自噬基因beclin1对子宫颈癌HeLa细胞生长的作用及其机制

目的 研究自噬基因beclin 1对宫颈癌细胞株HeLa细胞生长的抑制作用,并探讨其可能的机制.方法 实验分为5组:(1)pcDNA3.1(+)-beclin 1组:转染重组载体pcDNA3.1(+)-beclin 1质粒(过度表达beclin 1基因)的HeLa细胞;(2)pSUPER-beclin 1组:转染重组载体pSUPER-beclin 1质粒的HeLa细胞(抑制Beclin 1基因表达);(3)pcDNA3.1(+)组:转染空载体pcDNA3.1(+)质粒的HeLa细胞;(4)pSUPER组:转染空载体pSUPER质粒的HeLa细胞;(5)空白对照组:未转染质粒的HeLa细胞.采用逆转录(RT)PCR技术和蛋白印迹法检测各组细胞中beclin 1 mRNA和蛋白的表达以及凋亡因子--半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)mRNA及蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的生长情况;流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率;电镜观察和流式细胞仪检测各组细胞的自噬情况.将各组细胞分别接种于裸鼠皮下,观察各组裸鼠体内的成瘤性及肿瘤生长情况.结果 (1)各组细胞中beclin 1、caspase-9 mRNA和蛋白的表达:pcDNA3.1(+)-beclin 1组beclin 1和caspase-9 mRNA的表达水平分别为994.72±468.76和12.88±2.71,pSUPER-beclin 1组分别为0.18±0.63和0.11±0.08,pcDNA3.1(+)组分别为0.57±0.12和4.28±3.25,pSUPER组分别为0.67±0.29和2.77±1.27,空白对照组分别为0.74±0.25和3.67±3.78,pcDNA3.1(+)-beclin 1组均明显高于pcDNA3.1(+)组、pSUPER组和空白对照组,pSUPER-beclin 1组均明显低于pcDNA3.1(+)组、pSUPER组和空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).各组细胞中beclin 1和caspase-9蛋白的表达情况与mRNA相似.(2)各组细胞的生长情况:pcDNA3.1(+)-beclin 1组细胞的生长明显慢于空白对照组及pcDNA3.1(+)组,而pSUPER-beclin 1组细胞的生长明显快于空白对照组及pSUPER组,差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)各组细胞的凋亡率:pcDNA3.1(+)-beclin 1组为(28.2±2.3)%,pcDNA3.1(+)组为(14.6±4.6)%,pSUPER-beclin 1组为(5.7±2.0)%,pSUPER组为(16.2±3.1)%,空白对照组为(11.2±3.0)%,pcDNA3.1(+)-beclin 1组和pSUPER-beclin 1组分别与另外3组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(4)各组细胞的自噬情况:pcDNA3.1(+)-beclin 1组细胞内可见自噬体的形成,而其余各组自噬体形成不明显.pcDNA3.1(+)-beclin 1组自噬率为(10.3±1.5)%,pcDNA3.1(+)组为(3.6±0.8)%,pSUPER-beclin 1组为(1.2±0.3)%,pSUPER组为(3.2±1.2)%,空白对照组为(2.2±1.1)%,pcDNA3.1(+)-beclin 1组和pSUPER-beclin 1组分别与另外3组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(5)各组裸鼠的成瘤情况:pcDNA3.1(+)-beclin 1组裸鼠成瘤时间长于空白对照组、pcDNA3.1(+)组和pSUPER组.pSUPER-beclin 1组裸鼠肿瘤体积第7天开始明显大于空白对照组、pcDNA3.1(+)组和pSUPER组(P＜0.05);pcDNA3.1(+)-beclin 1组第21天开始明显小于空白对照组、pcDNA3.1(+)组和pSUPER组(P＜0.05).接种第28天,pSUPER-beclin 1组肿瘤质量为(0.52±0.08)g,明显高于空白对照组的(0.37±0.12)g和pSUPER组的(0.34±0.24)g(P＜0.05);pcDNA3.1(+)-beclin 1组肿瘤质量为(0.18±0.12)g,明显低于空白对照组和pcDNA3.1(+)组的(0.34±0.18)g(P＜0.05).结论 自噬基因beclin 1可以抑制宫颈癌HeLa细胞体内、外的生长,这种作用不仅与自噬调控通路有关,而且可能通过调控caspse-9基因的表达参与内源性细胞凋亡通路的调节,为宫颈癌基因治疗提供了新途径.

