1,25-二羟基维生素D3对PM2.5所致HBE细胞氧化损伤的保护作用

目的： 探讨1，25-二羟基维生素D₃[1，25-（OH）₂D₃]对细颗粒物（PM_2.5）致人支气管上皮细胞（HBE）氧化损伤的保护作用。方法： 根据处理因素不同将细胞分为4组，溶剂（乙醇）对照组、1，25-（OH）₂D₃干预组、乙醇+PM_2.5染毒组、PM_2.5染毒+1，25-（OH）₂D₃干预组。溶剂对照组细胞用0.1%乙醇处理48 h，1，25-（OH）₂D₃干预组用1×10^-9 mol/L 1，25-（OH）₂D₃处理48 h，乙醇+PM_2.5染毒组用0.1%乙醇溶剂处理24 h后更换为含乙醇的PM_2.5（200 μg/mL）染毒液继续处理24 h，PM_2.5染毒+1，25-（OH）₂D₃干预组用1×10^-9 mol/L 1，25-（OH）₂D₃预处理24 h后更换为含1，25-（OH）₂D₃的PM_2.5（200 μg/mL）染毒液继续处理24 h。染毒结束后，用CCK-8试剂盒测定细胞存活率、丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）-Glo^TM试剂盒分别测定MDA浓度和GSH/GSSG比值，Western blot实验测定维生素D受体（VDR）、转录因子NF-E2相关因子2（Nrf-2）与血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白的表达水平。结果： PM_2.5染毒处理后，HBE细胞的存活率降至80.8%，1，25-（OH）₂D₃预处理24 h后再进行PM_2.5染毒的细胞存活率降低至75.8%。与对照相比，PM_2.5染毒后，HBE细胞MDA浓度显著增加（P < 0.05），而GSH/GSSG的比值却明显降低（P < 0.01）。1，25-（OH）₂D₃处理48 h后可显著改善PM_2.5染毒细胞的抗氧化水平（P < 0.05），主要表现为MDA浓度的降低和GSH/GSSG比值的增加。蛋白分析结果发现，PM_2.5可诱导细胞Nrf-2和HO-1蛋白表达的增加。1，25-（OH）₂D₃干预48 h后可上调HBE细胞内VDR水平，并可增加PM_2.5染毒组细胞内Nrf-2和HO-1蛋白的表达水平。结论： PM_2.5可诱导HBE细胞氧化损伤，主要表现为脂质过氧化水平升高、GSH/GSSG比值下降和抗氧化蛋白Nrf-2与HO-1表达水平的增加。在PM_2.5所致细胞氧化应激效应中，1，25-（OH）₂D₃可起到一定的保护作用，这可能与VDR及Nrf-2/HO-1信号通路有关。而1，25-（OH）₂D₃所致细胞存活率的降低可能与其诱导细胞周期阻滞及促进PM_2.5所诱导损伤细胞的凋亡有关。     

PM2.5对支气管上皮细胞DNA损伤作用研究

目的：探讨大气细颗粒物（PM_2.5）染毒对人支气管上皮细胞（HBE） DNA损伤的作用。方法：分别用8、20、50 μg/mL的PM_2.5水溶液染毒HBE细胞24 h后,单细胞凝胶电泳实验（SCGE）检测DNA损伤情况。10和50 μg/L的PM_2.5水溶液染毒HBE细胞,以未染毒细胞作为阴性对照组,10 μmol/L的Cr⁶⁺水溶液为阳性对照组,实时荧光定量PCR （qPCR）检测DNA损伤修复基因hOGG1、hMTH1的mRNA表达水平的变化,Western blot检测hOGG1、hMTH1蛋白表达变化。结果：单细胞凝胶电泳检测8、20和50 μg/mL PM_2.5水溶液染毒组HBE细胞的尾部DNA含量、尾长、尾距较阴性对照组明显增加（P < 0.05或P < 0.01）。qPCR结果显示,与阴性对照组比较,HBE细胞hOGG1 mRNA表达水平在10和50 μg/mL PM_2.5水溶液染毒以及阳性对照Cr⁶⁺水溶液染毒后分别升高75.0%、132.0%、214.0%;hMTH1 mRNA分别升高61.0%、144.0%、75.0%。Western blot结果显示,与阴性对照组比较,HBE细胞hOGG1蛋白表达水平在10和50 μg/mL PM_2.5水溶液染毒以及Cr⁶⁺水溶液染毒后分别升高47.6%、64.0%、47.0%;hMTH1蛋白分别升高20.5%、49.8%、20.9%。结论：PM_2.5水溶液染毒对HBE细胞DNA具有明显的损伤作用,并引起HBE细胞DNA损伤修复基因hOGG1、hMTH1表达水平升高。     

