正常细胞与镉转化细胞抑制消减cDNA文库构建

目的 构建正常人支气管上皮细胞(16HBE)与氯化镉诱导转化16HBE细胞间差异表达基因的消减cDNA文库.方法 以16HBE为驱动子,氯化镉诱导转化16HBE细胞为检测子,应用抑制性消减杂交(SSH)方法构建cDNA文库,经2次消减杂交和2次PCR后,将巢式PCR产物插入载体,随机挑选克隆进行鉴定.结果 得到纯度高及完整性好的总RNA和mRNA,并扩增出良好的双链cDNA,cDNA与接头的连接效率＞25％,最终使差异表达基因得到富集;经蓝白菌落筛选,获得1 200余个白色阳性克隆;随机挑选50个白色克隆进行PCR扩增,显示96％克隆均有100 ～ 600 bp的插入片段,这些片段可能是差异表达基因cDNA片段,提示用SSH法及T/A克隆技术有效构建了两细胞株间差异表达基因的消减cDNA文库.结论 成功创建正常16HBE细胞与镉转化16HBE细胞差异表达基因消减cDNA文库.     

反式二羟环氧苯并芘诱导人支气管上皮细胞翻译延长因子1α1基因的表达

目的探讨反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱导转化(16 HBE-T)与成瘤(16 HBE-C)人支气管上皮细胞(16 HBE)翻译延长因子1α1基因的表达变化.方法联合应用抑制性消减杂交、生物信息学分析以及半定量RT-PCR等方法,分别以16HBE-T和16HBE-C细胞cDNA为检测子,以正常16HBE细胞(16HBE-N)cDNA为驱动子,构建消减杂交文库,经2次杂交和2次PCR后,插入TA克隆载体克隆,经筛选、测序、序列分析后,设计特异引物,以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照,进行半定量PCR.结果有9条差异表达片段与Genbank的翻译延长因子1α1的不同片段相同,半定量PCR表明,翻译延长因子1α1在16 HBE-T和16 HBE-C细胞中的表达水平分别为16 HBE-N细胞的1.148倍和1.253倍,表明表达水平上调.结论翻译延长因子1α1可能与反式-BPDE的转化及成瘤有部分关系.     

反式二羟环氧苯并芘诱导人支气管上皮细胞翻译延长因子1αl基因的表达

目的 探讨反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱导转化(16 HBE-T）与成瘤(16HBE-C)人支气管上皮细胞(16HBE)翻译延长因子1αl基因的表达变化。方法 联合应用抑制性消减杂交、生物信息学分析以及半定量RT-PCR等方法，分别以16HBE-T和16HBE-C细胞cDNA为检测子，以正常16HBE细胞(16HBE-N)cDNA为驱动子，构建消减杂交文库，经2次杂交和2次PCR后，插入TA克隆载体克隆，经筛选、测序、序列分析后，设计特异引物，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照，进行半定量PCR。结果 有9条差异表达片段与Genbank的翻译延长因子1αl的不同片段相同，半定量PCR表明，翻译延长因子1αl在16HBE-T和16HBE-C细胞中的表达水平分别为16HBE-N细胞的1．148倍和1．253倍，表明表达水平上调。结论 翻译延长因子1αl可能与反式-BPDE的转化及成瘤有部分关系。     

二羟环氧苯并芘恶性转化细胞的microRNA表达谱

目的 检测二羟环氧苯并芘(BPDE)恶性转化细胞的microRNA(miRNA)表达谱,寻找恶性转化细胞与对照细胞差异表达的miRNA.方法 以溶剂二甲亚砜助溶的终浓度为2.0 μmol/L的BPDE培养液培养人支气管上皮细胞株16HBE,获得BPDE恶性转化的细胞模型为实验组,同时,以含二甲亚砜的培养液培养正常16HBE作为对照组.通过微阵列技术检测实验组与对照组327个人类miRNA,并选择差异表达明显的miR-10a和miR-320用反转录荧光定量PCR方法对微阵列结果加以验证.结果 获得2组细胞327个miRNA表达谱,发现差异表达miRNA 55个,其中46个表达上调,9个表达下调,并得到反转录荧光定量PCR的验证.结论 获得BPDE恶性转化细胞与正常16HBE细胞差异表达的miRNA,为进一步寻找BPDE恶性转化细胞特征性miRNA提供了研究基础.     

