用于超灵敏无标记检测相思子毒素的光子晶体免疫分析技术研究

目的制备了一种基于免疫分析的光子晶体传感材料,可以对相思子毒素进行无标记超灵敏检测。方法在24孔板中用附着有金纳米粒子(AuNPs)的二氧化硅微球(SiO2)通过自组装方法堆垒蛋白石光子晶体(PC),并用相思子毒素多克隆抗体(pAb)修饰光子晶体以实现传感材料对相思子毒素的特异性识别。结果在优化后的检测条件下,光子晶体衍射峰的强度随相思子毒素浓度的增加而降低。检测方法的线性范围为0.10 pg/mL至10 ng/mL,检出限为11 fg/mL。此外,饮用水和牛奶样品的加标回收实验表明,加标回收率为91.45%~113.61%。结论该传感材料不仅可以实现相思子毒素的超灵敏无标记检测,而且具有制备简便,响应迅速,操作简单等优点,在检测、诊断和监测领域具有广阔的应用前景。     

适配子型压电传感器的实验研究

目的建立适配子型压电传感器阵列检测人免疫球蛋白E,对适配子型压电石英传感器的各项参数进行初步探索。方法用生物素-亲和素法将针对人IgE的适配子探针固定在压电传感器的金膜表面,通过压电传感器对适配子与IgE的反应进行实时监测,观察不同浓度IgE的反应趋势及所引起的频率变化,获得IgE检测标准曲线;通过检测BSA、IgG、IgE非特异信号,并与特异性信号相比较对适配子检测的特异性进行检验。结果亲和素法固定适配子对IgE进行检测,最低检出限0.055mg/L,线性范围0.1～2.5mg/L,非特异性信号响应小,不超过同浓度特异性信号的5%。结论构建的适配子压电传感器可检测ng级物质且非特异性信号小,显示该平台在临床检测中有较好的应用前景。     

基于杂交链式反应的志贺菌核酸快速检测研究

目的建立一种以杂交链式反应为基础的快速检测志贺菌核酸的新方法。方法以志贺菌Cssr B基因的一段特异性核酸序列为靶标，设计带有FAM荧光基团标记的发卡探针，利用杂交链式反应扩增靶标序列；优化反应条件，评价信号的稳定性和选择性，绘制荧光信号与靶标浓度的工作曲线；通过人工质控检测及柑橘类水果实际样品检测验证方法的有效性。结果建立的方法经优化得到反应条件为0.2 mol/L Na⁺、1 mmol/L Mg²⁺的盐浓度，经平行测定荧光信号，RSD=0.12%，并且幽门螺杆菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌均不对其产生干扰信号，表明方法具有良好的稳定性和选择性；在志贺菌靶标核酸浓度为0.001～500 nmol/L范围内具有良好的线性关系，检出限为0.001 nmol/L(换算为0.015μg/L)；通过质控检测发现方法具有较好的准确性，且实际样品中未检出志贺菌。结论基于杂交链式反应的检测方法可以灵敏、稳定、特异性地检测志贺菌核酸，为志贺菌检测提供了一种新途径。     

适配体光子晶体传感材料的制备及初步应用

目的制备高度有序稳定的反蛋白石光子晶体材料,并将其应用于黄曲霉毒素B1的快速检测。方法以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球为模板,基于溶液中胶体/模板共组装法制备SiO_2反蛋白石光子晶体材料。以黄曲霉毒素B1(AFB1)为靶标,以适配体作为识别元件,制备适配体光子晶体传感材料,采用间接竞争法,建立黄曲霉毒素B1的快速检测方法。结果该方法可控合成大面积高度有序的三维结构材料,并进一步制备了适配体光子晶体传感材料,初步实现了黄曲霉毒素B1的快速检测,最低检测限达10~(-3)ng/ml。结论该方法可防止硅溶胶过度覆盖和非均匀渗透,减少了随机缺陷,简化了制备步骤。此外,还可修饰某些官能团制备成传感检测材料,如修饰氨基后,可通过戊二醛连接适配体、蛋白、抗体以及受体等,极大地拓展了光子晶体的应用领域。     