Abstract：

Objective To investigate the inhibitory effects and the mechanism of autophagy gene beclin 1 on cervical cancer HeLa cells. Methods The eukaryotic expression vector and short hairpin RNA (shRNA) expression vector of beclin 1 were transfected via lipofectamine into HeLa cells. Experimental cells were classified into 5 groups: pcDNA3. 1 ( + )-beclin 1 group, pSUPER-beclin 1 group, pcDNA3.1 ( + )group, pSUPER group and HeLa group. Real time-PCR and western blot were used for detecting expression of mRNA and protein of beclin 1 and caspase-9 in transfected cells. Flow cytometry was employed to observe the effect of transfection on the apoptosis, and autophagy of HeLa, while proliferation was analyzed by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The ultrastructural analysis of autophagic vacuoles was under the electron microscope. Five groups cells were seeded subcutaneously on nude mice. The carcinogenic and growth activities of cancer cells in vivo were observed, and immunohistochemistry was used to detect the protein expression of beclin 1 in tumor tissue. Results ( 1 ) The mRNA expression of beclin 1 and caspase-9: pcDNA3. 1 ( + )-beclin 1 group were 994.72 ±468.76 and 12. 88 ±2. 71, pSUPER-beclin 1 group were 0. 18 ± 0. 63 and 0. 11 ± 0. 08, pcDNA3. 1 ( + ) group were 0. 57 ± 0. 12 and 4. 28 ± 3. 25,pSUPER group were 0. 67 ± 0. 29 and 2. 77 ± 1.27, and HeLa group were 0. 74 ± 0. 25 and 3.67 ± 3.78,respectively. The eukaryotic expression vector pcDNA3. 1 ( + ) -beclin 1 significantly improved the expression of mRNA of beclin 1 and caspase-9 in HeLa cells( P ＜0. 05 ), and the shRNA expression vector inhibited the expression of mRNA of beclin 1 and caspase-9 ( P ＜ 0.05 ). (2) The cell proliferations: pcDNA3.1 ( + ) -beclin 1 vector significantly inhibited the growth of HeLa cells, while pSUPER-beclin 1 vector significantly improved the growth of HeLa cells(P ＜0. 05). (3) The rate of apoptosis: pcDNA3.1 ( + )-beclin 1 group was (28.2 ±2.3)%, pcDNA3. 1( + ) group was(14.6 ±4.6)%,pSUPER-beclin 1 group was(5.7 ±2. 0) %, pSUPER group was( 16. 2 ± 3.1 ) %, and HeLa group was( 11.2 ± 3. 0) %. The pcDNA3. 1 ( + ) -beclin 1 vector significantly increased the apoptosis rate, while the pSUPER-beclin 1 vector significantly decreased the apoptosis rate(P ＜0. 05 ). (4)The activity of autophagy: more autophagy cells were identified in pcDNA3.1( + )-beclin 1 group; the rate of autophagy of five group were( 10. 3 ± 1.5)% in pcDNA3. 1 ( + ) -beclin 1 group, ( 3.6 ± 0. 8 ) % in pcDNA3. 1 ( + ) group, ( 1.2 ± 0. 3 ) % in pSUPER-beclin 1 group, (3.2 ± 1.2)% in pSUPER group and (2.2 ± 1. 1)% in HeLa group, there was statistical significances between test groups and control groups( P ＜ . 05 ). (5)Carcinogenic activity of HeLa cells in nude mice: the duration of tumorigenesis was the longest in pcDNA3.1 ( + )-beclin 1 group and the shortest in pSUPER-beclin 1 group among all groups. The tumor size began to grow larger from 7th day after injection in pSUPER-beclin 1 group than in control groups( P ＜ 0. 05 ). The tumor size was smaller from 21st day after injection in pcDNA3.1( + )-beclin 1 group than in control groups(P ＜0. 05). From 28th day after injection,the tumor weigh was (0. 52 ± 0. 08 )g in pSUPER-beclin 1 group, apparently more than HeLa group (0. 37 ±0. 12) g and pSUPER group (0. 34 ± 0. 24 ) g ( P ＜ 0. 05 ). While in pcDNA3. 1 ( + )-beclin 1 group the tumor weighed (0. 18 ±0. 12) g, which was lower than HeLa group and pcDNA3. 1 ( + ) group (0. 34 ± 0. 18 ) g ( P ＜ 0. 05 ) . Conclusions Autophagy gene beclin 1 overexpression can inhibit proliferation and growth of HeLa cells in vitro and in vivo. Beclin 1 not noly participate in the regulation of autophagy signaling, but also play an important role in the regulation of endogenous apoptosis signaling through caspase-9. So it might be one of the new strategies for gene therapy of cervical carcinoma.     

