BAG-1基因沉默对非小细胞肺癌放射敏感性的影响及机制

目的探讨BAG-1基因与非小细胞肺癌放射敏感性的关系,为非小细胞肺癌个体化治疗提供理论依据。方法对A549肺腺癌细胞、H460大细胞癌及NCL-H520鳞癌细胞三株非小细胞肺癌细胞株及人胚肾细胞株HEK293行细胞放射敏感性试验,采用Western blot法检测各细胞株中BAG-1蛋白表达情况。选择其中对放射线相对较抗拒、BAG-1蛋白表达最高的A549细胞株,构建干扰载体pGCsi-BAG-1并筛选BAG-1基因沉默细胞株,用shRNA-2转染,酶标仪检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,放射敏感性试验观察细胞对放射线的敏感性。结果 shRNA-2转染的细胞株生长受到抑制,且随时间延长抑制作用明显,而阴性对照质粒转染的A549细胞株生长无明显变化;6 Gy射线照射后24 h,shRNA-2转染细胞凋亡率为(49.6±4.23)%,未转染的A549细胞为(15.3±2.11)%,阴性对照质粒转染细胞为(14.8±3.55)%,shRNA-2转染细胞凋亡率较未转染细胞增加了3.2倍(P<0.01),而阴性对照转染细胞与未转染细胞间相比差异无统计学意义;亲本A549细胞和阴性对照转染细胞之间的放射敏感性无差异(P>0.05)。而shRNA-2转染细胞的放射敏感性明显增加,与前二者比较差异有显著性(P<0.05)。结论 BAG-1基因沉默可增强非小细胞肺癌放射敏感性,可能机制为BAG-1基因沉默后抑制细胞生长,抗凋亡作用减弱,细胞内BAG-1分布发生改变,细胞对射线更敏感。     

转染GML基因的肺癌A549细胞对不同化疗药物的敏感性

目的探讨GML基因对于增加肺癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法将顺铂、紫杉醇、长春瑞滨、伊立替康分别作用于正常的A549肺癌细胞与转染GML基因的A549细胞,应用MTT法测定化疗药物对细胞的杀伤率,计算出各种化疗药物针对各组细胞的IC50。结果转染GML基因可以抑制肺癌细胞A549的生长,转染GML基因的细胞明显提高对顺铂、紫杉醇、长春瑞滨、伊立替康的敏感性,其中以长春瑞滨、顺铂最为明显,转染GML基因细胞与为未转染基因细胞相比其IC50分别降低了5倍与4倍。结论转染GML基因可以显著提高肺癌A549细胞对多种化疗药物的敏感性,但不同的化疗药物提高的程度不同。     

WWOX基因转染抑瘤效应的实验研究

目的建立肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体，观察其瞬时转染对肿瘤细胞凋亡的影响。方法采用RT-PCR方法，从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因，将其克隆至pMD18-T载体上，测序正确后克隆到真核表达载体pcDNA4／myc-His中；采用脂质体介导法体外瞬时转染人肺腺癌A549细胞；RT—PCR法和Western印迹法分别检测WWOX基因mRNA和蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率；克隆形成试验观察肿瘤细胞克隆形成能力的变化。结果成功构建了WWOX的真核表达载体，体外转染的A549细胞凋亡率明显高于未转染和空载体转染细胞，且细胞克隆形成能力下降，形成率为35．43％，明显低于未转染细胞和空载体转染细胞。结论所构建的pcDNA4／myc-WWOX真核表达载体转染肿瘤细胞能够抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。     