microRNA-21对机械力作用下小鼠L929细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miRNA-21对机械力作用下小鼠成纤维细胞系L929细胞的增殖和凋亡的影响。方法细胞培养与转染将L929细胞接种于细胞培养基(RPMI-1640)中,实验选用对数生长期长势良好的细胞,将细胞浓度调整为1×10^5/m L,接种于无菌的6孔板中,并分为阴性对照组(转染随机序列)、空白组及miRNA-21过表达组。miRNA-21过表达组采用miRNA-21模拟物(miRNA-21mimics)上调小鼠成纤维细胞内miRNA-21的表达。使用四点弯曲细胞力学加载系统对两组细胞分别进行力学加载,建立压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)细胞模型,加力大小为0、5333μstrain(4 mm),加载时间设定为4 h。使用CCK-8法检测各组细胞增殖,流式细胞仪检测各组细胞凋亡。结果与对照组及miRNA-21过表达组相比,加力组的细胞增殖活性明显下降,细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.001);而与加力组相比,miRNA-21过表达+加力组的细胞增殖活性显著上升,细胞凋亡率明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)。结论miRNA-21模拟物可通过上调小鼠成纤维细胞中miRNA-21的表达,影响机械力作用下小鼠成纤维细胞的增殖和凋亡,可能成为SUI生物治疗的新靶点。     

SPR免疫传感技术检测水中阿特拉津除草剂

目的利用表面等离子体共振(SPR)生物传感技术,对水样中的三嗪类农药阿特拉津进行检测,为研发相应快检技术与设备提供技术基础。方法以抗原或抗体作为传感器敏感识别元件,利用间接竞争法结合SPR传感技术对阿特拉津进行检测。结果方法最低检出限2.34 ng/ml(S/N=3),IC50=32.36 ng/ml,检测范围5.75~181.97 ng/ml,检测时间<30 min,回收率98.4%~104.2%,相对标准偏差1.9%。结论所建立方法对于检测水样中阿特拉津具灵敏性、准确性和精密性。     

以纳米金为报告系统的病原体快速检测基因芯片的研制

目的结合纳米放大芯片检测的专利技术,设计并制作适用于病原体快速检测的实用型基因芯片,以实现对临床常见感染病原体的快速、准确地检测和鉴定。方法分别针对各待检靶病原体特异性基因片段设计探针、构建芯片,并以纳米金为报告分子标志靶序列,通过杂交后与银的反应使得信号被放大,形成裸眼可见的褐色颗粒,从而实现芯片的检测。结果设计的探针具有很好的特异性、准确性和杂交条件的同一性;适当增加纳米金/核酸的比例能够减少标志时间,而轻微振荡明显加快标志反应的速度;在45℃杂交温度下,杂交反应盐离子浓度为0.8mol/L,杂交反应时间为8h,最后经过严格条件漂洗可以获得较佳的杂交效率,而轻微的旋转振荡则可以显著增加杂交的效率;37℃,3min×3的反应方式,可以获得较好的银染效果;本芯片系统具有较好的检测敏感性,可达到100fmol/L;与临床常规检测方法比,本芯片检测方法简单快捷,检测结果裸眼清晰可见,背景低。结论本芯片检测方法敏感性高,特异性好,操作方法简单,无需特殊设备,所设计的检测内容达到实用化水平,具有较好的临床应用前景。     

实时荧光定量PCR检测血清/血浆microRNAs临床应用前的准备

现已证明血清/血浆microRNAs(miRNAs)表达谱的变化与多种疾病的发生、发展相关。血清/血浆miRNAs分子稳定,不易降解,且标本采集创伤小、便捷,非常适合应用于临床实验室检测。因此miRNAs极有可能成为未来疾病诊断和预后评估的分子标志物乃至治疗靶标。实时荧光定量PCR检测法(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)操作简便,需要的RNA量较少,灵敏度极高,能在短时间内获得结果,并可同时检测多种miRNAs表达,有良好的应用前景。本文将详细探讨现阶段用于血清/血浆miRNAs定量检测的RT-qPCR方法,以及总结血清/血浆miRNAs定量检测应用于临床检验应注意的问题。     

应用电化学免疫传感器快速检测甲型H1N1流感病毒

目的以甲型H1N1流感病毒为检测对象,建立一种基于电化学传感技术的流感病毒的检测方法,用于流感病毒的现场快速检测和临床初步筛查。方法将甲型H1N1流感病毒的捕获抗体修饰于丝网印刷电极(SPCE)表面,与抗原结合后,通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体与其形成免疫夹心复合物,进行信号放大并测定其电化学参数变化以检测目标抗原含量。结果所建立的电化学免疫传感检测器能特异识别甲型H1N1流感病毒,与甲型H3N2和甲型H7N9的HA蛋白、乙型流感病毒、腺病毒和EV71病毒等无交叉反应,检测线性范围为4~64 HA Unit,检测下限为0.41 HA Unit,批内重复性结果 RSD值均10%,回收率均90%,整个检测过程可在3 h内完成。结论该电化学免疫传感器可实现对甲型H1N1流感病毒的准确和快速检测,且检测设备易携带,有望用于流感病毒的现场快速筛查。     