子宫平滑肌组织中RhoA及Rho激酶的表达与分娩发动的关系

Objective To investigate the role of RhoA and Rho kinase system in the onset of labor. Methods Forty term pregnant women, who delivered through cesarean section at the Xiangya Second Hospital of Central South University from February 2007 to November 2007, were selected and divided into 2 groups: 20 in labor group and 20 in non-labor group. Another 20 non-pregnant women undergoing hysterectomy due to cervical intraepithelial neoplasia were chosen as the control. Real-time fluorescence quantitative RT-PCR and western blot were applied to detect the expression RhoA and ROCKⅠ mRNA and protein in uterine smooth muscle tissue and the correlation between the mRNA and protein expression of RhoA and ROCKⅠ were analyzed. Results (1) The mRNA expressions of both RhoA and ROCKⅠ were detected in all groups, and higher levels were found in the labor group than in the non-labor group and the control [RhoA mRNA: (3.51±0.56)×10-3 vs. (2.75±0.52)×10-3 and (2.11±0.54)×10-3; ROCKⅠ mRNA: (4.07±0.66)×10-3 vs. (2.71±0.52)×10-3 and(2.01±0.23)×10-3, P<0.01]. (2) RhoA and ROCKⅠ proteins were also identified in all three groups, and the expressions in the labor and non-labor group were higher than those of the control (RhoA protein: 0.72±0.23 and 0.64±0.17 vs. 0.46±0.15; ROCKⅠ protein: 0.56±0.14 and 0.42±0.16 vs. 0.29±0.08, P<0.01). (3) The expression of RhoA mRNA and ROCKⅠ mRNA were positively correlated in each of the three groups (r=0.73,P<0.01), and the same was found in the expression of RhoA protein and ROCKⅠ protein (r=0.37,P<0.01). Conclusion The increased expression of RhoA and Rho kinase may play an important role in the initiation of labor.     

早产大鼠坏死性小肠结肠炎三种常用模型的建立及评价

目的 用人工喂养+缺氧+冷刺激、缺氧-复氧及腹腔注射内毒素(lipopolysaccharides,LPS)等国内外常用方法建立早产大鼠坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)模型,并进行比较和评价. 方法 A组早产大鼠(n=10)采用代乳品人工喂养,并给予100%氮气缺氧90 s,4℃冷刺激10 min,每天2次,连续2 d;B组早产大鼠(n=10)给予100%氮气5 min,100%氧气5 min,每天2次、连续3 d;C组早产大鼠(n=10)给予腹腔注射LPS 5 mg/kg;D、E、F组为相应正常对照组,每组10只.HE染色后光镜下观察肠道、肝、肺及肾组织病理改变,并对肠组织损伤情况进行病理评分,评分≥2分确定为NEC. 结果 A、B、C组均出现不同程度的活动减少,腹胀腹泻,肠道扩张充血.A至F组的肠组织损伤病理评分结果分别为(3.13±0.64)分、(1.40±0.52)分、(2.00±0.42)分、(0.30±0.48)分、(0.30±0.48)分和(0.40±0.52)分,模型组与相应对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);模型组内B组与A组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);C组与A组比较,差异亦有统计学意义(P＜0.05).A、B、C组的NEC发生率分别为6/8、20%(5/10)和4/8,对照组的NEC发生率均为0.C组的肝脏、肾脏和肺脏损伤较A、B组严重,而对照组各重要脏器均未见异常. 结论与缺氧-复氧和腹腔注射LPS等单因素的建模方法相比,综合运用人工喂养+缺氧+冷刺激更接近新生儿NEC的病因,且其发生率高,重复性好,特异性强,是一种较为理想的NEC建模方法.     

