骨髓间充质干细胞对大鼠减体积肝移植术后肝细胞再生与修复的作用

目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）对大鼠减体积肝移植术后肝脏再生与修复的影响。方法采用生化、免疫组化等方法检测术后不同时间的血清和肝脏标本。（1）取同周龄Wistar大鼠骨髓体外培养BMSCs,标记CSFE荧光后制备悬液;（2）建立大鼠50%减体积肝移植模型（供体鼠为SD大鼠,受体鼠为Wistar大鼠）,分为实验组（取BMSCs悬液经门静脉植入）和对照组（取等量生理盐水经门静脉注射）,观察大鼠生存状态,测量肝再生的相关指标。结果 （1）成功分离培养BMSCs;（2）术后2h,大鼠均自由活动饮水;（3）实验组肝组织中存在大量BMSCs,术后第2、3 d实验组肝体比显著高于对照组。病理显示：实验组肝细胞损伤较对照组轻微。结论植入BMSCs后,可以促进大鼠减体积肝移植术后肝细胞增殖和修复。     

糖尿病大鼠胰岛素原基因转基因治疗的研究——门静脉注射与肌肉注射对血糖影响的比较

目的 比较门静脉注射与肌肉注射胰岛素原转基因治疗对糖尿病大鼠血糖的影响.方法 (1)分别用门静脉注射及肌肉注射的方法将含有大鼠胰岛素原基因的重组表达质粒pCMV/胰岛素原DNA裸质粒导入糖尿病大鼠模型以观察其血糖的变化.门静脉注射治疗组(A组)及肌肉注射治疗组(C组)每只大鼠分别接受pCMV/胰岛素原DNA 100μg,门静脉对照组(B组)和肌肉对照组(D组)则分别以同样方法给予同等剂量pCMV空载质粒DNA.同时设立糖尿病对照组(DM组)和正常对照组(N组).(2)采用超敏放射免疫法检测大鼠转基因治疗前后胰岛素浓度的变化,用RT-PCR和免疫组化方法检测治疗后大鼠肝脏、骨骼肌等组织胰岛素原基因mRNA和蛋白的表达水平.结果 (1)接受重组质粒pCMV/胰岛素原DNA裸质粒的两治疗组糖尿病大鼠血糖显著下降.其中,门静脉组大鼠血糖下降约7 mmol/L,且能维持3～4周,血清胰岛素水平显著升高,且可持续表达4周;肌肉注射组大鼠血糖下降约4 mmol/L,且能维持1～2周,血清胰岛素水平明显升高,并持续表达2周.(2)门静脉治疗组大鼠的肝脏及肌肉注射治疗组大鼠的骨骼肌分别能够检测到大鼠胰岛素原mRNA和蛋白的表达,而对照组则显示阴性结果.结论 裸质粒门静脉注射和肌肉注射两种方法均获得了糖尿病大鼠胰岛素原基因的有效表达和血糖水平的显著降低,是糖尿病基因治疗的有效手段之一.     

裸露DNA经胆道分支导入活体肝脏的局部表达

目的 经胆道分支逆行导入裸露DNA,观察目的基因在正常及急性损害大鼠局部肝脏的定量和定位表达.方法 运用D-氨基半乳糖制作大鼠急性肝损害模型;经胆管分支将Cy3荧光标记CMV β质粒通过胆道分支逆行导入局部肝脏,观察裸露DNA导入肝脏的情况.同时运用包含萤火虫荧光素基因质粒pGL3及包含大肠埃希氏菌β半乳糖苷酶基因质粒pCMV β逆行导入大鼠局部肝脏,定量检测荧光素酶和定位检测β半乳糖苷酶在肝脏的表达.应用非参数Kruskal-Wallis法秩和检验进行统计分析.结果 肝组织冰冻切片观察到Cy3荧光标记DNA在汇管区附近聚集.按100 μg/ml浓度进行基因导入,荧光素酶基因在正常大鼠肝脏,急性损害大鼠肝脏均有显著表达.大肠埃希氏菌β半乳糖苷酶定位检测结果显示正常大鼠肝脏及急性肝损害大鼠肝脏内有β半乳糖苷酶显著表达,并可见较多肝细胞表达β半乳糖苷酶. 结论 裸露DNA经胆道逆行导入正常及急性损害肝脏局部能获得较好表达,且无明显加重肝脏损害,该项方法为肝脏基因治疗的实验研究提供了良好的技术平台.     

氢质子波谱成像对热缺血再灌注损伤大鼠移植肝细胞再生能力的评价作用

目的 探讨磁共振氢质子波谱(1H-MRS)评价大鼠原位肝移植(OLT)热缺血模型肝细胞再生能力的意义,以及热缺血对于移植肝再生能力的影响. 方法 以实验组热缺血10min的大鼠肝移植模型和对照组无热缺血大鼠肝移植模型各30只为研究对象,移植术后分6个时间点(6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、30 d)对每只大鼠行肝脏常规T1WI、T2WI成像及氢质子波谱扫描.扫描后取肝脏,测定肝细胞的细胞增殖核抗原(PCNA)表达,同时检测肝酶代谢水平. 结果 术后5个时间点实验组的肝细胞PCNA阳性率、胆碱峰与水峰的峰高比值均高于对照组,实验组和对照组胆碱峰/水峰峰高比值均与相应PCNA的阳性率呈显著正相关(r实验=0.819,P＜0.01;r对照=0.543,P＜0.01).实验组和对照组的血清ALT、AST术后明显升高,尤以术后6 h～3 d最为显著,实验组的ALT、AST明显高于对照组. 结论 热缺血再灌注损伤对于移植后肝细胞的再生能力有明显的影响,1H-MRS的胆碱峰可以无创伤地评价移植肝的肝细胞再生能力.     