DNA氧化损伤修复相关基因hOGG1、MGMT在肺癌细胞中表达研究

目的研究DNA氧化损伤修复相关基因hOGG1和MGMT在正常人支气管上皮细胞(Human bronchial epithe-lial,16HBE)、反式7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(BPDE)转化细胞和裸鼠成瘤细胞中的表达。方法采用原位杂交技术检测hOGG1和MGMT在正常16HBE、反式BPDE转化细胞和裸鼠成瘤细胞中mRNA水平的表达。结果hOGG1、MGMT mRNA在反式BPDE转化细胞中阳性表达明显增强,而在裸鼠成瘤细胞中阳性表达相应减弱。结论DNA损伤修复相关基因hOGG1、MGMT mRNA在转化细胞模型中的表达水平明显增强。     

二羟环氧苯并芘诱发细胞恶变后基因和蛋白表达差异分析

目的研究苯并(a)芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的基因和蛋白表达的改变,探讨苯并(a)芘致癌的分子机制.方法应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片检测反式-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化的基因表达谱的变化;应用二维凝胶电泳技术和相应软件ImageMaster2D 3.10分析反式-BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化的蛋白质组变化,基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱结合数据库检索鉴定部分表达有差异的蛋白斑点.结果BPDE诱发的恶性转化细胞与阴性对照细胞比较,cDNA芯片结果显示差异表达基因有143条,其中52条基因在BPDE诱发的恶性转化细胞中表达增高,91条基因在恶性转化细胞中表达降低;二维凝胶电泳显示有72个蛋白斑点出现表达差异,其中44个蛋白斑点在BPDE诱发的恶性转化细胞中表达升高,28个蛋白斑点在恶性转化细胞中表达降低,对其中7个表达明显差异的蛋白斑点的鉴定显示,原癌基因v-erbb2同源3、锌指蛋白127、硫氧还原蛋白过氧化物酶2、KIAA0471蛋白在恶性转化细胞中高表达,而钙结合蛋白5、锌指蛋白Aiolos、Kelch样蛋白3在恶性转化细胞中低表达.结论反式-BPDE诱发16HBE恶性转化的基因表达谱和蛋白表达谱发生了显著的变化,这些表达改变的基因和蛋白可能参与了BPDE诱发细胞恶变的过程.     

硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究

目的用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍(NiS)与二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞(16HBE)基因的差异表达;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据.方法取16HBE分为NiS处理组,BPDE处理组和16HBE(对照组)三组同步培养,传代至第35代;提取三种细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro3.0软件分析荧光信号,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS转化的16HBE细胞与BPDE转化的16HBE细胞经分析比较,呈现差异表达的基因有22个,其中11个(50%)下调,另11个(50%)上调.结论 NiS与BPDE对16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因,细胞周期蛋白相关基因,细胞凋亡和应激反应基因相关基因,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因,DNA结合、转录和转录因子类基因,细胞受体相关基因,代谢相关基因,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达.认为基因芯片技术在筛选不同种类和性质的化合物转化细胞相关基因的改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,对化合物在细胞、分子毒作用和致癌机制的研究中意义重大.     