血浆D-乳酸水平与新生儿坏死性小肠结肠炎预后的关系

目的 探讨血浆D-乳酸水平与新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)预后的关系.方法 采用病例对照研究方法.选择2007年1月至2010年10月入住本院新生儿重症监护病房诊断为NECⅡ、Ⅲ期的早产儿104例(NEC组)；同期因其他疾病入院的早产非NEC患儿104例(对照组),与NEC组匹配纠正胎龄、性别和出生体重,按1∶1比例进行配对.NEC组患儿于NEC确诊后24 h内,对照组患儿于相应日龄取血,采用酶联免疫吸附试验检测血浆D-乳酸水平,采用受试者工作特性曲线确定D-乳酸阳性标准.根据此标准将NEC组分为D-乳酸升高组与D-乳酸正常组,x2检验比较组间并发症及病死率.根据患儿病情转归将NEC组分为死亡组和存活组,t检验比较不同组间D-乳酸水平差异.结果 NEC组104例患儿中,NECⅡ期63例(60.6％),NECⅢ期41例(39.4％)；存活88例(84.6％),死亡16例(15.4％).NECⅢ期组D-乳酸水平最高,为(35.4±29.1)μg/ml,其次是NECⅡ期组,为(29.5±16.2)μg/ml,对照组最低[(3.7±18.4)μg/ml],差异均有统计学意义(F=5.97,P＜0.05).受试者工作特性曲线分析显示,D-乳酸水平≥6 μg/ml为阳性标准,按此标准,NEC组血浆D-乳酸水平升高者87例(83.7％,87/104).D-乳酸水平升高者新生儿危重病例评分明显低于正常者[(80.9±22.6)分与(95.8±20.5)分,t=2.417,P＜0.05],而合并新生儿败血症的比例[48.3％(42/87)与5.9％(1/17),x2=11.538,P＜0.05]及病死率[27.6％(24/87)与5.9％(1/17),x2=7.146,P＜0.05]较高.NEC组死亡患儿与存活患儿D-乳酸水平[(43.2±13.5) μg/ml与(21.9±22.9) μg/ml,t=4.572,P＜0.05]、新生儿危重病例评分[(82.4±29.1)分与(90.6±21.3)分,t=2.409,P＜0.05]以及合并败血症的比例[68.8％(11/16)与38.6％ (34/88),x2=3.445,P＜0.05]差异均有统计学意义.结论 血浆D-乳酸水平与NEC预后相关,能较好地反映NEC患儿的病情及预后.     

中药补肾调冲方对卵巢早衰大鼠激素水平和卵巢Bcl-2/Bax表达的影响

目的:探讨补肾调冲方对雷公藤多苷片(GTW)致卵巢早衰(POF)的治疗作用。方法:雌性SD大鼠42只,随机分为正常组、模型组、结合雌激素片(雌激素组)和补肾调冲方治疗高、中、低剂量组。运用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中雌二醇(E_2)、卵泡刺激素(FSH)、抑制素B(INHB)水平。Western blotting法和RT-PCR法检测卵巢组织中Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的表达水平。结果:正常组和各给药组E_2的含量均高于模型组(P0.01)。正常组和各给药组FSH含量均低于模型组(P0.01);正常组和各给药组INHB含量均高于模型组(P0.01)。低剂量组INHB的含量与雌激素组比较,差异有统计学意义(P0.05)。模型组大鼠卵巢中Bcl-2蛋白和mRNA水平的表达显著低于正常组(P0.05);各给药组Bcl-2蛋白和mRNA水平的表达显著高于模型组(P0.01)。模型组大鼠卵巢中Bax蛋白和m RNA水平的表达显著高于正常组(P0.05);各给药组Bax蛋白和mRNA水平的表达显著低于模型组(P0.01)。低剂量组Bax蛋白的表达与雌激素组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论:中药补肾调冲方对卵巢性激素水平具有调节作用,能提高卵巢对性激素的敏感性,促进卵巢排卵;通过上调Bcl-2和下调Bax的表达,抑制卵巢中颗粒细胞的过度凋亡,减少卵泡闭锁,促进卵巢功能的恢复。     