极限门静脉压力分支结扎对肝脏再生和基质金属蛋白酶及其组织抑制因子表达的影响

目的 探讨极限门静脉压力分支结扎对大鼠肝脏基质金属蛋白酶(MMP)及其组织抑制因子(TIMP)表达的影响. 方法 Sprague-Dawley雄性大鼠96只,随机分成假手术对照组和门静脉结扎实验组.观察术后0.5、1、3、5、7、14、21 d和28 d保留侧肝脏和肝脏总质量变化,光学显微镜下观察保留侧肝细胞的形态变化,用免疫组织化学方法检测保留侧肝细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)及MMP2、MMP9和TIMP2的表达.用SPSS11.5统计软件根据不同数据资料进行t检验或Pearson相关分析进行统计学分析. 结果 (1)90%极限门静脉分支结扎后,95.8%的大鼠存活良好.结扎侧肝叶呈进行性萎缩、变小,保留侧肝叶占总肝质量的比例在1 d内增加较缓慢,而1～5 d时,保留侧肝叶所占比例则增加速度明显加快,5 d以后保留侧肝叶所占比例增加变慢,于7 d达"平台期";(2)术后PCNA阳性细胞计数与假手术对照组比较,门静脉结扎实验组术后0.5～3 d明显增多,0.5、1、3 d组PCNA阳性率分别为13.86%±4.73%、17.45%±4.38%、21.33%±5.59%对比7.33%±2.63%、9.42%±3.98%、8.13%±2.37%,P值均＜0.01,第5天达高峰(25.70%±6.80%对比6.37%±3.38%),第7天有所减少,但仍高于对照组(P值均＜0.01),以后逐渐恢复正常;(3)保留侧肝叶的MMP2、MMP9和TIMP2蛋白的表达均在术后1 d开始明显增加,至术后7 d达高峰;此后逐渐恢复至术前水平(P＞0.05),仅见少量肝细胞胞质表达;(4)大鼠肝脏MMP2的表达在术后0.5、1、5、7、14 d组与肝组织PCNA表达均呈正相关关系,MMP9的表达在术后0.5、1、7、21 d组与肝细胞PCNA指数呈正相关关系,大鼠肝脏TIMP2的表达在术后1、7、14、21 d组与肝细胞PCNA指数呈正相关关系. 结论 90%极限门静脉分支结扎术后保留侧肝叶的MMP2、MMP9和TIMP2蛋白的表达均在术后1 d开始增加,至术后7d达高峰;此后逐渐恢复至术前水平;术后PCNA指数与保留侧肝叶的MMP2、MMP9和TIMP2蛋白的表达明显相关,MMP2、MMP9和TIMP2蛋白在肝再生的过程中发挥重要作用.     

比较不同方法肝脏靶向性导入抗TGF-β_1 siRNA对肝细胞TGF-β/Smad信号传导通路的影响

目的比较抗TGF-β1 siRNA靶向性进入肝细胞的4种转染方式在抗肝损伤与纤维化及对TGF-β/Smad信号传导通路影响中的效果差异,并探讨各自的优劣。方法已启动肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的50只模型鼠,随机分为模型对照组、尾静脉直接注射组、脂质体包裹组、流体动力学法组和肝动脉插管组,每组10只;将构建的TGF-β1 siRNA质粒分别通过尾静脉直接注射、脂质体包裹、流体动力学法、肝动脉插管等方式导入肝脏靶细胞;分别检测血清指标ALT、AST、HA;取肝组织,HE染色病理检测;RT-PCR技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1和Smad3 mRNA表达;免疫组化技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β和Smad3蛋白表达。结果抗TGF-β1siRNA质粒经过以上4种导入方法转染入靶细胞,均能有效地阻断大鼠肝组织中的TGF-β/Smad信号传导通路的传导（P〈0.05）;4种导入方法比较,肝动脉插管组与脂质体包裹组效果相当（P〉0.05）,优于尾静脉直接注射组及流体动力学法组（P〈0.05）,尾静脉直接注射组效果最差（P〈0.05）。结论抗TGF-β1siRNA质粒经肝动脉插管途径转染,是一种安全、高效的外源基因肝脏靶向导入转染方法。     

