人肺癌相关基因HLCDG1在大肠杆菌中的表达

目的构建新克隆的肺癌抑瘤基因候选者HLCDG1的融合表达质粒pGEX-6P-1/HLCDG1并在原核表达系统中表达。方法采用多聚酶链式反应(PCR)扩增HLCDG1基因蛋白编码序列,将该片断插入原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL-21扩增。构建的融合表达质粒经酶切和测序鉴定后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色和W estern b lot鉴定实验结果。结果构建的融合表达质粒酶切和测序鉴定阅读框架正确,导入大肠杆菌中经IPTG诱导出一条分子量约为46kD的新蛋白带,主要存在于细菌沉淀中,W estern b lot鉴定其为GST-HLCDG1融合蛋白。结论HLCDG1基因编码的蛋白质能够在原核细胞中有效表达,为进一步研究该蛋白质的结构和功能奠定研究基础。     

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因的克隆和原核表达及纯化和抗原性分析

目的 克隆刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1(TgRACK1)基因,原核表达、纯化TgRACK1,并分析其抗原性.方法 制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgRACK1基因全长编码序列(GenBank登录号:AY547291)的开放阅读框设计引物并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pGEX-6p-1载体,重组质粒转化大肠埃希菌DH5α,阳性菌落经菌液PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定.将重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1转化至大肠埃希菌BL21(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗GST标签抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,免疫印迹(Western blotting)分析鉴定重组蛋白及其抗原性.重组融合蛋白经GST琼脂糖凝胶亲和纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度.结果 RT-PCR扩增产物约为970 bp,重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1构建成功.经IPTG诱导获得相对分子质量约63 kDa的可溶性重组蛋白.诱导表达的蛋白质为带GST标签的重组融合蛋白,且能被兔抗弓形虫血清识别.亲和纯化后获得纯度大于95％的重组TgRACK1蛋白质.结论 克隆得到弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白质,且该重组蛋白具有抗原性.     

麻疹病毒血凝素基因在大肠杆菌中的原核表达

目的构建麻疹病毒(measles virus)血凝素蛋白(H蛋白)基因的重组质粒,使其在大肠杆菌中大量表达H蛋白,为制备重组蛋白用于免疫检测奠定基础。方法提取麻疹病毒Leningrad-4株总RNA,RT-PCR法扩增其血凝素基因。克隆入pGEM-Teasy载体,双向测序,测序正确后将Ha基因用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后亚克隆至pET28a(+)载体,转化BL21(DE3)。培养后用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分离大肠杆菌蛋白,分析H基因表达情况。HisLink树脂纯化目的蛋白用于建立酶联免疫吸附反应,进行血清抗体水平检测。结果扩增了麻疹血凝素基因,与麻疹Leningrad-4株血凝素基因同源性达99.8%,构建了重组血凝素基因的原核表达质粒并进行了诱导表达和SDS-PAGE凝胶电泳,在66 kD处有表达的重组血凝素蛋白条带。结论成功构建了麻疹血凝素基因的表达载体并在大肠杆菌中进行了诱导表达,建立了利用重组血凝素蛋白检测IgG的ELISA方法。     

结核杆菌Edman株Ag85C基因的克隆表达与鉴定

目的克隆人结核杆菌Ag85C基因并在大肠杆菌中表达,研究其对结核病预防和治疗过程中的免疫保护作用。方法设计一对特异性引物,PCR扩增人结核杆菌Edman株Ag85C基因开放阅读框并定向克隆到原核表达载体pQE30,通过酶切、PCR和测序鉴定重组质粒,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果构建了pQE30-Ag85C重组质粒;在大肠杆菌中表达了一分子量约30kDa的重组蛋白。结论重组质粒pQE30-Ag85C构建成功并在大肠杆菌中高效表达,为Ag85C保护性抗原位点分析和新型疫苗的研制奠定了基础。     

Ⅰ型流感病毒核蛋白（NP）基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：以Ⅰ型流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA，并在大肠杆菌中进行表达与鉴定。方法：提取流感病毒RNA，以RT—PCR法扩增编码NP基因cDNA。将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体，然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET-28a的多克隆位点中，经酶切鉴定后，将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP。用pET-NP转化受体菌BL21，在大肠杆菌BL21中表达，用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间收集样品，用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。结果：经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达，并在终浓度为1mM的IPTG诱导下，6h其表达量达到高峰，经Western—blot分析证实表达的重组核蛋白具有免疫反应活性，大小约为60kd。结论：流感病毒核蛋白基因编码区基因获得成功克隆和构建，为流感病毒诊断试剂及单抗的研制工作提供了基础材料。     