人IFN-β重组慢病毒的制备及对肺癌细胞增殖的影响

人β干扰素;;慢病毒载体;;基因转染;;A549细胞 %X 目的构建人β干扰素（IFN-β）基因重组慢病毒,体外转染人肺癌A549细胞,观察IFN-β基因的表达及其对A549细胞的增殖抑制作用。方法通过聚合酶链反应（PCR）获得人IFN-β基因,克隆到慢病毒载体,通过转染293细胞包装制备慢病毒液,并体外感染A549细胞,采用RT-PCR及Western Blot检测IFN-β基因在A549细胞中的表达情况。应用MTS法检测转染后对A549细胞增殖的影响。结果 IFN-β基因重组质粒经酶切后电泳结果显示能得到与理论大小相符的片段,基因测序结果与GenBank序列完全一致,重组质粒经鉴定正确,转染293细胞获得病毒滴度为3×107PFU/ml,体外感染A549细胞后,RT-PCR、Western Blot检测IFN-β表达水平明显增高,并可明显抑制A549细胞增殖。结论本研究成功构建IFN-β基因重组慢病毒,体外感染后能够稳定表达并抑制A549细胞增殖,为应用IFN-β基因治疗肺癌奠定初步基础。     

外源性p16基因对人肺癌细胞生物学特性的影响

目的：研究外原性p16基因对肺癌细胞生物学特性的影响。方法：利用脂质体介导的基因转染方法将外源性p16基因转入p16基因缺陷的人肺腺癌细胞株A549中,用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）及免疫组化的方法检测p16基因的表达,同时观察转染后细胞恶性生长的变化。结果：外源性p16基因在A549细胞中能稳定表达,转染后A549细胞生长速度明显减慢,在软琼脂上形成克隆的能力降低。流式细胞仪检测显示A549细胞G1期阻滞并发生了凋亡,接种裸鼠后致瘤性降低,肿瘤生长明显减慢。结论：外源性p16基因导入人肺癌细胞株A549中可稳定表达并抑制细胞的恶性生长,同时诱导调亡。     

肺腺癌细胞中STAT3表达和活性变化对细胞生长及药物敏感性的影响

目的探讨STAT3表达和活性变化对细胞生长及化疗药物敏感性的影响。方法采用AG490处理细胞、SOCS3基因转染A549细胞后,Western blot检测STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平变化;MTT法检测细胞增殖情况;不同浓度泰素处理细胞后观察细胞对药物的敏感性。结果AG490处理细胞、SOCS3基因转染细胞后,Western blot证实其能显著抑制STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平（P〈0．01）;MTT法结果示细胞增殖明显受到抑制;细胞对泰素敏感性增高。结论AG490、SOCS3能抑制A549细胞中STAT3活性,抑制A549细胞增殖并增加其对化疗药物的敏感性。     

PBCA纳米粒介导的hTERT反义寡核苷酸对肺癌A549细胞周期和凋亡的影响

目的以聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒（PBCA-NPs）作为端粒酶逆转录酶（hTERT）反义寡核苷酸（ASODN）载体，转染肺癌A549细胞，观察其对该细胞周期和凋亡的影响。方法PBCA-NPs携带hTERT ASODN转染A549细胞后，绘制细胞生长曲线表达细胞生长状态的变化；流式细胞仪（FCM）检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果ASODN转染后A549细胞增殖减慢FCM检测结果显示．ASODN转染后细胞周期变化明显，细胞被阻滞于G0／G1期，细胞凋亡率明显增加。结论hTERTA SODN能有效改变A549细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡的发生。     

Livin基因沉默对大肠癌细胞凋亡和化疗敏感性的影响

目的 观察沉默Livin基因对大肠癌HT-29细胞凋亡和化疗敏感性的影响.方法 采用脂质体转染技术将化学合成的Livin siRNA转入HT-29细胞,RT-PCR和Western印迹法检测转染效果.选用5-氟尿嘧啶(5-FU)作用于转染和未转染的细胞,MTT检测各组细胞的增殖、流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 si-Livin1转染组Livinα mRNA、Livinβ mRNA和Livin蛋白表达水平较其余干扰组和对照组显著降低(P<0.01).5-FU对HT-29细胞的生长抑制作用强于si-Livin1转染组(P<0.01),而si-Livin1+5-FU组对细胞的生长抑制率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01).与空白对照组比较,si-Livin1转染可使细胞出现明显凋亡现象(P<0.01),5-FU对细胞的促凋亡作用强于si-Livin1转染组(P<0.01),si-Livin1+5-FU组的凋亡率显著高于单独si-Livin1转染组和单独5-FU作用组(P<0.01).结论 siRNA沉默Livin基因能够抑制HT-29细胞的生长,促其凋亡,提高5-FU的化疗敏感性.Livin基因有望成为大肠癌治疗的新靶点.     