胰岛素联合肝细胞生长因子对肝切除术后肝再生的促进作用

目的观察经门静脉联合灌注胰岛素和肝细胞生长因子是否比单一用药显著促进肝切除术后肝再生.方法将实验用新西兰兔随机分为胰岛素(insulin,INS)治疗组、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)治疗组、联合用药组(INS+HGF)、对照组,行肝脏部分切除、门静脉置管,测定残肝体积,术后分别经门静脉置管微泵胰岛素、肝细胞生长因子、胰岛素和肝细胞生长因子、生理盐水,治疗结束时处死动物,测定肝脏体积,计算肝脏再生速度.术后监测肝功能、血清肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factora,TNF-a)、白介素-6(interleukin-6,IL-6).结果联合治疗组较对照组及胰岛素组、肝细胞生长因子组肝功能恢复快(P0.01),肝细胞生长因子组和胰岛素组较对照组肝功能恢复快(P0.05).术后残肝再生速度,胰岛素组和肝细胞生长因子组均较对照组快(P0.05),联合用药组较对照组和单一用药组显著增快(P0.01).实验组TNF-a、IL-6均较对照组升高,联合用药组较对照组和单一用药组统计学比较有显著性差异.结论经门静脉联合灌注胰岛素和肝细胞生长因子能显著促进肝切除术后肝再生.     

内质网应激在四氯化碳致大鼠急性肝损伤中的作用探讨

目的研究内质网应激在四氯化碳诱导的大鼠急性肝损伤中的变化规律和作用机制。方法采用四氯化碳制备大鼠急性肝损伤模型，动态测定大鼠肝脏GRP78蛋白和caspase 12酶原表达情况，测定大鼠血清ALT、AST水平、肝组织SOD活性、MDA浓度和caspase 3活性变化；采用HE染色和TUNEL法观察肝组织病理形态学和肝细胞凋亡变化。结果四氯化碳染毒后大鼠肝脏GRP78蛋白表达显著增加，caspase 12酶原表达相应减少，呈一定时间依赖方式。大鼠染毒后出现血清ALT、AST水平以及组织MDA含量显著升高，SOD活性明显下降，与对照组有显著性差异（P〈0．01）；染毒后大鼠肝组织caspase 3活性亦显著升高，病理学及TUNEL法检测结果均显示肝脏有严重损伤，大量肝细胞发生凋亡。结论四氯化碳诱导大鼠肝损伤时GRP78和caspase 12的表达变化表明发生了内质网应激反应，其变化趋势和大鼠肝细胞凋亡、病理损伤一致，这一结果提示内质网应激介导的肝细胞凋亡参与了大鼠肝损伤。     

苦参碱对大鼠供肝冷保存再灌注损伤中肝细胞凋亡及调控基因表达的影响

目的:探讨苦参碱对大鼠原位肝移植供肝冷保存再灌注损伤中肝细胞凋亡及调控基因表达的影响.方法:应用延长保存的大鼠原位肝移植模型,大鼠84只随机分为对照组、低剂量苦参碱治疗组(40mg/kg)、高剂量苦参碱治疗组(80mg/kg)和假手术组,将供肝在4℃林格液中保存5h后植入受体,各组大鼠于再灌注后4和24h后取样.采用TUNEL法分别检测移植术后肝细胞凋亡,流式细胞仪检测凋亡相关基因Bcl-2,FasL蛋白的表达,光镜下观察移植肝脏病理形态学的改变.结果:与对照组比较,苦参碱低、高剂量治疗组术后肝脏细胞凋亡指数显著降低(6.07±1.68,6.17±0.83vs14.87±2.10,P<0.01),肝组织Bcl-2表达增加(59.32±14.09,58.90±16.70vs17.00±8.01,P<0.01),但FasL表达量无显著差异(P>0.05),肝细胞凋亡指数、Bcl-2和FasL表达在苦参碱低、高剂量组间也无显著差异.对照组肝细胞损伤的病理表现相当严重,而治疗组的病理表现显著改善.结论:苦参碱通过促进抑制凋亡基因Bcl-2的表达来抑制冷保存再灌注导致的肝细胞凋亡.     

参附注射液抗肝脏缺血再灌注损伤作用的研究

目的研究参附注射液在抗大鼠肝脏缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI）中的保护作用。方法将30只大鼠随机分为实验组和对照组,建立常温下部分肝脏缺血再灌注动物模型。动态观察血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和内皮素-1（ET-1）的水平。术后取肝组织作光镜和电镜观察。结果实验组血清AST、MDA、TNF-α、ET水平均显著低于对照组水平（P〈0.05）,SOD水平高于对照组（P〈0.05）。与对照组比较,实验组大鼠肝细胞和肝窦内皮细胞变性和坏死程度较轻。结论参附注射液具有抗肝脏缺血再灌注损伤的保护作用,主要通过抑制氧自由基产生。     

State of knowledge of helminth fauna of freshwater fishes of Poland

A total 89 fish and lamprey species has been recorded from Polish freshwater habitats. Twenty-seven of them (30.3%) have not been surveyed for parasitic helminthes. Some of the latter fishes are either rare or not easily accessible. Other live only in specific habitats in scattered localities. An important obstacle for studying parasite faunas of some fishes may be their status on an endangered species. Among the non-surveyed fishes, are those which have been relatively recently introduced to Poland or migrated there on their own. The present paper attempts to review all hitherto not studied helminthologically fish species, their habitats, localities and current protection status.