFN?γ）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、白细胞介素?17A（IL?17A）和IL?10的能力。结果　在感染早期,高剂量泡球蚴感染诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞以中心记忆性表型为主,其比例为（35.50 ± 2.00）%,显著高于对照组（25.90% ± 2.46%）（P < 0.01）;在感染晚期,中、高剂量泡球蚴感染均诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞以效应记忆性表型为主,其比例分别为（25.70 ± 4.12）%和（28.40 ± 4.12）%,均显著高于对照组（10.50% ± 6.45%）（P均 < 0.05）。高剂量泡球蚴感染中期和晚期,中心记忆性CD8+ T细胞比例显著低于感染早期（P均 < 0.01）;高剂量泡球蚴感染晚期,效应记忆性CD8+ T细胞比例显著高于感染早期和中期（P均< 0.05）。低、中剂量泡球蚴感染早期,脾脏CD8+ T细胞分泌IFN?γ和IL?17A能力显著增强,而高剂量泡球蚴感染虽然促进小鼠脾脏CD8+ T细胞分泌IFN?γ和TNF?α能力,但感染晚期其分泌IFN?γ和TNF?α能力显著低于早期和中期（P均< 0.05）。此外,中、高剂量泡球蚴感染晚期小鼠脾脏CD8+ T细胞表面免疫抑制性分子2B4呈高表达,其比例分别为（4.73 ± 1.56）%和（4.94 ± 1.90）%,均显著高于低剂量组（2.49% ± 0.58%）和对照组（2.92% ± 0.60%）（P 均< 0.05）。结论　在低、中剂量泡球蚴感染中期和晚期,机体利用自身免疫应答能力对虫体起到杀伤和清除;而高剂量泡球蚴感染晚期可诱导小鼠脾脏CD8+ T细胞上调2B4分子表达,导致免疫耗竭,造成慢性寄生。     

多房棘球蚴感染小鼠辅助Th17细胞,转录因子RORγτ及相关细胞因子的实验研究

目的探讨多房棘球蚴感染小鼠脾脏细胞中辅助性T细胞17比例,转录因子RORγτ和IL-17因子的表达及其意义。方法选用6~8周龄BALB/c小鼠共30只,随机分为多房棘球蚴感染组(Em)、多房棘球蚴感染阿苯达唑治疗组(Em+Albendazole,Em+ABZ)和健康对照组(healthy controls,HC),每组10只。通过腹腔注射法建立泡型包虫病小鼠模型。Em+ABZ治疗组给予灌胃阿苯达唑治疗(100μl/d,35d)通过流式细胞术检测小鼠脾脏细胞中辅助性T17细胞(CD4+IL-17+Th17细胞/CD4+T细胞)比例,采用实时荧光定量PCR检测脾脏细胞中维甲酸孤独受体(retinoid acid orphan receptor-γτ,RORγτ)mRNA的表达;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-17水平。结果 CD4+IL-17+Th17细胞/CD4+T细胞比例,Em组为(2.10±1.00)%,与HC组(0.85±0.71)%比较,差异有统计学意义(F=3.07,t=2.66,P<0.01)。Em+ABZ组为(1.54±1.19)%,与HC组和Em组比较,差异无统计学意义(F=3.07,P>0.05);脾脏细胞RORγτmRNA在Em组中的表达(6.1×10-4±5.8×10-4)高于在Em+ABZ组(6.0×10-4±3.5×10-4)和HC组(3.4×10-4±2.4×10-4)中的表达,但差异无统计学意义(F=0.66,P>0.05)。Em+ABZ组与HC组比较,差异亦无统计学意义(F=0.66,P>0.05)。脾脏细胞培养上清液中IL-17A,Em组为(10.71±1.85)ng/ml,明显高于Em+ABZ组[(5.58±3.56)ng/ml]和HC组[(7.31±1.22)ng/ml],差异有统计学意义(F=9.82,t1=3.12,t2=5.57,P<0.01)。Em+ABZ组与HC组比较差异无统计学意义(F=9.82,t=0.84,P>0.05)。结论 Th17细胞参与BALB/c小鼠多房棘球蚴感染免疫和炎性应答过程,阿苯达唑治疗能够减轻免疫损伤和炎症反应。Th17细胞及IL-17A可能是潜在的多房棘球蚴病新的分子免疫干预靶点。     