H7N9病毒的M1基因序列分析及原核表达

目的克隆H7N9禽流感病毒M1并在原核细胞中表达,为进一步研究其生物学特性、免疫学功能及血清学检测奠定基础。方法用PCR方法从禽流感上海分离株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)cDNA扩增M1基因,并克隆到载体pMD18-T中。经测序证实后,用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切,亚克隆到原核表达载体pET28a,并转化E.coli BL21(DE3)菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定及western blot检验。结果 (1)经PCR、测序和酶切鉴定,成功克隆了禽流感H7N9 M1基因;(2)经IPTG诱导的重组质粒pET28a-M1表达出约为28 k Da的融合蛋白,与预期结果相符;(3)对H7N9型禽流感M1基因序列分析表明,与2013年暴发的H7N9型禽流感病毒M1基因核苷酸序列同源性在95.4%~100%,与2006-2011年间暴发的H7N9型流感病毒M1基因序列同源性在69.0%~89.6%,2013年感染人的H7N9型流感病毒与此前暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支。结论成功克隆了禽流感H7N9病毒的M1基因,并在E.coli中得以表达。     

人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的克隆及在大肠杆菌的温控表达

人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的克隆及在大肠杆菌的温控高效表达 ,采用RT PCR技术从人肝脏组织总RNA中扩增谷胱甘肽硫转移酶M1基因的cDNA序列 ,将其插入到原核温控表达载体pBV2 2 0多克隆位点中 ,构建重组表达质粒 ,并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定 ,并进行了温控表达 ,表达量约达到 2 8 3 %。人谷胱甘肽硫转移酶M1基因克隆到原核表达载体pBV2 2 0中 ,测序结果同Genbank中的人谷胱甘肽硫转移酶M基因序列比较 ,在 619位点C→A ,氨基酸由Pro→Thr,在 5 2 8位点C→T ,编码氨基酸仍为Asp。通过温控诱导 ,在 2 8kDa的表达量约达到 2 8 3 %。人谷胱甘肽硫转移酶M1原核温控表达载体pBV2 2 0的构建 ,为毒理学、遗传药理学的研究提供了应用基础     

普马拉病毒核蛋白基因片段原核表达及产物纯化

目的通过原核表达获得普马拉病毒重组核蛋白。方法采用RT-PCR方法,从感染普马拉病毒的鼠肺标本中扩增得到编码核蛋白1-117 aa的基因片段。将截短的核蛋白基因片段插入原核表达载体PQE30构建重组质粒,转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,利用N i-NTA Agarose对表达产物进行纯化。结果重组蛋白得到了高效表达。表达产物分子量15 000,在菌体中主要以可溶性蛋白形式存在。通过亲和层析,得到了纯化的重组蛋白。结论普马拉病毒重组核蛋白基因片段得到了有效表达。     

湖北省2006年甲型流感分离株NP蛋白的克隆及表达

目的采用原核表达系统表达2006年甲型流感分离株NP蛋白。方法参照已发表的甲型流感核蛋白（NP）基因序列及其基因组特性，设计合成PCR克隆引物。从2006年分离的流感病毒毒株中提取总RNA，反转录后采用高可信度DNA聚合酶，经PCR扩增NP基因，采用原核表达系统进行克隆表达。结果成功获得了纯化的N末端携带多聚组氨酸标签的重组NP蛋白，分子质量约6100kD。结论重组蛋白具有天然蛋白相同的抗原性，可用于流感诊断试剂的研发。     

含甲型H1N1流感病毒HA基因序列病毒样颗粒的制备

[目的]构建耐RNase酶的内含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒。[方法]构建中间载体pET32a-MS2,将甲型H1N1流感病毒的HA基因片段连接中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒,对病毒样颗粒进行荧光定量RT-PCR检测和稳定性实验。[结果]表达载体经PCR、酶切鉴定分析后证实构建成功,荧光定量RT-PCR实验表明该病毒颗粒含有HA基因片段并且颗粒稳定性良好。[结论]成功构建了含甲型H1N1流感病毒HA基因序列的病毒样颗粒且稳定性良好,有望作为甲型H1N1流感病毒RNA检测的标准品和质控品。     

高致病性禽流感H5N1病毒M1蛋白的重组表达及在感染检测中的初步应用

目的:原核表达重组高致病性禽流感基质蛋白M1并分析其在感染检测中的作用。方法:根据NCBI公布的基质蛋白M1的核苷酸序列设计特异性引物,用高致病禽流感H5N1病人分离的病毒提取病毒RNA进行反转录合成cD-NA,扩增基质蛋白M1基因。将M1基因克隆到pQE30原核表达载体进行非融合表达,纯化重组表达的蛋白并用免疫学方法检测分析。结果:克隆了高致病禽流感H5N1病毒基质蛋白M1基因,并采用pQE30原核表达载体成功表达该蛋白。以该重组蛋白为检测包被抗原建立间接ELISA,检测6份病人血清标本均为阳性,而正常对照人群为阴性。结论:高致病禽流感H5N1病毒M1蛋白可以应用于感染检测中。     