腺病毒介导的CIAPIN1基因对肺癌细胞生长和细胞周期的影响

目的 以重组腺病毒载体介导细胞因子诱导的凋亡抑制分子1(cytokine induced apoptosis inhibitor 1,CIAPIN1)基因转染人肺腺癌细胞系A549,观察并鉴定该基因在腺癌细胞中的表达及其对细胞生长和细胞周期的影响.方法 构建腺病毒载体介导CIAPIN1基因(Ad-CIAPIN1),转染到低水平表达CIAPIN1的人肺腺癌细胞系A549,采用Western blot检测目的蛋白的表达;台盼蓝染色计数活细胞数,绘制细胞生长曲线;流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化.结果 外源性CIAPIN1基因在A549肺癌细胞获得高水平的表达;CIAPIN1能显著抑制A549的生长(P＜0.01);流式细胞仪检测显示肺癌细胞发生凋亡,并出现明显的G1/S期阻滞现象.结论 以腺病毒为载体介导CIAPIN1基因在A549细胞内表达,可发挥抑制细胞生长、诱发细胞凋亡及参与细胞周期调控的作用.提示Ad-CIAPIN1基因可能在人肺癌基因治疗中发挥重要作用.     

Chk1基因沉默对人卵巢癌细胞 A2780放疗敏感性的影响

目的：探讨Chk1基因沉默对人卵巢癌细胞A2780放疗敏感性的影响。方法构建Chk1基因的短发夹RNA（shRNA）质粒转染人卵巢癌细胞A2780,同时以转染空载体和未转染组作为对照组,运用RT-PCR、蛋白免疫印迹方法观察转染前后Chk1基因表达的差异;四甲基偶氮唑蓝试验绘制细胞生长曲线;克隆形成试验观察细胞的放射敏感性变化。结果与对照组相比,构建shRNA表达载体可抑制人卵巢癌细胞A2780中Chk1 mRNA转录和蛋白的表达;Chk1基因沉默后细胞生长明显慢于对照组;并通过解除G2/M期阻滞,显著提高肿瘤细胞对放射线的敏感性。结论靶向Chk1的shRNA能有效抑制人卵巢癌细胞A2780的Chk1基因表达,促进细胞凋亡,增强肿瘤对放疗的敏感性。     

钠-氢交换蛋白1反义表达载体对人肺腺癌细胞钠-氢交换蛋白1基因表达的影响及其意义

目的　探讨Na /H 交换蛋白 1(NHE 1)反义表达载体 (pNHE 1)对人肺癌细胞NHE 1基因的抑制作用及生物学效应。方法　实验细胞分为 3组 ,A5 4 9 pNHE 1组 (反义组 )、A5 4 9空载体组(空载体组 )、A5 4 9对照组 (A5 4 9组 )。采用阳离子脂质体使pNHE 1转染人肺腺癌A5 4 9细胞株。采用半定量逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)法测定 3组细胞的NHE 1mRNA表达水平 ;用荧光法测定 3组细胞内pH(pHi)值 ;了解转染细胞增殖生长状况 ;用细胞凋亡原位检测法检测 3组细胞凋亡率。结果　在转染细胞基因组DNA中扩增出外源真核表达载体的DNA片段 ,证明转染成功。半定量RT PCR法证实反义组细胞的NHE 1mRNA表达水平 (0 4 2± 0 0 6 )显著低于A5 4 9组 (0 71± 0 0 8,P <0 0 1)和空载体组 (0 6 9± 0 16 ,P <0 0 1)。A5 4 9组细胞在培养 12、2 4和 4 8h后pHi值分别为 7 15 0±0 0 0 4、7 14 0± 0 0 0 7和 7 12 0± 0 0 0 8,反义组pHi值分别为 6 990± 0 0 0 5、6 84 0± 0 0 0 5和 6 75 0±0 0 0 5 ,两组差异均有极显著性 (P <0 0 1)。A5 4 9组、空载体组和反义组的细胞倍增时间分别为 3 2 0、3 2 8和 4 97d ,反义组细胞的增殖、生长明显慢于A5 4 9组及空载体组 (P <0 0 1)。反义组细胞凋亡率为 (2 4     

