原位分子杂交检测上海真厉螨与柏氏禽刺螨体内肾综合症出血热病毒的研究

目的：提供革螨传播肾综合征出血热病毒（HFRSV）的分子生物学证据。方法：用上海真厉螨与柏氏禽刺螨叮咬HFRSV接种乳小鼠，取叮咬后d10及d100以上的上海真厉螨与柏氏禽刺螨冰冻切片，用地高辛标记HFRSVcDNA核酸探针原位分子杂交检测其体内病毒RNA。结果：叮咬野鼠型（76－118株）接种乳小鼠后d10上海真厉螨检出病毒RNA，在细胞浆、细胞核中及核膜上呈细密颗粒状或全浆阳性，见于生殖器官细胞、胃及支囊上皮细胞及脑皮质细胞；叮咬家鼠型（UR株）病毒接种乳小鼠后d12螨亦检出病毒RNA，病毒的细胞组织分布与野鼠型相同；分别检测野鼠型螨31 只和家鼠型23 只, 其中阳性分别为17 只和10 只; 叮咬野鼠型病毒接种乳小鼠后d132, 家鼠型d102螨仍能检出病毒RNA。柏氏禽刺螨叮咬野鼠型病毒接种乳小鼠d10, 检测螨20只, 其中阳性12 只, 病毒RNA 主要分布于生殖器官细胞内。结论: 上海真厉螨与柏氏禽刺螨均可经叮咬获得HFRSV , 上海真厉螨可分别感染野鼠型和家鼠型HFRSV , 野鼠型在螨群体内至少可维持132 d, 家鼠型102 d, 具有贮存两型病毒的作用, 是HFRSV 的适宜媒介和贮存宿主, 在动物宿主间交叉传播两型HFRSV 中起重要作用。     

原位分子杂交检测厩真厉螨经叮刺传播姬鼠型和家鼠型HFRSV的研究

目的用分子生物学方法进一步证明革螨在传播两型HFRS中的作用。方法将叮刺感染姬鼠型（76—118株）HFRSV乳鼠后第10天厩真厉螨270只和家鼠型（UR株）HFRSV后第10天厩真后螨200余只,分别制成组织悬液接种正常乳鼠,用Dig标记HFRSVCDNA探针原位分子杂交检测接种后第9天鼠肺;将叮刺感染乳鼠后螨在适宜条件下饲养至100天以上,分别叮刺4～5日龄正常乳鼠,于第3天取鼠肺冰冻切片,经Dig标记HFRSVCDNA探针原位分子杂交检测。结果叮刺76一118株病毒感染乳鼠螨悬液接种4只乳鼠,3只阳性,UR株接种6只,全部阳性;76—118株组饲养至132天,UR株组102天的螨叮刺正常乳鼠后,也从鼠肺中检出病毒RNA。结论首次用分子生物学方法证明该螨可通过叮刺获得姬鼠型和家鼠型HFRSV,螨群体不但维持76—118株病毒132天以上、UR株102天以上,而且均能经叮刘传播,说明此螨能作为姬鼠型和家鼠型HFRSV的适宜传播媒介和贮存宿主,这一发现为我国的HFRS疫区保存和演变提供了一定的实验依据,有流行病学意义;原位分子杂交可缩短用敏感动物分离革螨体内HFRSV的时间,可用于革螨等媒介昆虫传HFRSV的实验研究和流行病学调查。     

原位分子杂交检测厩真厉螨经叮刺传播姬鼠型和家鼠型H …

目的 用分子生物学方法进一步证明革螨在传播两型ＨＦＲＳ中的作用。方法 将叮刺感染姬鼠型（７６－１１８株）ＨＦＲＳ Ｖ乳鼠后第１０天厩真厉螨２７０只和家鼠型（ＵＲ株）ＨＦＲＳ Ｖ后第１０天厩真厉螨２００余只，分别制成组织悬液接种正常乳鼠，用Ｄｉｇ标记ＨＦＲＳＶ ｃＤＮＡ探针原位分子杂交检测接种后第９天鼠肺；将叮刺感染乳鼠后螨在适宜条件下饲养至１００天以上，分别叮刺４￣５日龄正常乳鼠，于第３天取鼠肺冰     