17α-羟基孕酮己酸酯和醋酸甲羟孕酮预防孕鼠感染性早产的机制

目的 通过研究17α-羟基孕酮己酸酯(17α-hydroxyprogesterone caproate,17P)和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate,MPA)对早产小鼠子宫肌层及胎盘组织环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响,探讨孕激素预防感染性早产的作用机制.方法 选择清洁级雌性CD-1小鼠30只,于妊娠第15天,随机分为对照组、内毒素脂多糖( lipopolysaccharides,LPS)组、17P 1 mg+LPS组、17P 2 mg+LPS组、MPA 1 mg+ LPS组、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)+ LPS组,每组5只.治疗组均于皮下注射相应剂量的孕激素1h后腹腔注射LPS,6h后取小鼠子宫肌层及胎盘组织,用实时荧光定量聚合酶链反应技术和免疫组织化学方法检测子宫肌层及胎盘组织COX-2和TNF-α mRNA及蛋白的表达.采用ANOVA进行统计学分析,两两比较用LSD法.结果 1.各组小鼠子宫肌层及胎盘组织中COX-2 mRNA和TNF-α mRNA的相对表达量的比较:(1)各给药组孕鼠子宫肌层及胎盘组织COX-2mRNA和TNF-α mRNA表达均显著高于对照组(P＜0.05).(2)17P 1 mg+LPS组、17P 2 mg+LPS组和MPA 1 mg+LPS组小鼠子宫肌层COX-2 mRNA表达分别为11.410±3.931、8.352±3.209和11.920±2.905,均显著低于LPS组(20.540±4.147)和DMSO组+LPS组(18.620±4.156) (P＜0.05),而TNF-α mRNA也低于LPS组和DMSO组+LPS组,但差异无统计学意义(P＞0.05).(3)17P 1 mg+LPS组、17P 2 mg+LPS组、MPA 1 mg+LPS组胎盘组织COX-2 mRNA表达分别为10.864±3.777、7.084±1.667和11.830±3.652,均显著低于LPS组(18.920±4.106)和DMSO组+LPS组(23.820±7.554) (P＜0.05).(4)17P 1 mg+LPS组、17P 2 mg+LPS组、MPA1 mg+ LPS组胎盘组织TNF-α mRNA表达分别为14.340±1.618、11.488±2.910和13.040±2.982,均显著低于LPS组(24.240±7.059)和DMSO组+LPS组(23.040±5.896)(P＜0.05).2.各组小鼠胎盘组织COX-2和TNF-α蛋白表达的比较:(1)各给药组胎盘组织中COX-2蛋白的表达和TNF-α蛋白的表达明显高于对照组(P＜0.05).(2)17P 1 mg+LPS组、17P 2 mg+LPS组和MPA1 mg+ LPS组COX-2蛋白的表达分别为14360.92±1766.01、13340.18±965.35、12870.81±1521.97,明显低于LPS组(16426.64±1823.87)和DMSO组+LPS组(16761.23±2388.17)(P＜0.05);但3个治疗组之间差异无统计学意义(P＞0.05).(3) 17P 1 mg+LPS组、17P 2 mg+LPS组、MPA 1 mg+ LPS组TNF-α蛋白的表达分别为22 750.96±4656.68、22 766.24±3500.34和20 770.01±3318.48,显著低于LPS组(26204.49±5090.34)和DMSO组+LPS组(27 346.18±3269.30)(P＜0.05),而3组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 17P和MPA对感染性早产小鼠子宫和胎盘组织COX-2及胎盘中TNF-α的表达有抑制作用,可能是其预防早产的机制之一.     