多房棘球蚴感染对小鼠肝脾淋巴细胞及其亚群的影响

目的探讨多房棘球蚴感染对C57BL/6小鼠肝和脾淋巴细胞及其亚群的影响。方法 32只C57BL/6小鼠随机分为4组,每组8只,对照组、低数量组(50个原头节/鼠)、中数量组(500个原头节/鼠)、高数量组(2 000个原头节/鼠),实验组取200μl含不同数量多房棘球蚴原头节的混悬液,采用门静脉注射法建立多房棘球蚴感染小鼠模型,对照组注射等量生理盐水。感染后4周,每组各取4只小鼠,取肝脏组织,常规Masson染色,观察病理变化。剩余4只小鼠取肝脏和脾脏,制备肝、脾细胞悬液,流式细胞术检测肝、脾CD3^+T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞、CD4^+CD69^+T细胞、CD8^+CD69^+T细胞绝对数以及初始型CD4^+T (CD4^+Tn)细胞、效应记忆性CD4^+T (CD4^+Tem)细胞、初始型CD8^+T (CD8^+Tn)细胞、效应记忆性CD8^+T(CD8^+Tem)细胞和中心记忆性CD8^+T(CD8^+Tcm)细胞比例的变化。检测数据采用Flow-Jo软件分析,并做流式图。采用Graphad Prism 7.0软件进行作图和统计学分析。结果感染后4周,对照组小鼠肝无明显变化,低、中数量组小鼠肝组织出现急性炎症反应减弱,部分病灶炎性反应逐渐转变为纤维化修复,形成小肉芽肿结节,呈点状或灶状坏死。高数量组小鼠肝内出现小囊泡,可见生发层结构,周围大量炎性细胞浸润。小鼠肝CD3^+T细胞绝对数高、中、低数量组和对照组分别为(4.10±0.04)×10^5、(3.81±0.14)×10^5、(3.02±0.12)×10^5、(2.98±0.03)×10^5,高数量组高于其他3组(P<0.05或0.01)。小鼠脾CD3^+T细胞绝对数高、中、低数量组和对照组分别为(16.01±0.40)×10^5、(11.03±1.21)×10^5、(10.10±1.01)×10^5、(9.71±0.90)×10^5,高数量组高于其他3组(P<0.01)。小鼠肝CD4^+T、CD8^+T细胞和脾B细胞、CD8^+T绝对数高数量组高于其他3组(P<0.05或0.01)。小鼠肝CD4^+CD69^+T细胞绝对数高、中、低数量组和对照组分别为(3.23±0.10)×10^4、(1.98±0.11)×10^4、(1.51±0.26)×10^4、(1.19±0.21)×10^4,高数量组高于其他组(P<0.05)。小鼠脾CD4^+CD69^+T细胞绝对数高、中、低数量组和对照组分别为(10.10±0.41)×10^4、(8.91±0.80)×10^4、(8.20±0.41)×10^4、(6.81±0.50)×10^4,高数量组高于对照组(P<0.01)。肝、脾CD8^+CD69^+T细胞绝对数高数量组高于其他3组(P<0.05或0.01)。小鼠肝CD4^+Tn细胞比例高、中、低数量组和对照组分别为(15.52±1.51)%、(19.3±2.09)%、(20.66±1.28)%、(23.62±2.84)%,对照组高于其他组(P<0.05或0.01)。肝、脾CD8^+Tn细胞比例对照组高于其他组(P<0.05或0.01)。肝、脾CD8^+Tcm细胞比例高数量组高于对照组(P<0.05)。结论高数量多房棘球蚴感染C57BL/6小鼠,肝区域以CD4^+T细胞和CD8^+T细胞募集为主,而脾以B细胞和CD8^+T细胞募集为主。     

细粒棘球绦虫分泌抗原B调控Th17/Treg抑制过敏性哮喘的研究北大核心CSCD

目的探讨细粒棘球蚴分泌抗原B(EgAgB)对过敏性哮喘的抑制作用及其机制。方法将32只小鼠随机分为4组(每组8只),其中A组为高剂量干预组(HAgB:20μg EgAgB+OVA),B组为低剂量干预组(LAgB:2μg EgAgB+OVA),C组为过敏性哮喘组(OVA),D组为PBS对照组。采用ELISA法检测小鼠抗体水平;HE、PAS组织染色检测小鼠肺组织病理变化及黏蛋白分泌水平;利用流式细胞术分析肺脏和脾脏组织中淋巴细胞的分群及活化比例。结果 EgAgB免疫小鼠血IgG、IgM和IgG2b抗体水平显著高于PBS对照组(D组)(P<0.01),IgG1、IgG2a和IgE水平与PBS对照组(D组)相比差异无统计学意义(均P>0.05);HE、PAS染色显示,EgAgB接种组与C组相比能够显著抑制小鼠气道炎症及气道粘液的分泌(均P<0.01);流式细胞术检测显示,免疫高剂量EgAgB组小鼠肺组织及脾脏组织嗜酸性粒细胞和Th17的数量显著减少(均P<0.01),Treg数量显著增多(P<0.01)。结论 EgAgB能够通过调节宿主免疫平衡抑制过敏性哮喘,可作为防治自身免疫性疾病和过敏性疾病的候选小分子蛋白。     

