原发性肝癌患者肝组织内HCV RNA核心NS3,NS5区编码抗原的检测

目的 研究原发性肝癌（ＨＣＣ）患者肝组织中ＨＣＶ相抗原的表达，揭示在ＨＣＶ在ＨＣＣ发生中的可能作用。方法 应用免疫组化ＳＰ法定位４６例ＨＣＣ组织及３８例癌旁组织中ＨＣＶ核心，ＮＳ３，ＮＳ５抗原和ＨＢｓＡｇ。结果 癌组织中各抗原的检出率分别为２１．７％，２１．７％，１５．２％和１９．６％，癌旁组织中的检出率分别为３６．８％，３４．２％，３１．６％和７８．９％，阳性染色细胞呈弥漫，灶状和散在分布，各抗     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因的筛选

目的 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础.方法 扩增人胰腺cDNA文库并经纯化鉴定后,将文库质粒转化酵母菌株Y 187.诱饵质粒pGBKT7-core转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,测序结果进行序列比对.结果 筛选出11种与HCV核心蛋白相结合的蛋白基因,包括胰凝乳蛋白酶原B1前体、羧肽酶A1,胰蛋白酶原2、胰凝乳蛋白C、胰蛋白酶1,羧肽酶B1、驱动蛋白家族3B、胰蛋白酶2,线粒体蛋白基因、弹性蛋白酶3A,辅脂肪酶.结论 在筛选出的HCV核心蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与糖,脂代谢密切相关.     

丙型肝炎病毒C区部分基因的克隆表达及抗原性

目的 研究丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）不同长度Ｃ蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化及其抗原性。方法 应用核酸及蛋白分析软件对Ｃ蛋白的抗原决定簇预测分析,以ＰＣＲ方法扩增３段长度分别为２０１ｂｐ,４０２ｂｐ及５９１ｂ;ｐ的Ｃ基因片段,通过基因体外重组技术克隆到ｐＧＥＸ－３Ｘ表达质粒中,用所获重组蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠并应用ＥＬＩＳＡ法对银川市动物系列稀释血清进行抗体测定和     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体（NS5ATP4A）的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a（＋）质粒,构建pET32a（＋）-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。     

含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达

目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV 2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,用荧光显微镜观察EGFP表达,采用半定量RT-PCR方法检测重组复制子的HCV RNA负链,采用Western blot检测HCV NS3蛋白的复制表达,并观察IFN-α对重组质粒表达的HCV RNA复制的抑制作用。结果构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符,HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变,转染重组载体Huh-7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCV NS3蛋白表达。转染后48h,1 000IU/ml和2 000IU/ml IFN-α处理的细胞HCV RNA表达水平分别为未处理组的20.0%和7.6%。结论含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP构建成功,在Huh-7细胞中能有效复制表达,为进一步研究HCV提供了实验平台。     

HBx基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建重组HBx蛋白的真核表达载体pIRES2-AcGFP-HBx.方法 设计合成HBx基因的特异性PCR引物.PCR扩增获得HBx基因序列;将HBx基因序列克隆人T载体(pGEM-T-HBx);再用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切下目的片段,将其亚克隆人真核表达载体pIRES2-AcGFP;双酶切(Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ)和序列测定鉴定重组子;脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染入HepG2细胞,G418筛选得到稳定表达HBx的细胞克隆,Western blot检测HBx蛋白在转染细胞中的表达情况.结果 PCR扩增获得全长HBx基因序列;双酶切筛选得到阳性重组子,测序分析证实插入序列正确;转染plRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞,荧光显微镜可观察到GFP的表达,Western blot 证实表达HBx蛋白.结论 成功构建重组HBx基因真核表达载体,获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞株,为深入研究HBx蛋白的生物学功能提供实验条件.     