子宫主韧带弹性蛋白、赖氨酰氧化酶和弹性蛋白酶抑制剂基因表达与盆腔器官脱垂发生的关系

目的 探讨子宫主韧带中弹性蛋白、赖氨酰氧化酶和弹性蛋白酶抑制剂基因表达变化与盆腔器官脱垂(POP)发生、发展的关系.方法 选择因子宫脱垂而行子宫全切除术的患者60例(POP组),其中绝经前27例,绝经后33例;选择同期因妇科良性疾病、无压力性尿失禁或POP而行子宫全切除术的患者60例为对照组,其中绝经前42例,绝经后18例.于手术中取子宫主韧带,采用RT-PCR技术检测弹性蛋白、赖氨酰氧化酶和弹性蛋白酶抑制剂mRNA的表达,免疫组化蛋白印迹法检测3种基因的蛋白表达.结果 (1)弹性蛋白mRNA及蛋白表达:POP组患者绝经前、后子宫主韧带弹性蛋白mRNA的表达分别为0.42±0.22、0.26±0.20,子宫主韧带弹性蛋白的蛋白表达分别为0.44±0.32、0.20±0.19;对照组患者绝经前、后子宫主韧带弹性蛋白mRNA的表达分别为0.79±0.30、0.63±0.23,子宫主韧带弹性蛋白的蛋白表达分别为0.89±0.27、0.78±0.25,两组绝经前及绝经后患者子宫主韧带弹性蛋白mRNA及蛋白表达分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)赖氨酰氧化酶mRNA及蛋白表达:POP组患者绝经前、后赖氨酰氧化酶mRI~A的表达分别为0.37±0.18、0.20±0.14,赖氨酰氧化酶的蛋白表达分别为0.45±0.27、0.26±0.21,对照组患者绝经前、后子宫主韧带赖氨酰氧化酶mRNA表达分别为0.65±0.22、0.53±0.20,子宫主韧带赖氨酰氧化酶的蛋白表达分别为0.85±0.39、0.69±0.31,两组绝经前及绝经后患者子宫主韧带赖氨酰氧化酶mRNA及蛋白表达分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).POP组患者绝经后子宫主韧带弹性蛋白、赖氨酰氧化酶mRNA及蛋白表达均明显低于绝经前患者(P＜0.05).(3)弹性蛋白酶抑制剂mRNA及蛋白表达:POP组患者绝经前、后子宫主韧带弹性蛋白酶抑制剂mRNA表达分别为1.33±0.35、1.47±0.37,子宫主韧带弹性蛋白酶抑制剂的蛋白表达分别为0.85±0.30、0.76±0.35,对照组患者绝经前、后子宫主韧带弹性蛋白酶抑制剂mRNA表达分别为0.62±0.25、0.55±0.24,子宫主韧带弹性蛋白酶抑制剂的蛋白表达分别为0.21±0.15、0.29±0.22,两组绝经前及绝经后患者子宫主韧带弹性蛋白酶抑制剂mRNA及蛋白表达分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);POP组患者绝经前、后弹性蛋白酶抑制剂mRNA及蛋白表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05).POP患者子宫主韧带弹性蛋白与赖氨酰氧化酶mRNA及蛋白表达量呈明显的直线正相关关系(r=0.9959、0.9708,P＜0.05),而弹性蛋白与弹性蛋白酶抑制剂mRNA及蛋白表达量无直线相关性(r=-0.0402、-0.0365,P＞0.05).结论 POP患者子宫主韧带弹性蛋白、赖氨酰氧化酶表达下调及弹性蛋白酶抑制剂表达上调,可能与POP发生有关.     

高氧致慢性肺疾病早产大鼠P16基因启动子区甲基化

目的 探讨高氧致慢性肺疾病早产大鼠肺组织p16基因的启动子甲基化状态.方法 将早产Wistar大鼠80只随机分为高氧组(吸入氧浓度0.90)和对照组(吸入氧浓度0.21),每组均为40只.分别采用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应技术和甲基化特异性聚合酶链反应技术检测肺组织p16基因的启动子甲基化状态.同时,应用逆转录-聚合酶链反应技术、Western印迹及免疫组织化学方法检测肺组织p16基因mRNA和蛋白的表达水平.结果 应用半巢式甲基化特异性聚合酶链反应技术和甲基化特异性聚合酶链反应技术,对照组中不同日龄早产大鼠均未发现有甲基化发生.半巢式甲基化特异性聚合酶链反应技术检测高氧组甲基化发生率为52.5%(21/40),高于甲基化特异性聚合酶链反应技术检测甲基化的发生率(42.5%,17/40),但差异无统计学意义.高氧组肺组织p16 mRNA表达水平在7、14、21 d时分别为1.73±0.40,1.29±0.19和0.95±0.25,均低于对照组(分别为2.11±0.37、1.60±0.27和1.72±0.34),t分别为2.19、2.95和10.43,P均＜0.05.高氧组肺组织p16蛋白表达水平在7、14、21 d时分别为88.1±8.7、65.7±4.5和50.4±4.9,也低于对照组(分别为95.0±4.1、83.5±13.6和86.7±11.9),t分别为2.27、3.95和13.40,P均＜0.05.甲基化大鼠肺组织p16 mRNA表达水平为1.06±0.61,蛋白表达水平为62.32±25.65,均低于非甲基化大鼠,分别为1.63±0.62和94.93±22.21,差异均有统计学意义(t=2.95,OR=0.86,P＜0.01;t-4.28,OR=0.85,P＜0.01).结论高氧可导致早产大鼠的肺组织p16基因启动子甲基化异常,且其甲基化的发生率随高氧暴露时间的延长而逐渐增加,高氧诱导的p16基因启动子高甲基化状态可能是p16 mRNA及蛋白的低水平表达的机制之一,但并非基因沉默.     