？须恙螨感染流行性出血热病毒的实验研究

本实验研究人疫区流行性出血热病毒抗原阳性鼠体所带的须恙螨幼虫中分离到１株ＥＨＦＶ；另从叮刺吸食感染ＥＨＦＶ小鼠体液的游离须恙螨幼虫中也分离到１株ＥＨＶ。     

革螨、恙螨感染汉坦病毒最小感染阈值及增长的动态观察

目的　研究螨 (革螨、恙螨 )感染汉坦病毒 (HantavirusHV)阈值和潜伏期。方法　采用革螨、恙螨叮刺不同感染剂量HV的乳鼠 ;用组织培养半数感染剂量 (5 0 %tissuecultureinfectivedose,TCID50 )测定、计算螨最小感染HV阈值 ;并动态观察HV在螨体内增殖 ,计算HV在螨体内的潜伏期。结果　在测定的 8组中革螨除 1 5LD5 0未感染外 ,其余 7组均能使革螨感染 ,HV在革螨体内开始增殖时间约在叮刺后第 2 5～ 30d。恙螨在测定的 8组中除 1 5和 5LD5 0未感染外 ,其余 6组均能使革螨感染 ,HV在恙螨增殖时间约在叮刺后第 30～ 4 0d。原位分子杂交检测发现HV阳性信号多见于螨的中肠细胞内 ,卵巢、卵细胞较少。结论　革螨感染HV的最小阈值为 5TCID50 ,HV在革螨体内潜伏期约 2 5～ 30d。恙螨感染HV最小阈值为10TCID50 ,HV在恙螨体内潜伏期为 30～ 4 0d。     

云南省恙虫病与肾综合征出血热混合感染的诊断及分析

目的 调查云南省不明原因发热患者中是否存在恙虫病与肾综合征出血热混合感染病例.方法 采用间接免疫荧光法和胶体金法检测不明原因发热患者血清中的恙虫病东方体(OT)抗体及肾综合征出血热(HFRS)病毒抗体,用巢式PCR扩增患者血液中的OT 基因sta56片断与汉坦病毒(HV)基因L片断.结果 79例患者中,实验室确诊HFRS 5例,恙虫病3例,HFRS与恙虫病混合感染4例;巢式PCR检测到HV L片断核酸2例(DLR2和DLR6), 序列分析两者间的同源性100%,DLR2与老挝汉城病毒L0199株核苷酸序列同源性最高为94.6%, 与中国汉城病毒L99株的同源性80.5%, 与云南汉坦病毒YN06-256的同源性69.8%.结论 首次证实云南省存在恙虫病与肾综合征出血热混合感染病例,其HFRS病原体遗传进化关系与老挝汉城病毒L0199株密切相关.     

大鼠单克隆抗体对肾综合征的出血热病毒感染乳鼠保护作用观察

用肾综合征出血热病毒陈株感染乳，检测１１侏大鼠单隆抗体（ＭｃＡｂ）对感染乳鼠的保护作用。结果表明，其中４株ＭｃＡｂ被动使用后对感染乳鼠有较高的保护作用。ＭｃＡｂ保护力的大小与使用抗体中的活性有无、使用时间的早晚有密切的关系。同时发现多种ＭｃＡｂ混合使用保护效果优于单一的保护作用。本文亦分析了ＭｃＡｂ在活体内的保护作用与其它抗病毒保护机制的关系。     

汉坦病毒体外感染乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞

目的 证实乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞是汉坦病毒属(HV)汉滩病毒(HTNV)和汉城病毒(SEOV)感染的靶细胞,观察病毒感染星形胶质细胞后的动态变化.方法 建立乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养体系,用HTNV 76-118和SEOV L99分别感染乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞,免疫荧光染色、Western印迹和RT-PCR检测病毒感染细胞后病毒NP和S基因片段的变化.结果 成功建立了乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养体系,并通过免疫荧光染色、Western印迹和RT-PCR证实HTNV 76-118和SEOV L99可以感染离体培养的乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞,随感染时间推移,病毒感染细胞数和病毒量显著增加.结论 乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞可作为HTNV和SEOV感染的靶细胞.这为研究肾综合征出血热发病机制提供了实验平台.     