丙型肝炎病毒NS3基因酵母表达载体构建及表达

目的　为探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3的功能 ,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS3基因。方法　用聚合酶链反应 (PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板扩增HCVNS3基因 ,克隆到 pGEM T载体中 ,双酶切后回收连接到酵母表达质粒 pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果　成功构建HCVNS3基因酵母表达载体 ,Western免疫印迹显示了HCVNS3在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在 ,相对分子质量为 70 0 0 0。结论　HCVNS3蛋白在酵母中表达成功。     

HGV/GBV-C与HCV混合感染者肝组织中相关病毒抗原表达

庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)的致病性是目前研究焦点之一,多数研究表明大多数HGV/GBV-C感染者体内常有两种或两种以上的肝炎病毒混合感染,并认为HGV/GBV-C感染对原有乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染的基础病变似无明显影响[1-3].但仅从血清学、临床表现及常规病理角度试图说明HGV/GBV-C对机体有无损害的研究工作是很困难,我们应用免疫组织化学技术对HGV/GBV-C与HCV混合感染者肝组织中HGV/GBV-C.HCV相关抗原表达进行研究,试图从免疫病理学角度探讨HGV/GBV-C对机体肝脏的致病性.     

一个包含HCV IRES的高效真核双顺反子表达载体的构建

目的利用丙型肝炎病毒（HCV）的内部核糖体进入位点（IRES）元件构建一个新的真核双顺反子表达载体。方法克隆包含HCV5’非编码区18nt开始到HCV CORE区编码基因的32nt的IRES序列替换商用载体pIRES中脑心肌炎病毒（EMCV）的IRES序列。构建真核双顺反子表达载体pCVIR，再将绿色荧光蛋白（GFP）和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因分别克隆到pIRES和pCVIR中的IRES的上下游，用流式细胞仪检测GFP的表达强度，ELISA法检测HBsAg的表达，比较两者的表达效率。结果pCVIR载体对IRES下游GFP和HBsAg的表达效率高于pIRES载体。结论构建了一个高效的真核双顺反子表达载体。     

核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其在A549中的表达

目的 建立人核心蛋白聚糖(decorin,DCN) 真核表达载体,并在A549细胞中进行表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 用PCR法扩增出DCN分子编码序列的cDNA全长,与pcDNA3.1(+)载体连接,构建真核表达载体pcDNA3.1-decorin,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染A549细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和Western印迹法检测其表达.结果 获得了约1 080 bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型DCN cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中.RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和Western印迹方法可见转染组细胞DCN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染DCN的A549细胞株.     

癌周及癌中心不同截短片段丙型肝炎病毒核心蛋白表达质粒的构建及表达

目的 研究不同截短片段丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白(CORE)在HCV持续感染和肝癌发病机制中的作用，构建并表达不同HCV病毒株及不同截短片断CORE原核表达质粒。方法 用PCR扩增基因型为HCV 1b型的7个不同截短片段CORE基因：氨基酸(aa)长度分别为癌中心株(BT)：B：1172aa、1-126aa、1-58aa、59-126aa、127-172aa；癌旁株(BNT)：1-172aa及C191(HCV-J6)：1-172aa，扩增产物用Bam H Ⅰ及Eco R Ⅰ双酶切后将其插入到原核表达质粒PGEX-4T-1中，阳性克隆转染到BL21中，IPTG诱导表达GST-CORE融合蛋白，纯化定量，并用western blot加以验证。结果 7个不同片段CORE在体外部得到相应表达，但表达量存在一定的差异，较长片段表达量相对较低，其中BT及BNT的1-172aa截短片段CORE的表达高于同基因型等长度片段的C191，而BT以59-126aa片段的表达量最高。BT、BNT及C191三株HCV基因1b型病毒株部分截短片段可形成二聚体。结论 构建不同HCV病毒株及不同截短片段的CORE原核表达质粒获得成功，为研究HCV不同病毒株及不同区域CORE功能奠定基础；不同截短片段的CORE表达量不等，可能与不同片段具有不同的疏水基团、细胞毒性及在HCV结构和在HCV致病性中所起作用不同有关；HCV基因1b型的CORE二聚体的形成依耐于59126aa区域。     