长链非编码RNA linc00261在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)linc00261在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其临床意义。方法纳入中南大学湘雅医学院附属海口医院2017年2月至2018年9月收治的100例NSCLC患者,采用实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测患者癌组织及对应癌旁组织中lncRNA linc00261的表达水平,并分析其与患者临床病理特征的关系。通过设计合成lncRNA linc00261表达质粒,转染A549细胞,采用qRT-PCR检测转染细胞中lncRNA linc00261表达水平,使用MTT法检测转染细胞的增殖情况,使用流式细胞术检测转染细胞的凋亡情况。结果qRT-PCR检测结果显示,100例NSCLC患者癌组织中lncRNA linc00261的平均相对表达量(0.15±0.06)明显低于癌旁组织(1.19±0.23),差异有统计学意义(t=7.753,P<0.05)。不同性别、年龄、肿瘤直径及病理组织类型的NSCLC患者癌组织中lncRNA linc00261相对表达量比较差异均无统计学意义(P值均>0.05),但不同组织分化程度、临床分期及有无淋巴结转移患者癌组织中lncRNA linc00261相对表达量差异均有统计学意义(P值均<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,转染lncRNA linc00261表达质粒的A549细胞中lncRNA linc00261的表达量显著高于转染空载体的阴性对照组及空白对照组(F=5.196,P<0.001)。MTT检测结果显示,转染24 h后,3组之间细胞增殖能力差异无统计学意义(F=0.183,P>0.05);转染48、72、96 h后,转染lncRNA linc00261表达质粒的A549细胞的细胞增殖能力显著低于转染空载体的阴性对照组及空白对照组(t=3.187、5.549,P值均<0.05)。流式细胞书检测结果显示,转染48 h后,转染lncRNA linc00261表达质粒的A549细胞的凋亡比例显著高于转染空载体的阴性对照组及空白对照组(χ^2=4.175、6.093,P值均<0.05)。结论lncRNA linc00261在NSCLC患者癌组织中表达下调,并与NSCLC的发生发展有关,其在NSCLC中可能发挥抑癌基因作用,过表达lncRNA linc0026可抑制NSCLC细胞增殖并诱导凋亡,有可能成为NSCLC潜在的治疗靶点。     