外周血MicroRNA-6767-5p在多囊卵巢综合征患者中的表达及临床意义

目的通过检测多囊卵巢综合征(PCOS)外周血miRNAs的表达量,探讨其在PCOS患者中的表达情况及临床意义。方法选取2015年12月-2016年12月在东莞市石排医院妇科收治的PCOS确诊患者21例为PCOS组,另选取同期在该院进行体检的21名健康女性作为对照组。采用Sure Print G3生物芯片检测miRNAs的表达,选取PCOS患者中上调超过1. 5倍或下调少于0. 67倍的miRNA,然后采用定量实时聚合酶链反应(RT-q PCR)验证miRNA的相对表达。结果与健康对照相比,PCOS患者血清中miRNA-4522,miRNA-324-3p和miRNA-6767-5p表达量下调;经RT-q PCR验证,PCOS/对照组miRNA-6767-5p表达量比例为0. 39 (P0. 05);经调整年龄、体重指数后,miRNA-6767-5p与空腹血糖呈负相关(β=-0. 371,P0. 05),与每年月经次数呈正相关(β=0. 383,P0. 05); miRNA-6767-5p基因靶向基因参与细胞周期和免疫系统。结论血清miRNA-6767-5p可作为PCOS诊断的分子生物学标志物,可能参与PCOS患者的新陈代谢和生殖功能。     

肽核酸生物传感器直接检测临床标本中提取的病毒基因组DNA

目的 以肽核酸生物传感器检测系统直接检测从临床标本中提取的乙型肝炎病毒基因组DNA。方法 抽取63例临床免疫学检测证实为乙型肝炎病毒(HBV)感染者标本血清的DNA，以及15例免疫学检测全阴的标本血清中的DNA，分别用肽核酸生物传感器法以及定量PCR法检测，比较两种方法的优劣并确定传感器法的检测限。结果 传感器法检测60例标本阳性，阳性率为95．24％，而定量PCR法检测63例均为阳性；15例阴性血清两种方法检测均为阴性；传感器法的检测限为8．6pg／L；两种方法检测HBV差异无显著性，但传感器检测法所用时间更短，且无需进行探针的标记。结论 利用肽核酸生物传感器成功地绕过了PCR扩增而直接检测出了临床标本中的HBV基因组DNA。     

多色荧光探针的滚环扩增技术检测结核分枝杆菌耐药基因

本研究旨在构建基于核酸滚环扩增（RCA）的简便快速、超灵敏的光学生物传感技术,并将其运用于结核杆菌耐药相关基因的多重检测。本研究在2020年2月至2021年5月期间,于陆军军医大学第一附属医院检验科,针对异烟肼、利福平和链霉素耐药的高频基因突变位点katG315（AGC?ACC）、rpoB531（CAC?TAC）和rp...     

漏声表面波生物传感器不同检测方法的实验研究

目的构建双通道漏声表面波生物传感器液相检测技术平台。方法以人乳头状瘤病毒为检测对象,传感器检测系统运用相位、频率及延迟线3种检测方法对其进行实时检测;利用扫描隧道显微镜观察传感器裸金表面、固定巯基化探针以及核酸杂交后的金膜表面结构的微观变化。结果相位和频率两种检测方法较好;扫描隧道显微镜下可以看到裸金膜表面金原子排列有序;探针分子分布密度增加;杂交后寡核酸分子密度更为密集。结论成功构建了漏声表面波生物传感器液相检测技术平台并运用多种检测方法;扫描隧道显微镜可以形象直观地对传感器金膜表面、核酸杂交进行直接观察,结果进一步证实了实验结论的正确性。     