丙型肝炎病毒F蛋白克隆表达及其抗原性

目的 在原核表达系统中诱导表达1b型HCV F蛋白及Core蛋白,建立F抗体ELISA检测方法,对F蛋白在慢性丙型肝炎患者体内的抗原性作相关研究.方法 应用RT-PCR方法从HCV感染者血清中获得Core蛋白编码基因,在第42位和144位人工增加或减少1个核苷酸,使其读码框移位,利用多重PCR技术拼接获得全长F蛋白的基因序列,分别构建编码F和Core蛋白的重组质粒.将鉴定正确的重组质粒转人大肠埃希菌BL21中,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达HCV Core和F蛋白.应用镍离子亲和层析树脂纯化蛋白,并用Western印迹法鉴定其免疫原性.建立ELISA检测方法对121例慢性丙型肝炎患者血清巾抗F蛋白抗体进行检测.结果 成功构建含HCV F蛋白、Core蛋白编码基因的重组克隆,表达纯化获得的HCV F蛋白和Core蛋白,Western印迹法鉴定并确定其特异性.121例慢性丙型肝炎患者血清巾抗Core和抗F抗体的阳性率分别是93%和65%,而40例HBV感染者和40例健康对照者血清反应阴性.结论 F蛋白在HCV自然感染中有表达,并能产生特异的免疫反应,其生物学功能及在HCV感染过程中的作用有待进一步研究.     

HGV/GBV-C与HCV混合感染者肝组织中相关病毒表达的免疫组化研究

目的 了解HGV/GBV-C与HCV混合感染者肝组织HGV/GBV-C相关抗原的分布状况,探讨HGV/GBV-C对肝脏的损害机制。方法 以抗HGV/GBV-C NS5单克隆抗体或抗HCV NS3单克隆抗体为试剂,采用免疫组织化学方法检测肝炎病人肝组织中HGV/GBV-C、HCV相关抗原表达。结果 56例肝炎病肝组织中HGV/GBV-C相关抗原表达阳性率为26.79％(15/56);HCV NS3抗原表达阳性率为39.29％(22/56)。HGV/GBV-C NS5抗原表达阳性信号主要位于肝细胞胞浆中,染色阳性细胞周围可见淋巴细胞浸润。结论 肝细胞中存在HGV/GBV-C相关抗原表达,其编码产物可能作为一种靶抗原,诱发免疫病理反应,免疫损伤可能是其发病机制之一。     

HCV NS5和核心抗原在肝细胞癌及癌旁肝组织的表达及意义

采用ＳＰ法检测４６例肝细胞癌及其３８例癌旁肝组织中ＨＣＶ ＮＳ５抗原，ＨＣＶ核心抗原和ＨＢｓＡｇ。结果在癌组织中的检出率分别为１５．２％，２１．７％和１９．６％，癌旁组织中的检出率分别为３１．６％、３６．８％和７８．９％；ＮＳ５抗原、核心抗原伴ＨＢｓＡｇ者分别为２１．７％和２３．９％，不伴ＨＣＶ核心抗原、ＮＳ５抗原者分别为４７．８％和５０％。两种ＨＣＶ抗原和ＨＢｓＡｇ均定位于肝细胞和肝癌细胞的胞浆     

BRCAA1蛋白在胃癌组织与不同分化细胞株中的表达及其临床意义

背景：BRCAA1蛋白是-个新蛋白，其在胃癌发生、发展中的作用尚不明确。目的：探讨BRCAA1蛋白在胃癌组织与不同分化细胞株中的表达水平及其临床意义。方法：收集60例胃腺癌患者，分别取胃癌和癌旁组织．应用免疫组化SP法检测BRCAA1蛋白的表达水平，并分析其与胃癌分级的关系。蛋白质印迹分析检测BRCAA1蛋白在胃癌高分化（MKN-1和MKN-74）、中分化（SGC-7901）和低分化（KATO．m和MGC80—3）细胞株中的表达水平。结果：胃癌组织中BRCAA1蛋白的表达阳性率（23，60，38．3％）显著高于癌旁组织（0，60，0％）（P〈0．01）；BRCAA1蛋白在高分化（2／17，11．8％）、中分化（11，26，42．3％）和低分化胃癌组织中（10／17．58．8％）的表达阳性率存在显著差异（P〈0．05）。蛋白质印迹分析结果表明BRCAA1蛋白在胃癌高、中、低分化细胞株中的表达水平逐渐增强。结论：BRCAA1蛋白参与了胃癌的发生、发展，其表达水平与胃癌低分化程度密切相关，BRCAA1蛋白可能是-个胃癌不良预后的标志物。     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