基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因

目的 采用基因芯片技术筛选二羟环氧苯并芘（BPDE）转化的人支气管上皮细胞（16HBE）相关基因，探讨该技术在分子毒理学研究中的应用。方法 将实验组（BPDE-16HBE）和对照组（16HBE）的mRNA逆转录合成cDNA掺入荧光分子为探针，杂交于H40S基因芯片。分析2组基因的差异表达。结果 在4096种人类基因中。BPDE转化的16HBE和正常16HBE问存在差异表达的基因有143条，其中高表达52条，低表达41条。结论 基因芯片技术在筛选BPDE转化的16HBE相关基因改变上，具有高通量、高敏感、快速等特点，在毒物的分子致癌机制研究中意义萤大．     

叶绿酸抑制细胞恶性转化的基因表达分析

目的 采用cDNA微阵列技术探索人支气管上皮细胞经叶绿酸抗转化处理后基因的差异表达。方法 人支气管上皮细胞株16HBE分别经二羟环氧苯并芘（BPDE）单独处理及叶绿酸与BPDE联合处理后，提取2种细胞的总RNA，逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针。探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交。以ScanArray4000扫描仪扫描芯片，以GenPixPro 3．0软件分析荧光信号，然后对差异表达的基因进行生物学信息分析。结果 叶绿酸与BPDE联合处理的细胞样与BPDE单独处理的细胞样比较呈显差异表达的基因有106个，其中67个(63．9％)下调，另39个(36．8％)上调。结论 叶绿酸的抗转化活性与应激反应基因，免疫相关基因，DNA合成和修复基因，代谢相关基因等多类基因的调节有关。     

cDNA代表性差异分析法筛选二羟环氧苯并芘致癌相关基因片段

目的 采用cDNA代表性差异分析法，分离二羟环氧苯并芘诱导恶性转化的细胞与对照组细胞之间的差异表达基因。方法 先从细胞中提取mRNA并合成双链cDNA，双链DNA以Sau3A I内切酶消化，连接接头并经PCR扩增。以BPDE诱导恶变细胞的cDNA为“检测子”、以对照组细胞cDNA为“驱赶子”进行消减杂交。结果 经3轮消减杂交后分离出5个cDNA片段，在琼脂糖凝胶上清晰显示210bp以下的5条条带，这些片段分别与总RNA作Northern印迹杂交证实它们均来自BPDE诱变的细胞。结论 cDNA代表性差异分析法是筛选化学致癌相关基因的有效、灵敏的方法。     

Ras基因家族在二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞中的表达研究

目的检测环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞Ras基因家族表达的影响。方法以正常人支气管上皮细胞为对照组,经BPDE恶性转化人支气管上皮细胞为实验组,分别利用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化。结果RT-PCR实验表明,BPDE恶性转化细胞H-Ras、K-Ras和N-Ras mRNA表达水平分别是正常细胞的2.237、1.254和3.616;Western blot实验显示,H-Ras、K-Ras和N-Ras蛋白表达量分别是正常细胞的1.273倍、1.547和1.600倍;免疫细胞化学实验表明,恶性转化细胞H、K和N-Ras蛋白表达明显强于正常细胞。结论BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达。     

热适应大鼠下丘脑基因差异表达的研究

目的：从基因表达角度研究热适应的分子机制，方法：制备热适应大鼠,发离热适应和常态大鼠各自的下丘脑组织，运用差异显示PCR技术筛选两种组织之间存在的差异表达基因片段，经斑点杂交鉴定后进行测序分析。结果：从热适应大鼠下丘脑组织中分离并鉴定了一条表达增高的基因片段，经测序分析确定其为长164bp的cDNA序列。结论：热适应大鼠下丘脑存在基因的表达增高，这种基因的表达水平的变化对于动物维护热适应能力可能具有重要作用。     

Global expression analysis in uterine cervical cancer: metabolic pathways and altered genes

High risk human papillomavirus (HPV) infection is considered to be the most important etiological factor of Cervical Uterine Cancer. In order to determine the global expression pattern and to identify possible molecular markers of cervical cancer, cDNA arrays with probe sets complementary to 8,000 human genes were used to examine the expression profiles among 5 cell lines derived from human cervical cancer, three HPV16(+) tumor samples and three normal cervical tissues HPV(-). The levels of expression of different cellular processes were identified. Hierarchical clustering was performed and the gene expression using RT-PCR was confirmed. Two genes were found to be consistently overexpressed in invasive cervical cancer biopsies; one of them, IL-6 was previously reported to be overexpressed in cervical cancer and one novel gene, MMP10, previously not known to be related to cervical cancer. Hierarchical clustering of the expression data revealed that samples with common HPV type infection grouped together, maybe this could mean that differences between HPV types could be indirectly determined by expression profiles.     