miRNA-21靶向作用于maspin及其对胆管癌细胞增殖、凋亡的影响

目的通过抑制miRNA-21的表达观察对胆管癌细胞株增殖、凋亡的影响,并探讨miRNA-21可能调控的靶基因。方法以人胆管癌细胞RBE细胞为研究对象,根据处理方法不同,细胞分为四组：正常细胞组、脂质体组（仅予脂质体）、阴性对照组（转染相关阴性对照试剂）、miRNA-21抑制组（转染miRNA-21抑制剂）。应用MTT方法检测细胞增殖活性的变化,应用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,通过荧光定量PCR技术及蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测RBE细胞中maspin基因表达的改变。结果 miRNA-21在经转染miRNA-21抑制剂后在RBE细胞中的表达得到有效抑制,荧光定量PCR结果显示与正常细胞相比,其表达下降了0.02倍。MTT结果显示RBE细胞在抑制miRNA-21表达后增殖活性明显受到抑制（P〈0.05）,流式细胞仪结果显示各组细胞凋亡率分别为2.29%、2.43%、2.89%、19.35%,miRNA-21的表达降低后,RBE细胞的凋亡率明显增高（P〈0.05）,并且荧光定量PCR及western blot结果显示maspin mRNA及其蛋白的表达明显上调（P〈0.05）。结论通过抑制miRNA-21的表达可抑制RBE细胞的增殖,促进RBE细胞的凋亡,miRNA-21可通过靶向抑制maspin的表达发挥生物学作用。     

新生儿缺氧缺血性脑病血清中miRNA-21调控HIF-1α表达及临床意义

目的探讨新生儿缺氧缺血性脑病血清中miRNA-21、缺氧诱导因子1(HIF-1α)的表达及临床意义,为临床上早期诊断及治疗缺氧缺血性脑病提供科学依据。方法选取2012年1月-2013年6月在新乡市中心医院和妇幼保健院出生的新生儿,分为:缺血缺氧组49例;正常对照组29例,共计78例。两组于生后24~48h内采血5mL。应用实时荧光定量PCR技术检测血清中miRNA-21和HIF-1α的表达水平。结果缺氧缺血组与对照组相比,缺氧缺血组血清中miRNA-21和HIF-1α均呈现高表达(P0.05)。结论血清中miRNA-21和HIF-1α的高表达与缺氧缺血性脑病有关,并可作为早期判断脑损伤的有用的生物学指标。     

核酸信号放大检测及纳米技术的应用

近年来发展迅速的核酸信号放大检测方法有效地提高了核酸检测的灵敏度，文章对枝状核酸信号放大系统(bDNA)，侵染检测(Invader)，滚环扩增方法(RCA)的检测原理、分析性能以及临床应用等相关问题进行了评述，重点描述了纳米粒子在放大核酸检测信号中的应用，并对信号放大方法与模板扩增方法进行了对比。     

酶切保护聚合酶链反应检测多环芳烃受体与特异性DNA的结合

目的 建立一种改进的核酸外切酶保护聚合酶链反应(PCR)检测DNA．蛋白质结合物。方法 将1pmol／L至10nmol／L二噁英溶液(TCDD)与100μl含不同浓度多环芳烃受体的SD大鼠肝细胞溶质温育,再与1fmol至100nmol含二噁英反应元件的寡核苷酸探针作用形成复合物,用核酸外切酶Ⅲ和S1核酸酶进行消化后进行PCR,通过琼脂糖电泳检测PCR产物。同时设阴性对照(二甲基甲砜,DMSO)和空白对照。结果在实验组用琼脂糖电泳可以检测到期望大小片段(285bp)的DNA,而对照组均为阴性。在一定范围类TCDD浓度与结合。DNA之间存在剂量．效应关系。检测到的最小受体量为2.5fmol,最小DNA量为2fmol。结论 核酸外切酶保护PCR无放射性污染,灵敏度和特异性高,简便易行,可作为DNA-蛋白质结合物的定性检测方法。     

适配子压电石英芯片再生性能研究

目的探索适配子压电石英芯片最佳再生试剂,对固定好的适配子型芯片保存性能进行检测。方法用生物素-亲和素法将针对人IgE的适配子探针固定在压电传感器的金膜表面,分别用HCl、NaOH、EDTA、尿素、甲酰胺5种试剂对适配子芯片进行再生实验,选取较好再生试剂;将固定好的适配子芯片保存在PBS缓冲液（0.1%叠氮钠）中,对芯片的保存时间进行测定。结果用EDTA对适配子芯片进行再生效果最好,重复检测5次后芯片响应信号仍在第1次检测的〉90%,此外HCl也可对适配子芯片重复利用3次;固定好的适配子芯片在加入防腐剂的结合缓冲液中可长期保存,保存21d后信号响应无明显下降。结论与抗体压电传感器相比较,适配子压电传感器有一定优势,适配子芯片成本更低,再生能力强,固定好的芯片保存时间长,体现出适配子检测的优越性。