乙型肝炎病毒核心启动子部分缺失真核表达载体的构建及对病毒抗原表达的影响

乙型肝炎病毒核心启动子 (ＣＰ)部分缺失变异已证实在几种ＨＢＶ感染的临床现象中存在[1 3 ] 。我们在一组 14例血清抗 ＨＢｅ阳性的无症状携带者中 ,发现有 9例在ｎｔ174 8(或ｎｔ174 7)至ｎｔ176 7间 2 0 (或 2 1)个核苷酸的缺失 ,此 9例中有 5例合并有ｎｔ1896Ｇ→Ａ点变异[4] 。本研究在此基础上 ,拟构建这种ＣＰ 2 0 / 2 1ｂｐ缺失及合并存在Ａ1896点变异的ＨＢＶ全基因重组真核表达载体 ,并转染ＨｅｐＧ2细胞 ,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响。一、材料与方法1 材料 :ＥＢＯ ｐｐｌｐ质粒由美国Ｓｃｒｉｐｐｓ研究所Ｆｒａｎ…     

HCV RNA及其编码蛋白在肝癌和癌旁肝组织中的表达

本文采用光敏生物素标记的ＨＣＶｃＤＮＡ探针和免疫金银显色法对４２例肝癌和癌旁肝组织中的ＨＣＶＲＮＡ和ＨＣＡｇ进行了检测，发现ＨＣＶＲＮＡ可以感染肝癌细胞，其分布状态及其抗原表达亦与肝组织一致。这些阳性细胞在组织中的感染状态多呈区域性，在此区域又可呈片状、簇状或散在分布。     

GM-CSF基因增强HCV核心蛋白基因DNA疫苗的免疫应答

目的:研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)编码基因对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白编码基因重组质粒诱导的免疫应答有无增强作用.方法:人工合成HCV核心蛋白基因至克隆载体pUC 119上,酶切后与真核表达质粒pCMH6K连接,测序正确后将重组质粒pCMH6K/HCV-C转染中华仓鼠卵巢(China hamster ovary,CHO)细胞.免疫荧光检测转染的CHO细胞中HCVC蛋白分布与表达.将已构建成功的GM-CSF编码基因重组子(pGM-CSF)联合pCMH6K/HCV-C肌注免疫Balb/c鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清抗HCV C特异性抗体水平,经流式细胞仪检测不同免疫原免疫鼠后脾T淋巴细胞亚群及Th细胞内细胞因子[干扰素-(interferon-,IFN-)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)]变化,LDH法测定CTL活性.结果:pCMH6K/HCV-C经鉴定构建正确.所编码的蛋白主要分布于胞膜,少量分布于胞浆.pGM-CSF+pCMH6K/HCV-C联合免疫组和pCMH6K/HCV-C单独免疫组均产生抗HCVC特异性抗体,两组间比较差异无统计学意义;联合免疫组CD4+T淋巴细胞比例为44.90%±5.99%,明显高于其他组(P<0.05).不同免疫组CD8+T细胞比例变化不大,与空载体pcDNA3.1(+)组比较,差异无统计学意义(P>0.05).联合免疫组CTL活性为56.48%±4.68%,明显高于其他组(P<0.05).联合免疫组IFN-/IL-4比值为18.20±2.36,明显高于其他组(P<0.05).结论:GM-CSF编码基因可增强HCV C基因DNA疫苗的细胞免疫应答,并能够诱导Th1型免疫应答.