大鼠单克隆抗体对肾综合征出血热病毒感染乳鼠保护作用观察

用肾综合征出血热病毒陈株(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome Virus,HFRSV Strain Chen)感染乳鼠,检测11株大鼠单克隆抗体(McAb)对感染乳鼠的保护作用。结果表明,其中4株McAb被动使用后对感染乳鼠有较高的保护作用。McAb保护力的大小与使用抗体中和活性有无、使用时间的早晚有密切的关系。同时发现多种McAb混合使用保护效果优于单一运用的保护作用。本文亦分析了McAb在活体内的保护作用与其它抗病毒保护机制的关系。     

丝虫显性感染期淋巴细胞的无应答性:海群生的调节作用

作者对感染棉鼠丝虫的纳塔尔多乳鼠观察了经海群生治疗后淋巴细胞对丝虫抗原刺激应答的变化。通过巴氏禽刺螨的感染性叮咬使纳塔尔多乳鼠‘GRA’Giessen株感染棉鼠丝虫。当微丝蚴密度超过每微升200条时将动物分成4组。Ⅰ组与Ⅲ组各6鼠作为对照组。Ⅱ组含鼠9只,给予一个海群生疗程(150mg口服×5天)。第6天计数微丝蚴     

Isolation of Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever, from wild urban rats

Urban rats captured in Seoul and four nearby Korean cities were found to have immunofluorescent antibodies reactive with Hantaan virus, the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever (KHF). Serum antibodies were detected in 13% from 477 Rattus norvegicus and 11% of 47 Rattus rattus. Hantaan viral antigen was found in pulmonary tissues of 42 animals, and Hantaan virus was recovered from 23 rats, all but two of which were R. norvegicus. Wistar rats were qualitatively much more sensitive than Apodemus agrarius rodents for isolation of virus from tissues of wild rats. Wistar rats inoculated with one of these strains had virus in lung and spleen for at least 75 days. These results document the existence of an urban cycle for Hantaan virus, which had been suspected on the basis of the occurrence of sporadic urban cases in humans of KHF, and suggest that Rattus-borne Hantaan virus may be widely distributed in urban centers.     

2009年云南省肾综合征出血热监测分析

目的进一步掌握肾综合征出血热（HFRS）在云南省的流行特征,为防治提供依据。方法收集云南省本病疫情资料,采集人血清、鼠类肺脏作汉坦病毒（HV）抗体和抗原检查。结果2009年云南省共报告本病16例,死亡1例,年发病率为0．04／10万。病死率为6．25％：发病地区为大理、昆明、红河、文山、楚雄和怒江州（市）。在固定监测点泸西县、祥云县和昆明市五华区捕获鼠类8属15种559只,人血清292份,其中居民区以黄胸鼠和褐家鼠为优势鼠种,野外以大绒鼠和高山姬鼠为优势鼠种;鼠间HY带毒率为3．78％（20／529）,带毒鼠型动物为褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、大足鼠、大绒鼠、臭鼩鼱和灰麝鼩。健康人血清HV抗体检测,人群隐性感染率4．45％（13／292）。结论进一步证实了云南省存在着以褐家鼠和黄胸鼠为主要宿主的家鼠型HFRS疫源地,也存在着以高山姬鼠和大绒鼠为主的野鼠型疫源地;近几年发病率有所下降与鼠密度和鼠间HV感染率降低有关。     

PCR-ELISA用于HFRS病人早期诊断的研究

目的　建立检测HFRS患者血清标本中HV基因的PCR -ELISA方法。方法　设计并合成互补于HVS基因片段的标记引物 ,对 98例HFRS患者血清进行RT -nestedPCR扩增 ,并用酶免方法分析扩增产物。结果　 98例患者不同病日采集的血清标本的RT -nestedPCR平均检出率仅为 6 0 .2 % ,而PCR -ELISA平均检出率为 80 .6 %。结论　PCR -ELISA用于早期HFRS患者的HV基因检测是一种理想的检测方法     

CODEHOP RT-PCR方法在汉坦病毒基因型别鉴定和分子溯源中的应用

分析CODEHOP RT-PCR方法对于汉坦病毒(HV)基因型别鉴定和分子溯源中的应用效果。方法 选取实验室保存的汉滩型病毒阳性鼠肺样品DX0901和汉城型病毒阳性鼠肺样品DX1101,用CODEHOP RT-PCR扩增HV病毒L基因片段并测序,进行Blast同源性比对和系统发生分析。结果 两份样品均获得478 bp大小的RT-PCR扩增产物,汉滩病毒DX0901与汉滩病毒株Nc167同源性最为接近,遗传距离为0.142。汉城病毒DX1101与汉城病毒株ZT10,ZT71,Z37同源性最为接近,遗传距离为0.049。结论 CODEHOP RT-PCR方法可以有效的用于对汉坦病毒进行基因型别鉴定和分子溯源。     