表皮生长因子及其受体在新生鼠肠损伤中的动态变化

目的 检测新生鼠肠损伤时回肠组织表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子α(transforming growth factor-α,TGF-α)及表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)的动态变化,探讨其在新生儿坏死性小肠结肠炎中的作用. 方法 1日龄新生Wistar大鼠随机分为实验组40只和对照组8只.实验组腹腔注射5 mg/kg内毒素(lipopolysaccharide,LPS),对照组注射同等剂量无菌生理盐水.实验组大鼠于注射LPS后1、3、6、12和24 h处死后分离胃肠道,观察回肠组织形态学改变,测定肠组织EGF、EGFR蛋白表达及EGFR mRNA和TGF-αmRNA的动态变化,并与对照组进行比较. 结果 实验组于注射LPS后1、3、6、12和24 h回肠组织损伤评分分别为(1.28±0.62)分,(1.75±0.74)分,(1.98±0.75)分,(2.85±0.41)分和(2.35±0.63)分,均明显高于对照组(0.12±0.17)分(P<0.01);EGF蛋白水平分别为(235.9±44.3)pg/mgprot,(231.8±30.0)pg/mg prot,(223.3±48.1)pg/mg prot,(211.7±47.0)pg/mg prot和(221.4±39.0)pg/mg prot,显著低于对照组[(287.7±42.6)pg/mg prot](P<0.05),EGF浓度与肠损伤程度呈负相关(r=-1.000,P<0.01);注射LPS后EGFR蛋白和mRNA表达增加,但与肠损伤程度无相关性(r=0.800,P>0.05);TGF-α mRNA在注射LPS后1 h和3 h明显上调. 结论 EGF水平降低可能在新生儿坏死性小肠结肠炎发生发展中起关键作用.     

miR-18a调节HTR-8细胞中雌激素受体α表达的研究

目的:研究微小RNA-18a(miR-18a)在人正常滋养细胞(HTR8)中对雌激素受体α(ERα)表达的调控作用。方法:miR-18a前体分子[miR-18a类似物(miR-18a mimics)、miR-18a空白载体、miR-18a抑制物(miR-18a inhibitor)]转染HTR-8细胞,分为实验组1、阴性对照组(NC组)、实验组2。RT-PCR检测转染后各组中miR-18a的表达情况;RT-PCR与Western-blot检测HTR-8细胞中ERα在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果:实验组1细胞中miR-18a的表达与NC组(0.407±0.019)相比明显增高(0.880±0.060),实验组2细胞中miR-18a的表达显著降低(0.160±0.014),差异有统计学意义(P0.05)。转染48小时后实验组1ERαmRNA的表达(0.249±0.003)与NC组(0.313±0.010)相比差异无统计学意义(P0.05);实验组2 ERαmRNA的表达水平明显增高(0.823±0.023),差异有统计学意义(P0.05)。实验组2 ERα蛋白表达水平(1.030±0.006)与NC组(0.960±0.008)相比有增高,实验组1 ERα蛋白表达水平明显降低(0.660±0.013),差异有统计学意义(P0.05)。结论:在人正常滋养细胞中,miR-18a可能在转录和翻译水平均对ERα具有调控作用。