多房棘球蚴感染对小鼠脾自然杀伤T细胞及其亚群的影响

目的探讨多房棘球蚴感染对小鼠脾自然杀伤T细胞(NKT)及其亚群的影响。方法 24只C57BL/6小鼠随机分为低、中、高感染组和对照组,每组6只。低、中、高感染组每鼠分别经肝门静脉注射50、500、 2 000个多房棘球蚴原头节,对照组注射等量生理盐水。感染后2周,无菌条件下取各组小鼠肝脏,制备肝组织切片,常规Masson染色后观察多房棘球蚴病灶和肝纤维化情况;取脾组织制备淋巴细胞悬液,流式细胞术检测NKT细胞不同亚群及分泌细胞因子的水平。结果 Masson染色结果显示,感染2周后,对照组小鼠肝无明显变化;低、中感染组小鼠肝组织仅可见少量肉芽肿,炎性反应较弱,向纤维化修复转变;高感染组肝病灶形成较小的生发层结构,周围炎性细胞分布密集,可见纤维结缔增生。中、高感染组脾NKT细胞绝对数分别为(6.32±0.53)×105、(7.37±1.72)×105,高于对照组的(5.02±1.08)×105和低感染组的(4.90±1.27)×105(P 0.01)。中、高感染组分泌γ干扰素(IFN-γ)的脾NKT1型细胞比例分别为(13.93±1.61)%、(10.9±3.04)%,低于对照组的(17.3±3.18)%和低感染组的(19.42±2.82)%(P 0.01);低、中、高感染组分泌IL-4的脾NKT2型细胞比例分别为(5.62±0.58)%、(5.86±1.43)%和(5.92±0.94)%,高于对照组的(4.37±0.83)%(P 0.05);低、中感染组分泌IL-17A的脾NKT17型细胞比例分别为(7.02±1.19)%和(6.62±0.41)%,高于对照组的(4.68±0.73)%和高感染组的(3.73±1.04)%(P 0.01)。中、高感染组脾CD4+NKT细胞绝对数分别为(1.75±0.36)×105、(1.82±0.24)×105,高于对照组的(1.24±0.26)×105(P 0.05);高感染组脾DN NKT细胞绝对数为(2.15±0.78)×105,分别高于对照组的(1.27±0.36)×105、低感染组的(1.20±0.49)×105和中感染组的(1.43±0.19)×105(P 0.01)。低、中、高感染组分泌IFN-γ的脾CD4+NKT1型细胞比例分别为(19.42±2.82)%、(14.40±1.81)%、(12.5±2.96)%,低于对照组的(21.16±2.83)%(P 0.01);低、中、高感染组分泌IL-17A的脾CD4+NKT17型细胞比例分别为(18.73±1.99)%、(16.06±1.42)%和(14.41±3.55)%,高于对照组的(10.27±1.79)%(P 0.01)。低、中、高感染组分泌IFN-γ的CD8+NKT细胞比例分别为(10.04±0.92)%、(13.43±0.92)%和(9.24±1.37)%,低于对照组的(15.83±1.59)%(P 0.01);中、高感染组分泌IL-10的脾CD8+NKT细胞比例分别为(4.07±0.48)%、(3.92±0.75)%,高于对照组的(2.85±0.64)%(P 0.05)。中、高感染组分泌IFN-γ的脾DN NKT细胞比例分别为(17.48±2.50)%和(14.06±3.95)%,低于对照组的(25.18±5.78)%(P 0.01)。结论小鼠感染多房棘球蚴后,脾NKT细胞及其亚群发生明显变化,其中低、中感染组小鼠以CD4+NKT17型免疫应答优势对虫体起杀伤和清除作用,高感染组小鼠以CD4+NKT17型、 NKT2型和NKT10型细胞亚群的混合优势,且NKT细胞呈抑制性表型,使NKT1型免疫应答能力下降,利于棘球蚴寄生。     