转染野生型p53基因对苯并芘诱导的肺癌细胞生物学特性及其原发性耐药的作用

目的　探讨苯并芘的代谢产物反式二羟环氧苯并芘 (BPDE)诱发的p53基因突变,在肺癌发生发展中的作用,及外源性转染野生型p53基因对肺癌细胞原发性耐药的影响。方法　以携带野生型p53基因的缺陷型腺病毒穿梭载体(pshuttle-cmv-p53cDNA),感染由BPDE诱发p53基因突变的成瘤支气管上皮细胞株,用空载体pshuttle cmv为对照组。通过软琼脂集落形成试验、细胞生长曲线实验、细胞凋亡和体外化疗药物敏感性分析等探讨野生型p53基因的生物学效应。结果　外源野生型p53基因转染的肺癌细胞的集落数为(5.4±0.8)个、转染空载体组为 (22.5±2.5)个、未转染组为(24 5±3 5)个;p53基因转染组细胞克隆形成率为 0.5%、未转染组为 2.5%、转染空载体组为2.3%。p53基因转染组的集落形成率与未转染组和转染空载体组比较差异均具有统计学意义 (U值分别为 3.651和 3.642,P均 <0.01 );而未转染组与转染空载体组比较差异无统计学意义 (U=1.414, P>0.05)。外源野生型p53基因转染肺癌细胞可诱导其凋亡;同时逆转细胞对表柔比星的耐药。结论　p53基因突变在肺癌的发生、发展及耐药性方面可能具有重要的作用。野生型p53基因替代结合抗肿瘤药物对于提高肿瘤细胞的药物敏感性,克服耐药方面可能有一定的帮助。     

BIM重组腺病毒转染对EGFR突变NSCLC细胞凋亡及BIM表达水平的影响

目的探讨BIM重组腺病毒转染对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株的凋亡诱导作用及机制。方法将NSCLC细胞株A549、H1650、H1975分别培养至对数生长期后随机分为三组,其中转染组以BIM重组腺病毒转染、阴性对照组（NC组）以不带BIM的空载体转染、空白对照组（BC组）不转染,其后继续培养48 h。采用Annexin PI单染法检测细胞凋亡率,Western blot法检测BIM蛋白表达。结果与NC组和BC组比较,转染组细胞凋亡率及BIM蛋白表达均显著增高,其中H1650、H1975细胞株均显著高于A549细胞株（P均〈0.01）。结论 BIM重组腺病毒转染对EGFR突变NSCLC细胞凋亡具有诱导作用,可能机制为上调细胞内BIM蛋白表达;此为NSCLC的基因治疗提供了依据。     

着丝粒蛋白F在非小细胞肺癌组织中的表达及其对A549细胞生物学行为的影响研究

背景非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%左右,由于易错失最佳手术切除时机,且放化疗效果不佳,导致生存率偏低。而着丝粒蛋白F(CENPF)是在多种癌症中高表达的分子,探讨其对肺癌细胞生物学行为的影响,将有助于NSCLC的靶向治疗。目的探讨CENPF在NSCLC组织中的表达及其对A549细胞生物学行为的影响。方法收集2018年10月—2019年10月于西安医学院第一附属医院行外科切除手术的26例NSCLC患者的癌组织、癌旁组织标本。采用Western blotting法检测NSCLC组织、癌旁组织中CENPF表达水平。取生长良好的对数期A549细胞,将其分为对照组、阴性对照组、CENPF抑制组,其中对照组A549细胞不进行转染处理,阴性对照组、CENPF抑制组A549细胞使用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染阴性对照(NC)-干扰性小核糖核酸(si RNA)、CENPF-si RNA。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)法检测三组A549细胞中CENPF m RNA表达水平,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测A549细胞增殖情况[吸光度(OD)值],流式细胞仪检测A549细胞凋亡情况、A549细胞周期,Western blotting法检测A549细胞中CENPF、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白(Bax)表达水平。结果 NSCLC组织中CENPF表达水平高于癌旁组织(P <0.05)。CENPF抑制组A549细胞中CENPF m RNA表达水平低于对照组、阴性对照组(P<0.05)。CENPF抑制组A549细胞OD值低于对照组、阴性对照组(P<0.05)。CENPF抑制组A549细胞凋亡率高于对照组、阴性对照组(P <0.05)。CENPF抑制组G0/G1期A549细胞所占比例高于对照组、阴性对照组,S期、G2/M期A549细胞所占比例低于对照组、阴性对照组(P <0.05)。CENPF抑制组A549细胞中CENPF、cyclin D1表达水平低于对照组、阴性对照组,Bax表达水平高于对照组、阴性对照组(P <0.05)。结论 CENPF在NSCLC组织中表达升高,其可通过影响cyclin D1、Bax表达水平来影响A549细胞周期进展及增殖、凋亡过程;下调其表达可将A549细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制细胞增殖并诱导其凋亡。     