PM2.5对HBE细胞致癌致突变相关基因表达的影响

目的：采用基因芯片技术与生物信息学分析方法，筛选PM_2.5染毒后的人支气管上皮细胞（HBE）与未染毒细胞比较的差异表达基因和通路，为进一步研究PM_2.5对HBE细胞致癌致突变作用的相关机制提供科学依据。方法：用50 μg/mL的PM_2.5水溶液处理HBE细胞，染毒24 h，用未染毒的细胞作为空白对照组，设立3组平行样品。提取RNA，荧光标记与纯化后进行芯片杂交，用Rosetta Resolver-System（Rosetta Biosoftware）进行数据前处理与统计分析，得到差异表达基因。将数据经过Cluster Profiler软件进行主成分和聚类分析、Pathway及GO（Gene Ontolog）分析，初步探讨PM_2.5染毒前后HBE细胞中基因的差异表达；通过String蛋白互作数据库分析差异表达基因的蛋白互作关系，筛选出节点数最多的核心蛋白。结果：根据预设的筛选条件，筛选出245个PM_2.5染毒前后HBE细胞中的差异表达基因，其中上调基因27个，下调基因218个，经过进一步分析，筛选出PHACTR2、SFRP1、WFDC1等排名前10的上调和下调的核心基因。排名前10的核心差异基因通过GO功能注释富集分析显示，差异表达基因主要富集在跨膜受体活性、受体活性、细胞信号传导、细胞分子传导等分子功能。同时富集于离子跨膜转运、细胞对脂多糖无机离子跨膜转运、细胞营养转运等生物过程；排名前10的差异表达基因通过KEGG富集分析显示，差异表达基因主要富集在涉及肿瘤细胞迁移、胆汁代谢相关、神经活性、遗传毒性等方面的7个核心通路；蛋白互作用网络图筛选出SST、BDNF、NCAM1、SSTR1和Bcl2L11等5个核心蛋白。结论：PM_2.5可引起HBE细胞致癌致突变相关基因的差异表达，可为进一步研究PM_2.5的致癌致突变作用机制提供科学依据。     

沉默c-fos基因对PM2.5染毒人支气管上皮细胞癌基因和凋亡相关基因表达的影响

目的： 探讨沉默c-fos基因对PM_2.5染毒人支气管上皮细胞（HBE细胞）癌基因和凋亡相关基因表达的影响。方法： 采用RNA干扰技术，根据GenBank提供的c-fos mRNA序列，设计合成shRNA干扰序列，将重组慢病毒载体转染HBE细胞，构建c-fos基因沉默细胞株。采用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western blot对c-fos基因沉默效果进行鉴定。以HBE细胞、c-fos基因沉默细胞为实验对象，用浓度为50 μg/mL的PM_2.5混悬液染毒24 h，同时设立阴性对照组，qPCR和Western blot分别检测部分癌基因c-myc、k-ras、c-fos、p53和凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8在mRNA及蛋白质表达水平的变化。结果： 转染c-fos-shRNA慢病毒的HBE细胞中，经qPCR和Western blot检测发现，与对照组HBE细胞相比，c-fos mRNA表达水平下降70.1%，c-fos蛋白表达水平下降53.7%。PM_2.5染毒HBE细胞后，与未染毒的对照组比较，c-myc和k-ras mRNA表达水平分别升高30.46%、27.17%，差异均有统计学意义（P < 0.05），c-fos、Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达水平分别升高50.78%、71.91%、74.16%，p53 mRNA表达水平下降12.27%，差异均有统计学意义（P < 0.01）。PM_2.5染毒c-fos基因沉默细胞后，与未染毒组比较，c-myc、k-ras mRNA表达水平分别下降13.08%、5.39%，Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达水平分别下降25.03%、21.37%（P < 0.05），p53 mRNA下降53.39%（P < 0.01）。此外，c-fos基因沉默细胞染毒后，与HBE正常细胞染毒后比较，c-myc、k-ras、p53、c-fos、Caspase-3和Caspase-8的mRNA表达水平均有所下降（P < 0.05）；仅c-myc蛋白表达下降（P < 0.01）。结论： 成功构建c-fos基因沉默细胞株；PM_2.5可引起HBE细胞癌基因和凋亡相关基因表达水平明显升高，c-fos基因沉默在一定程度上能抑制PM_2.5对癌基因和凋亡相关基因的激活作用。     