左旋咪唑对细粒棘球蚴感染小鼠不同时期T细胞亚群的影响

目的探讨左旋咪唑（LMS）对细粒棘球蚴感染鼠的免疫调节作用和对病程转归的影响。方法昆明种小鼠腹腔接种细粒棘球蚴，建立感染动物模型。在感染后2、4、8、12、16、20周，未治疗组和实验组分别给予生理盐水和左旋咪唑（25mg／kg），连续7d，测定各组小鼠脾指数、胸腺指数及囊重，运用流式细胞术（FCM）测定小鼠脾CD4^＋和CD8^＋T细胞百分率及CD4^＋／CD8^＋比值的动态变化。另设8只未接种小鼠为健康对照。结果生理盐水组小鼠感染2周时CD4^＋、CD8^＋T细胞百分率显著高于健康对照组（P〈0．01）），随后CD4^＋T细胞的百分率逐渐降低，CD8^＋T细胞的百分率逐渐增高，至感染后16周和20周，CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞的百分率及CD4^＋／CD8^＋比值与健康对照组比较差异仍具有显著性（P〈0．01）。与生理盐水组小鼠相比，左旋咪唑组小鼠在感染2周时CD4^＋、CD8^＋T细胞的百分率明显增高，与健康组小鼠相比有统计学意义（P〈0．01）；在感染16周和20周时脾指数升高，CD4^＋T细胞百分率上升，CD8^＋T细胞的百分率下降，CD4^＋／CD8^＋比值升高，平均囊重下降，与生理盐水组比较差异均有显著性（P〈0．01）。结论左旋咪唑对细粒棘球蚴感染小鼠有免疫调节作用，在感染后期可升高小鼠脾指数，使CD4^＋T细胞及CD8^＋T细胞比例恢复正常，机体的细胞免疫功能增强，从而减缓细粒棘球蚴的增殖。     

细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染对Balb/c小鼠淋巴细胞亚群的影响

目的 分析Balb/c小鼠感染细粒棘球蚴和多房棘球蚴后脾脏和血液淋巴细胞亚群的变化。方法 利用流式细胞仪分析感染细粒棘球蚴和多房棘球蚴的Balb/c小鼠脾脏和血液中T、B、Th1、Th2、Treg、NK细胞亚群变化。结果 脾脏B、Th1、Th2、Treg细胞在多房棘球蚴感染组和对照组比较,差异有统计学意义;血液Th1和Th2细胞在多房棘球蚴感染组和对照组比较,差异有统计学意义(t_Th1=3.669, P<0.01; t_Th2=4.302, P<0.01)。脾脏B、Th1、Th2、Treg细胞在细粒棘球蚴感染组和对照组比较,差异有统计学意义(t_B=3.396,P<0.05;t_Th1=3.539,P<0.05;t_Th2=3.731,P<0.05;t_Treg=2.197,P<0.05);血液B、NK、Th1、Th2细胞在细粒棘球蚴感染组和对照组之间比较,差异有统计学意义(t_B=2.125,P<0.05;$t_{N_{K}}$=3.569,P<0.05;t_Th1=6.532,P<0.05;t_Th2=4.463,P<0.05)。结论 小鼠脾脏B、Th1、Th2、Treg细胞在细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染组变化趋势基本一致。多房棘球蚴感染组血液中Th1和Th2细胞有变化,细粒棘球蚴感染组血液中B、NK、Th1和Th2细胞有变化。     

细粒棘球蚴重组铁蛋白和重组线粒体苹果酸脱氢酶免疫差异的初步观察

目的比较细粒棘球蚴重组铁蛋白(rEgferritin)和重组线粒体苹果酸脱氢酶(rEgmMDH)对感染细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)小鼠的免疫差异。方法 30只雌性ICR小鼠随机分为3组(rEgferritin免疫组、rEgmMDH免疫组和对照组)。将rEgferritin、rEgmMDH和PBS与佐剂乳化后,分别于背部皮下多点注射免疫小鼠,每次注射100μl/只(含抗原10μg),共免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后2周,3组小鼠分别于腹腔注射0.1 ml原头节悬液(约1 500个)进行攻击感染,22周后剖杀,无菌取脾组织,并记录包囊数量和直径,评价免疫保护力。用流式细胞仪检测脾组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞,计算两者比例。结果 rEgferritin免疫组30%(3/10)小鼠有包囊,包囊总数为5个;rEgmMDH免疫组小鼠均有包囊,包囊总数为118个;对照组9只小鼠中7只有包囊,包囊总数为35个。rEgferritin免疫组小鼠获得了84.7%的免疫保护力,而rEgmMDH组无免疫保护力。小鼠脾淋巴细胞CD4+亚群百分比,rEgferritin免疫组[(57.50±7.02)%]显著高于对照组[(43.60±6.09)%](P<0.05)。小鼠脾淋巴细胞CD8+亚群百分比,rEgferritin免疫组[(25.66±6.18)%]和rEgmMDH免疫组[(19.23±5.40)%]与对照组[(21.80±6.12)%]比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。小鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+亚群比值,rEgferritin免疫组和rEgmMDH免疫组与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)结论 rEgferritin能抑制细粒棘球蚴的生长,而rEgmMDH促进了细粒棘球蚴的生长。     