大鼠肝纤维化相关基因的差异表达分析

目的 寻找大鼠正常肝组织与纤维化肝组织间的差异表达基因，从基因水平阐明肝纤维化的发生机制。方法 采用mRNA差异显示法(mRNA differential display PCR，DD-PCR)，分别提取正常肝组织及纤维化肝组织的总RNA，进行逆转录PCR，PCR产物于6％变性聚丙烯酰胺凝胶(PAG)上电泳，放射自显影后寻找两者间的差异片段，回收差异片段进行2次PCR，对2次PCR产物采用反向RNA印迹法(Northern杂交)鉴定，以排除假阳性，将有差异的PCR产物克隆到质粒载体上，测序并进行同源性比较。结果 从凝胶中共选出16条差异带，12条获得再扩增。对其中4个差异带进行克隆和反向Northern杂交鉴定，获得2条有显著性差异的cDNA片段(N2、F1)。同源性分析显示，N2与小家鼠载脂蛋白aH5(apoa5)基因序列94％同源，未发现与F1片段相同的基因序列。结论 应用mRNA差异显示技术获得1条与肝纤维化相关的特异表达基因，对寻找肝纤维化的防治方法具有重要意义。     

镍转化人胚肺细胞中差异表达基因的克隆

目的 分析并克降镍转化细胞与对照组细胞中差异表达的基因,以期了解镍化合物诱发癌６变的分子机制。方法 应用差异显示ＰＣＲ方法分离对照和转化细胞间具有关 表达的基因,用ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ方法将差异基因片段克隆到质粒中,循环测序,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析。结果 从转化与对照细胞中分离并克隆到多个差异基因片段,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明其中２个为确定的差异表达基因（暂称之为ＭＳ５１５一ＩＣ８２）。测序后与     

山东省分离的霍乱弧菌毒力基因的研究

目的：了解山东省不同年代、不同地区收集的霍乱菌株携带的毒力基因情况、分布特点和变迁。方法：应用分子杂交、PCR技术对霍乱弧菌的CTX基因元件中的ctxA、zot基因，VPI毒力岛中的tcpA、tcpH、aldA、toxT、acfB基因，TLC因子中的cri、orf2—3基因，RTX基因簇中的rtxA、rtxC，以及toxR基因进行了检测。结果：用原位杂交检测，180株霍乱弧菌中有168株携带CTX遗传单元中的ctxA、zot、RS1基因，阳性率均为93．33％，表现出高度的一致性。用打点杂交检测不同时期的28株01群霍乱弧菌，所有被检菌都具有ToxR、RTX相关基因，在1980～1987年间分离的O1群霍乱弧菌流行株中，有92．86％携带编码TLC因子的基因，而1994～2000年间分离的流行株菌株中编码TLC因子的基因携带率仅有7．14％。Southern杂交结果显示，48株O1群霍乱弧菌可产生大小为9．4kb和6．5kb左右的两条ctxA杂交带，用zot基因探针进行杂交，11株O1群霍乱弧菌可产生与ctxA杂交带同样大小的条带。1株O139霍乱弧菌具有检测的所有毒力基因，但其ctxA（zot）杂交带与O1群霍乱弧菌有差异。结论：目前已知的霍乱弧菌毒力基因在山东省分离到的菌株中有广泛的分布，并且随时间的推移而发生变迁。