脆性组胺酸三联体基因对人肺腺癌A549细胞恶性表型的影响

目的研究外源性脆性组胺酸三联体(FHIT)基因在体内外对人肺腺癌A549细胞恶性表型的影响。方法用脂质体介导外源FHIT基因转染A549细胞,建立单克隆细胞系FHITA-549和PEGFP-A549。逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、免疫组化方法检测外源FHIT基因在A549细胞的表达状况。采用细胞生长曲线、集落形成试验、流式细胞仪及裸鼠移植瘤试验研究外源FHIT基因对A549细胞体外增殖、凋亡、细胞周期和体内成瘤性的影响。结果RTPCR试验证实FHIT-A549中有FHITmRNA表达,免疫组织化学染色显示FHIT-A549细胞FHIT蛋白表达强阳性,而A549细胞和转空载体的PEGFPA549细胞FHIT基因和蛋白表达均阴性。FHIT-A549细胞的集落形成率为2.6%,显著低于A549细胞的50.1%和转染空载体PEGFPA549细胞的53.6%,三者相比差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪分析显示FHIT-A549细胞95.8%阻滞在G2期。FHITA549细胞移植瘤的瘤重为(0.04±0.03)g,显著低于A549细胞的(0.24±0.11)g和转染空载体PEGFPA549细胞的(0.25±0.07)g,三者差异有统计学意义(P<0.01)。结论A549细胞内外源FHIT基因的转导并表达能显著抑制其恶性增殖和分裂,诱导其凋亡,调节其细胞周期、抑制成瘤性。     

靶向表皮生长因子受体的RNA干扰技术对非小细胞肺癌细胞株A549细胞抑制及顺铂敏感性的研究

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术,将携带表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)同源基因的重组质粒稳定转染非小细胞肺癌细胞株A549细胞,观察其对A549细胞生长抑制作用及对顺铂敏感性的变化.方法 根据RNAi原理,体外设计并合成靶向EGFR特异性干扰片段,即h-EGFR,以pGensil-1为载体,构建重组质粒pGensil-1-EGFR,以Lipofectamine 2000介导转染肺腺癌细胞株A549细胞,经G418筛选后挑选出稳定转染的单克隆细胞.将所挑选出的单克隆细胞大量培养后加入不同浓度顺铂(40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L),采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞活力,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡的变化,观察RNAi对A549细胞抑制作用及是否与顺铂有协同作用.结果 与对照组、阴性对照组相比,从第2天起实验组生长缓慢,吸光度有统计学差异(P＜0.05);顺铂或联合dsRNA-EGFR对A549细胞有抑制作用,且随着浓度的增加和时间的延长抑制作用增强,dsRNA-EGFR联合顺铂与等浓度顺铂吸光度有统计学差异(P＜0.05),顺铂作用24 h后40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L顺铂抑制率分别提高了7.8%、30.70%、34.42%.实验组G0/G1细胞百分比较对照组增加了13.84%,较阴性对照组增加了14.65%,进入S期的细胞百分比较对照组减少了19.10%,较阴性对照组减少了18.68%;40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L顺铂处理细胞24 h后,与对照组相比,凋亡率明显增高(P＜0.05),且浓度越高,凋亡率越高;同一浓度顺铂作用下转染pGensil-1-EGFR的A549细胞凋亡率较A549细胞增高(P＜0.05).结论 dsRNA-EGFR可有效抑制A549细胞生长,使细胞阻滞在G0-G1期,顺铂可有效诱导细胞凋亡,RNAi与顺铂具有协同效应,提高细胞对顺铂的敏感性,RNAi技术为非小细胞肺癌基因治疗提供了新策略.