不同药物对小鼠肝细粒棘球蚴术后感染的抑制作用

目的:探讨不同药物对小鼠肝细粒棘球蚴感染的抑制作用,了解增强宿主免疫功能对小鼠肝细粒棘球蚴感染的影响.方法:取包虫囊液成功免疫小鼠,分为药物治疗组和模型对照组.肝脏接种原头蚴前1 wk及接种后1 mo,药物治疗组分别用阿苯哒唑脂质体、槐耳浸膏及阿苯哒唑脂质体联合槐耳浸膏治疗,接种头节时各药物治疗组再分为4组,每组头节分别使用750 mL/L乙醇、200g/L高渗盐水、阿苯哒唑脂质体及平衡液处理后接种.模型对照组头节用平衡液处理后直接接种,接种后3 mo观察小鼠肝细粒棘球蚴大体和病理变化,检测小鼠脾脏指数、外周血IgG和IgE水平,并用流式细胞仪检测小鼠外周血CD4 和CD8 淋巴细胞的百分率.结果:联合治疗组中小鼠肝细粒棘球蚴生发层和角质层破坏较严重.各药物治疗组小鼠脾脏指数、IgE水平明显低于模型对照组(3.84±0.86,3.95±1.01,3.27±0.52 vs 5.46±0.52;0.06±0.08 μg/L,0.07±0.08 μg/L,0.03±0.03μg/L vs 0.20±0.02 μg/L,均P<0.01),其中联合药物治疗组降低最为明显;药物治疗组IgG水平与模型对照组相比无显著性差异.药物治疗组CD8 水平明显低于模型对照组(16.60±3.89,18.18±3.90,15.38±2.63 vs 32.90±4.71,均P<0.01),CD4 /CD8 明显高于模型对照组(3.21±0.70,3.05±0.66,3.53±0.57 vs 1.57±0.26,均尸<0.01),其中联合治疗组变化最为明显.结论:阿苯哒唑脂质体与槐耳浸膏联合用药可以明显增强小鼠免疫功能,抑制细粒棘球蚴的生长,使小鼠肝细粒棘球蚴病术后感染率降低.     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

日本血吸虫感染小鼠肝脏及脾脏NKT细胞的变化

目的观察日本血吸虫感染后小鼠肝脏及脾脏自然杀伤(NK)T细胞的动态变化特征。方法将24只6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组,其中3组每鼠经腹部皮肤感染(14±2)条日本血吸虫尾蚴,分别于感染后3、6、12周剖杀小鼠,分离肝脏及脾脏单个核淋巴细胞,应用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD49b单克隆抗体及藻红蛋白(PE)标记的CD3e单克隆抗体标记细胞,流式细胞仪检测CD3/CD49b双阳性的NKT细胞占单核淋巴细胞的比例。体外刺激实验中将分离的正常小鼠脾脏单个核淋巴细胞,分别用SEA、虫卵蛋白、虫卵脂质作为刺激物,观察其中NKT细胞的比例变化。结果日本血吸虫感染小鼠脾脏中NKT细胞,于感染后12周比例为(4.73±0.41)%,显著高于对照组比例(2.07±0.12)%(P0.01);肝脏NKT细胞在感染后3周(8.03±0.23)%与对照组(8.60±1.48)%无明显变化,但感染后6周及12周NKT比例明显上升,分别为(15.90±0.76)%和(21.00±0.30)%,与对照组相比差异有统计学意义(P0.01)。体外实验结果显示,刺激物为SEA和虫卵脂质时,NKT细胞的比例分别为(0.77±0.03)%及(0.80±0.06)%,明显高于空白对照组(0.53±0.03)%及虫卵蛋白组(0.50±0.06)%(P0.05)。结论日本血吸虫感染导致小鼠脾脏及肝脏中NKT细胞比例上调,其上调可能与虫卵可溶性抗原中的脂质组分有关。     

细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15免疫小鼠LncRNA 031520表达的研究北大核心CSCD

目的探讨长链非编码RNA031520(LncRNA 031520)分子在细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15诱导小鼠免疫保护的表达分析。方法36只雌性BALB/c小鼠分为PBS对照组、弗氏佐剂组和ZW-15免疫组,12只/组。PBS对照组、弗氏佐剂组分别皮下多点注射PBS溶液和完全/不完全弗氏佐剂100μl/只,ZW-15免疫组注射重组抗原100μl/只(10μg/只)。弗氏佐剂组和ZW-15免疫组初次免疫使用完全弗氏佐剂,加强免疫使用不完全弗氏佐剂。共免疫3次,初次免疫后的2次加强免疫间隔时间为两周。免疫小鼠经麻醉取血,分离血清。采用ELISA法检测特异IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平。无菌取脾脏,分离淋巴细胞采用流式细胞术分选CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞及B淋巴细胞群;利用qRT-PCR检测CD4^(+)T淋巴细胞、CD8^(+)T淋巴细胞、B淋巴细胞及总淋巴细胞中LncRNA 031520及内参GAPDH的表达;利用流式细胞术检测脾脏CD4^(+)T淋巴细胞中IFN-γ、IL-4的表达。使用SPSS 17.0统计软件和Graphpad Prism 8.0绘图软件对实验数据进行统计分析。结果小鼠经亲肌肉重组抗原ZW-15免疫后血清特异IgG、IgG1、IgG2a及IgG2b抗体水平均升高,且均显著高于PBS组、弗氏佐剂对照组,差异均有统计学意义(P<0.001)。LncRNA 031520在ZW-15免疫组CD4^(+)T淋巴细胞、总淋巴细胞中相对表达量显著高于PBS对照组和弗氏佐剂对照组(P<0.01),在ZW-15免疫组B淋巴细胞及CD8^(+)T淋巴细胞中相对表达量与PBS对照组及弗氏佐剂对照组相比差异均无统计学意义(均P>0.05)。免疫组小鼠脾脏淋巴细胞Th1亚群标志分子IFN-γ表达量为(19.07±3.44)%,显著高于PBS对照组(8.03±2.67)%和弗氏佐剂对照组(9.37±1.25)%(P<0.05),Th2亚群标志分子IL-4表达量为(0.79±0.02)%,显著高于PBS对照组(0.44±0.13)%和弗氏佐剂对照组(0.50±0.15)%(P<0.05)。结论LncRNA 031520在细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15免疫小鼠淋巴细胞中表达上调,可能在亲肌肉抗原抵御细粒棘球蚴感染中发挥免疫保护作用。     

Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ胶原基因在泡球蚴感染中期小鼠肝脏中的表达及意义

目的观察泡球蚴感染中期BALB/c小鼠所致肝纤维化时Ⅰ型胶原(Col1a1)、Ⅲ型胶原(Col3a1)、Ⅳ型胶原(Col4a1)基因的表达及意义。方法将雌性BALB/c小鼠随机分为实验组(8只)和对照组(5只)。实验组小鼠开腹,肉眼直视下左肝叶内注射泡球蚴混悬液,建立疾病动物模型;对照组以同样方法注射等量生理盐水。于感染中期第12周,颈椎脱臼处死小鼠,实验组取病变组织和病变邻近肝组织,对照组取注射部位所在肝组织以及临近肝组织,用4%甲醛固定,常规石蜡包埋,HE、Masson染色后观察形态学改变和肝纤维化程度。取病变临近肝组织,提取总RNA,反转录合成cDNA,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测Col1a1、Col3a1、Col4a1基因的表达,计量结果用相对单位(AU)表示。结果泡球蚴感染组和对照组Collal基因表达量分别为(2.155±0.809)AU和(1.000±0.221)AU,差异有统计学意义(t=3.427,P<0.05);Col3a1基因表达量分别为(18.641±10.244)AU和(1.000±0.412)AU,差异有统计学意义(t=10.324,P<0.01);Col4a1基因表达量分别为(0.894±0.495)AU和(1.000±0.381)AU,差异无统计学意义(t=1.932,P>0.05)。Masson染色检查泡球蚴感染组肝纤维化评分为2.72±1.04,对照组为1.0,差异有统计学意义(t=4.105,P<0.05)。结论在泡球蚴感染小鼠中期,引起肝纤维化的胶原主要为Ⅲ型和Ⅰ型。     

青蒿琥酯治疗小鼠继发性棘球蚴病的效果观察

目的评价中药青蒿琥酯(Art)和阿苯达唑(Alb)及两药联用治疗小鼠继发性棘球蚴病的疗效。方法将人工感染细粒棘球蚴囊液及包囊组织的小鼠随机分为5组,治疗组分别给予青蒿琥酯(Art)25 mg/kg·d、50 mg/kg·d、阿苯达唑(Alb)50 mg/kg·d、Art 25 mg/kg·d +Alb 25 mg/kg·d ,连续治疗90 d。模型对照组不作治疗。另设空白对照组。治疗效果以棘球蚴湿重、囊重抑制率、脾脏指数、组织病理变化及超微结构改变为评价指标。结果各用药组小鼠包囊生长明显被抑制,抑制率分别为52 .96 %,64 .34 %,65 .31 %,77 .08 %,联合用药组效果优于单独用药组。与模型对照组比较,各治疗组小鼠脾脏指数、血清IL-4及IgE水平均降低(P均<0 .05)。结论青蒿琥酯对小鼠棘球蚴的生长及由此引起的超敏反应有一定的抑制作用,联合阿苯达唑治疗效果更好。     