A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体体外表达鉴定

目的　从构建的A型流感病毒核蛋白(Nucleoprotein)噬菌体单链抗体库中筛选阳性克隆,在大肠杆菌HB2 15 1中表达流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体,为研究A型流感病毒免疫渗漏试剂盒建立基础。方法　经过连续三轮固相“亲和-洗脱-富集”筛选,丰富噬菌体抗体库中阳性克隆的比例,采用ELISA、SDS PAGE和Western blot方法对大肠杆菌培养上清液和细菌周质腔蛋白进行分析目的产物。采用亲和层析方法对细菌周质腔蛋白进行分离纯化并进行单链抗体滴度分析。结果　从96个克隆中筛选到10个阳性克隆,其中三个阳性信号较强,分别为A1、E1和G3。其A4 50 分别达到0 . 4 6 9、0 . 5 82和0 . 5 0 7。A型流感病毒核蛋白噬菌体单链抗体主要表达于细菌周质腔中,亲和纯化产物稀释4 0 .96倍,ELISA结果仍为阳性。结论　利用噬菌体抗体库技术,初步在大肠杆菌中表达了A型流感病毒噬菌体单链抗体。     

风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a(+),并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin

The recognition of specific pathogen associated molecular patterns (PAMPs) by members of the Toll-like receptor (TLR) family is critical for the activation of the adaptive immune response. Thus, incorporation of PAMPs into vaccines should result in more potent, protective antigen-specific responses in the absence of adjuvants or complex formulations. Here we describe an influenza A vaccine that is refractory to the genetic instability of hemagglutinin and neuraminidase and includes a trigger of the innate immune response to enhance immunogenicity and efficacy. A recombinant protein comprising the TLR5 ligand flagellin fused to four tandem copies of the ectodomain of the conserved influenza matrix protein M2 (M2e) was expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity. This protein, STF2.4xM2e, retained TLR5 activity and displayed the protective epitope of M2e defined by a monoclonal antibody, 14C2. Mice immunized with STF2.4xM2e in aqueous buffer, without adjuvants or other formulation additives, developed potent M2e-specific antibody responses that were quantitatively and qualitatively superior to those observed with M2e peptide delivered in alum. The antibody response was dependent on the physical linkage of the antigen to flagellin and recognized the epitope defined by monoclonal antibody 14C2, which has been shown to protect mice from challenge with influenza A virus. Moreover, immunization with STF2.4xM2e at a dose of 0.3 microg per mouse protected mice from a lethal challenge with influenza A virus, and significantly reduced weight loss and clinical symptoms. These data demonstrate that the linkage of specific TLR ligand with influenza M2e yields a vaccine candidate that offers significant promise for widespread protection against multiple influenza A virus strains.     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫B...     

主要黄病毒E蛋白抗原表位分析与初步鉴定

目的 对主要黄病毒结构蛋白的抗原表位情况进行系统分析,鉴别共同及特异性抗原表位并对可能的特异性抗原表位进行原核表达.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎(乙脑)病毒及黄热病毒E蛋白的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析,预测可能的抗原表位.在此基础上,根据表位位置和氨基酸序列的相似性,分析6种病毒的共有及特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息,对预测的抗原表位进行比对,进一步分析抗原表位在不同病毒株中的保守性.然后利用pET32及pMAL-c2x系统对可能的特异性抗原表位进行高效原核表达、Western blot验证其抗原性.结果 经系统的生物信息学分析,共预测获得登革病毒1～4型、乙脑病毒及黄热病毒共有抗原表位15个,病毒特异性抗原表位47个.利用pET32及pMAL-c2x系统对6种病毒部分可能的特异性抗原表位进行了高效表达.Western blot结果显示登革病毒1型及2型表达抗原片段表现良好的抗原反应原性,并与试验中所用其他黄病毒及甲病毒多克隆抗体无明显的交叉反应.而所表达的登革病毒3型和4型、乙脑病毒及黄热病毒片段无抗原反应原性.结论 6条原核表达抗原片段经Western blot验证,获得登革病毒1型和2型特异性抗原片段.     

Development of a candidate influenza vaccine based on virus-like particles displaying influenza M2e peptide into the immunodominant loop region of hepatitis B core antigen: Insertion of multiple copies of M2e increases immunogenicity and protective efficiency

The extracellular domain of the transmembrane protein M2 (M2e) of influenza A virus is a promising target for the development of “universal” vaccines against influenza. M2e is a poor immunogen by itself; however, when M2e is linked to an appropriate carrier, such as hepatitis B virus core (HBc) particles, it becomes highly immunogenic. Insertions of target peptides into the surface-exposed major immunodominant loop region (MIR) of the HBc antigen are especially immunogenic, but such insertions often affect the protein folding and formation of recombinant virus-like particles. To facilitate an appropriate conformation of the M2e insert, we introduced flexible linkers at the junction points between the insert and flanking HBc sequences. This approach allowed the construction of recombinant HBc particles carrying 1, 2 and 4 copies of M2e in the MIR region. These particles were produced in Escherichia coli and purified to homogeneity. The immune response and protective activity of hybrid HBc particles in mice correlated with the number of inserted M2e peptides: the highest immunogenicity and complete protection of mice against the lethal challenge by influenza virus was observed with particles carrying four copies of M2e. The possibility of the simultaneous presentation of M2e peptides from several important influenza strains on a single HBc particle could also facilitate the development of a broad-specificity vaccine efficient not only against influenza A strains of human origin but also for newly emerging strains of animal origin, such as the avian influenza.