陕西延安地区肾综合征出血热流行情况研究报告

目的 明确陕西延安地区为肾综合征出血热疫源地及病毒基因型别。方法 择有疫情报告地,进行人群疫情调查及健康人群特异性抗体检测;用夹夜法捕鼠,调查鼠种及鼠密度,采集鼠肺、血标本。人血、鼠血分别用IFA和ELISA法检测IgG抗体;鼠肺采用RT-PCR检测汉坦病毒(HV)RNA,测定PCR产物并与HV代表株76-118和Seoul序列进行比较。结果 对延安市防疫站2001年统计的7例HFRS患者进行流行病学调查,均属在当地感染;检测延安市洛川县交口河镇245例人血标本HV特异性IgG抗体,阳性50例,人群隐性感染率为20.41％。22份鼠肺及鼠血标本,IFA抗HV IgG阳性3例,ELISA阳性5例。从一只鼠血抗体阳性的鼠肺中检测到HV RNA,序列测定符合Seoul S片段序列(94％)。结论 延安市洛川县交口河镇为HFRS疫源地及新疫区,洛川交口河镇健康人群、褐家鼠、小家鼠中有HV感染,病毒型别为SEO型。     

胶体金免疫渗滤法快速诊断肾综合征出血热的临床研究

目的 建立一种快速，敏感的检测血清中抗汉坦病毒IgM抗体的方法。方法 将抗人IgM抗体点于硝酸纤维素膜上，以捕获患者血清中特异性IgM抗体，向已包被抗体的硝酸纤维素膜上滴加患者血清后，再选后滴加汉坦病毒抗原和鼠抗汉坦病毒抗体，最后滴加金标抗鼠抗体直接显色，阳性反应为红色，整个操作过程一般不超过10分钟。结果 用该法与IgM抗体捕获法ELISA对比检测51份肾综合征出血热（HFRS）患者血清标本，两法均阳性者49份，均阴性者2份。总符合率为100%，敏感性为96%。结论 胶体金免疫渗滤法操作简便，反应迅速，敏感性较高，适于在基层医疗单位中应用，可用于HFRS的早期诊断。     

2007年浙江丽水地区汉坦病毒的分离与型别鉴定

目的对2007年从浙江省丽水地区肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫区鼠肺分离的汉坦病毒进行型别鉴定和分子生物学特性研究。方法将汉坦病毒抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞,分离汉坦病毒。提取病毒总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒S基因全片段,克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析,应用DNA STAR软件分析比较,确定病毒型别。结果从疫区7份阳性鼠肺中分离到2株汉坦病毒,经汉坦病毒单克隆直接荧光血清检查和基因序列测定,结果为汉滩型(HTN)病毒,2株病毒与国际标准株76-118(HTN型)和80-39(SEO型)S片段核苷酸的同源性分别为84.7%、84.6%和64.2%、64.0%。结论浙江省丽水地区可能存在以HTN型病毒为主的肾综合征出血热自然疫源地。     

黑龙江口岸地区鼠类动物中汉坦病毒感染情况调查

目的 了解黑龙江省中俄边境11个口岸鼠类宿主动物携带汉坦病毒(Hantavirus,HV)状况及其分子流行病学特征。方法 采用夹夜法和鼠笼法捕获鼠类,应用巢式PCR方法对鼠肺样本进行检测,对阳性样本测序并分型,获得序列用MEGA6进行分析。结果 此次调查共捕获鼠类动物346只,经鉴定隶属3科9属11种。检测出汉坦病毒核酸阳性样本17份,平均带毒率为4.90 %,包括汉滩型病毒(Hantaan virus, HNTV)6例,汉城型病毒(Seoul virus, SEOV) 11例,首次在黑龙江口岸东方田鼠中检测到1例SEO型HV。进化分析表明,6株HNT型HV均与HNT型HV原型株76-118亲缘性较远(86.82%~88.43%),分别与HNT型HV株BAO14、HXZ244同源性最高;11株SEO型HV分别与SEO型HV株Gongzhuling97、北京株BjHD01、越南株HaiPhong3-11同源性最高。结论 黑龙江中俄边境口岸宿主动物感染汉坦病毒至少2个类型,相对较高的感染率提示着中俄边境地区开展肾综合征出血热监测和防控的迫切性。