泡球蚴感染中自噬相关蛋白对巨噬细胞极化的影响北大核心CSCD

目的通过对感染泡球蚴小鼠肝脏的自噬相关蛋白以及巨噬细胞不同分型的检测,探讨在泡球蚴感染过程中自噬对巨噬细胞极化的影响及可能机制。方法取雌性BALB/c小鼠16只,随机分为实验组与对照组。实验组建立泡球蚴感染小鼠模型,于感染90天处死,通过HE染色观察小鼠肝脏的病理学变化,利用免疫组化等技术检测肝脏中自噬相关蛋白的表达,利用免疫荧光激光共聚焦法进行肝脏组织巨噬细胞与自噬相关蛋白共定位,采用流式细胞术检测肝脏巨噬细胞M1、M2表达水平。结果感染90天时,实验组小鼠肝脏自噬相关蛋白LC3、p62表达均增高,相对表达量分别为2.08±0.3和1.85±0.2,与对照组比较差异均有统计学意义(F值分别为260.114和434.116,均P<0.01);实验组小鼠肝脏组织中自噬相关蛋白LC3、p62与巨噬细胞存在共定位表达,Pearson’s相关系数与对照组比较有统计学意义(F值分别为132.219和36.325,均P<0.01),Manders重叠系数与对照组比较有统计学意义(F值分别为205.410和140.665,均P<0.01);实验组小鼠肝脏巨噬细胞数增加至31.74±1.68,M1型巨噬细胞增加至66.46±1.82,M2型巨噬细胞减少至22.46±0.63,与对照组比较差异均有统计学意义(F值分别为309.358、194.001和759.194,均P<0.01)。结论泡球蚴感染小鼠肝脏自噬相关蛋白高表达,促进巨噬细胞以M1型极化,抑制M2型极化,以减轻炎症反应,帮助机体清除病原体。     

阿苯达唑脂质体及槐耳浸膏对小鼠肝细粒棘球蚴感染率影响的实验观察

目的 探讨阿苯达唑脂质体(L-ABZ)及槐耳浸膏(HEF)对小鼠肝细粒棘球蚴病术后感染的抑制作用，了解增强宿主免疫功能对本病术后复发的影响。 方法 雌性昆明小鼠，腹腔注射人肝细粒棘球蚴囊液，3周后取外周血IgG抗体阳性鼠，分为药物治疗组(A、B、C组)和模型对照组(D组), 每组40只。A 组灌胃L-ABZ(75 mg/kg)、B组灌胃HEF(15 000 mg/kg)、C 组两药联用(阿75 mg/kg+槐15 000 mg/kg)。隔天1次，共 3 次。麻醉各组小鼠，打开腹腔，肝脏注射经PBS浸泡20 min的原头节(0.3 ml/只，约含原头节6 000个，下同)，模拟开放式外膜内外囊完整摘除术术中外溢原头节再感染。缝合关闭腹腔，72 h后药物治疗组同法继续治疗1个月，D组灌服蒸馏水0.3 ml/只。E组(8只正常小鼠) 为空白对照。各组小鼠均于3个月后解剖。评价药物疗效（包括肝棘球蚴复发率、组织学观察、测定脾脏指数(SI)及IgG、IgE水平、流式细胞仪检测外周血CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞百分率）。另取上述外周血IgG抗体阳性鼠分为F、G、H和I 4组，每组约30只, 分别同上述A、B、C和D组同法灌胃治疗, 于肝脏分别注射经20% NaCl、75%乙醇、L-ABZ及PBS浸泡20 min的原头节, 观察其感染率。 结果 C组肝棘球蚴复发率为5.7%，低于A组(17.1%)和B组(24.2%)；棘球蚴色泽发白呈结节状，生发层和角质层破坏严重。脾脏指数(A组为3.84±0.86、B组为3.95±1.01、C组为3.27±0.52)和IgE水平(A组为0.06±0.08、B组为0.07±0.08、C组为0.03±0.03)均明显低于D组(分别为5.46±0.52及0.20±0.02)(P＜0.05)，其中C组降低最为明显。CD8⁺水平，A组为16.61±3.89、B组为18.18±3.90、C组为15.38±2.63，均明显低于D组的32.90±4.71(P＜0.05)。CD4⁺/CD8，A组为3.21±0.70、B组为3.05±0.66、C组为3.53±0.57，均明显高于D组的1.57±0.26(P＜0.05)。C组CD8+降低、CD4⁺/CD8⁺升高最为明显。F、G和H组肝棘球蚴感染率分别为0、0及23.1%，与I 组（31.2%）相比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。 结论 HEF可明显增强小鼠免疫功能，与L-ABZ联用可抑制棘球蚴生长，降低术后复发率。L-ABZ在术中对于原头节的杀灭作用不及20％ NaCl和75％乙醇。     

肿瘤坏死因子-α和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在肝泡型棘球蚴周围单核细胞中的表达

目的探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)在肝泡型棘球蚴周围单核细胞中的表达。方法40只雌性昆明小鼠随机分为实验组(n=20)和假手术对照组(n=20),实验组小鼠开腹直视下肝脏穿刺注射0.1 ml泡型棘球蚴混悬液,对照组注射等量生理盐水。感染6个月后处死小鼠,取肝组织,观察泡型棘球蚴的生长和转移情况;用苏木素-伊红(HE)染色法观察组织病理变化;免疫组织化学法检测TNF-α和caspase-3在肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围组织中的表达;原位末端标记技术(TUNEL)检测肝组织和泡型棘球蚴病灶周围单核细胞的凋亡。结果感染6个月后,实验组小鼠肝脏可见大小不等的结节状或团块状的泡型棘球蚴组织,淋巴结转移率为45.0%(9/20)。HE染色后观察发现,实验组肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围均有大量单核细胞浸润。免疫组化染色结果显示,实验组TNF-α和cas-pase-3蛋白在肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围均有不同程度的阳性表达,单核细胞阳性细胞检出率分别为100%、100%和95%、100%,与对照组肝组织中阳性细胞检出率(5%和0)比较均有统计学意义(P<0.01)。TUNEL结果显示,肝泡型棘球蚴和淋巴转移灶周围单核细胞发生凋亡,单核细胞阳性细胞检出率为100%,与对照组比较有统计学意义(P<0.01)。结论泡型棘球蚴在感染宿主过程中,引起TNF-α蛋白高表达,可能参与了诱导肝泡型棘球蚴周围宿主单核细胞的凋亡,从而抑制宿主的免疫功能。     

细粒棘球蚴囊液对体外培养小鼠脾细胞Foxp3及Smad4基因表达的影响

目的观察细粒棘球蚴囊液对体外培养BABL/c小鼠脾脏细胞中调节性T细胞(Treg细胞)相对特异分子Foxp3(叉头蛋白3)及TGF-β1(转化生长因子-β1)下游信号通路Smad4表达的影响。方法以BABL/c小鼠作为脾细胞供者,用研磨法分离脾脏细胞,随机分为实验组(与细粒棘球蚴囊液共同培养)和对照组,取1×105个细胞接种于96孔板上,分别在1、3、6和12 h提取RNA,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Foxp3以及Smad4的基因表达。结果 qRT-PCR显示,细粒棘球蚴囊液处理1、3和12 h,实验组Foxp3表达量分别为4.577±0.317、8.517±0.978和7.406±0.822,对照组分别为9.274±0.451、3.297±0.408和2.464±0.328,差异均有统计学意义(P<0.05);细粒棘球蚴囊液处理1 h和12 h,实验组Smad4表达量分别为3.862±1.417和1.690±0.248,对照组分别为1.689±0.221和3.600±1.081,差异有统计学意义(P<0.05),且Foxp3与Smad4二者之间存在负相关(r=-0.991,P<0.05)。结论...     

细粒棘球绦虫感染小鼠肝脏髓源抑制性细胞 与调节性T细胞比例动态变化

目的　分析细粒棘球蚴感染小鼠肝脏髓源抑制性细胞（MDSCs）和调节性T（Treg）细胞比例动态变化，探讨其可能的生物学意义。方法　将30只6 周龄雌性BALB/c 小鼠随机分为感染组和对照组，每组15只。感染组每只小鼠腹腔注射细粒棘球绦虫原头节约2 000个，对照组注射等体积生理盐水。感染后3、6、12个月（感染早、中、晚期）收集小鼠肝脏白细胞，采用流式细胞术检测其中MDSCs 及其亚型M?MDSCs、PMN?MDSCs 与Treg细胞比例。结果　感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中MDSCs 比例分别为（1.61 ± 0.36）%、（5.68 ± 0.69）%和（16.18 ± 0.69）%，对照组分别为（2.19 ± 0.42）%、（0.99 ± 0.07）%和（4.18 ± 0.84）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均 < 0.01）；感染组小鼠感染3、6、12个月后肝脏白细胞中M?MDSCs 比例分别为（0.69 ± 0.27）%、（5.30 ± 0.72）%和（10.75 ± 0.29）%，对照组分别为（0.42 ± 0.24）%、（0.69 ± 0.02）%和（2.12 ± 0.13）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P 均< 0.01）；感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中PMN?MDSCs 比例分别为（0.93 ± 0.23）%、（0.32 ± 0.02）%和（5.14 ± 1.03）%，对照组分别为（1.77 ± 0.26）%、（0.28 ± 0.05）%和（1.99 ± 0.90）%，感染后3个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。感染组小鼠感染后3、6、12个月肝脏白细胞中Treg细胞比例分别为（3.35 ± 0.14）%、（6.24 ± 0.38）%和（3.41 ± 0.07）%，对照组分别为（3.48 ± 0.46）%、（3.65 ± 0.45）%和（3.12 ± 0.12）%，感染后6个月和12个月两组差异均有统计学意义（P均＜0.01）。结论　小鼠感染细粒棘球蚴6个月和12个月后，其肝脏白细胞中MDSCs与Treg细胞比例增加，前者比例变化更加明显，以M?MDSCs为主；以上提示M?MDSCs可能在小鼠感染细粒棘球蚴中后期发挥主要免疫抑制作用。