沉默c-fos基因对PM2.5染毒人支气管上皮细胞癌基因和凋亡相关基因表达的影响

目的： 探讨沉默c-fos基因对PM_2.5染毒人支气管上皮细胞（HBE细胞）癌基因和凋亡相关基因表达的影响。方法： 采用RNA干扰技术，根据GenBank提供的c-fos mRNA序列，设计合成shRNA干扰序列，将重组慢病毒载体转染HBE细胞，构建c-fos基因沉默细胞株。采用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western blot对c-fos基因沉默效果进行鉴定。以HBE细胞、c-fos基因沉默细胞为实验对象，用浓度为50 μg/mL的PM_2.5混悬液染毒24 h，同时设立阴性对照组，qPCR和Western blot分别检测部分癌基因c-myc、k-ras、c-fos、p53和凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8在mRNA及蛋白质表达水平的变化。结果： 转染c-fos-shRNA慢病毒的HBE细胞中，经qPCR和Western blot检测发现，与对照组HBE细胞相比，c-fos mRNA表达水平下降70.1%，c-fos蛋白表达水平下降53.7%。PM_2.5染毒HBE细胞后，与未染毒的对照组比较，c-myc和k-ras mRNA表达水平分别升高30.46%、27.17%，差异均有统计学意义（P < 0.05），c-fos、Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达水平分别升高50.78%、71.91%、74.16%，p53 mRNA表达水平下降12.27%，差异均有统计学意义（P < 0.01）。PM_2.5染毒c-fos基因沉默细胞后，与未染毒组比较，c-myc、k-ras mRNA表达水平分别下降13.08%、5.39%，Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达水平分别下降25.03%、21.37%（P < 0.05），p53 mRNA下降53.39%（P < 0.01）。此外，c-fos基因沉默细胞染毒后，与HBE正常细胞染毒后比较，c-myc、k-ras、p53、c-fos、Caspase-3和Caspase-8的mRNA表达水平均有所下降（P < 0.05）；仅c-myc蛋白表达下降（P < 0.01）。结论： 成功构建c-fos基因沉默细胞株；PM_2.5可引起HBE细胞癌基因和凋亡相关基因表达水平明显升高，c-fos基因沉默在一定程度上能抑制PM_2.5对癌基因和凋亡相关基因的激活作用。     

原花青素对淀粉样蛋白Aβ 25-35诱导的 SH-SY5Y细胞 毒性的影响

目的：探讨原花青素对淀粉样蛋白片段Aβ_25-35染毒的SH-SY5Y细胞存活、氧化应激及其分泌淀粉样蛋白Aβ_1-42和可溶性淀粉样蛋白sAPPα水平的影响。方法：分别以不同浓度（0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL）原花青素和不同浓度（0.1、1.0、10.0、20.0 μmol/L）的Aβ_25-35作用SH-SY5Y细胞24 h后用MTT法检测细胞活力,进一步以1.0 μmol/L Aβ_25-35染毒细胞,建立细胞损伤模型,不同浓度（0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL）原花青素干预24 h,用MTT法检测细胞活力,ELISA法检测细胞分泌Aβ_1-42水平及sAPPα水平,TBA法测定细胞内丙二醛（MDA）含量,WST-8法测定细胞内总超氧化物歧化酶（SOD）活力。结果：与对照组相比,不同浓度原花青素作用24 h后,细胞存活率差异均无统计学意义（P均>0.05）,而不同浓度Aβ_25-35均使SH-SY5Y细胞活力降低（P < 0.01）,其中1.0 μmol/L Aβ_25-35 对细胞活力的抑制作用最强（P < 0.01）。以1.0 μmol/L Aβ_25-35染毒细胞,Aβ_1-42分泌水平升高（P < 0.01）,sAPPα水平降低（P < 0.01）,细胞内MDA含量升高（P < 0.01）,总SOD活力降低（P < 0.01）。与1.0 μmol/L Aβ_25-35染毒组比较,0.1、0.5、1.0、5.0 μg/mL原花青素干预可提高各组细胞活力（P < 0.05）,降低Aβ_1-42分泌水平（P < 0.01）;0.5、1.0、5.0 μg/mL原花青素干预可提高细胞分泌sAPPα水平（P < 0.05）,降低细胞内MDA含量（P < 0.05）,增强总SOD活力（P < 0.05）。结论：原花青素可减轻Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞Aβ负荷,并减轻细胞氧化损伤。     

PM2.5染毒HBE细胞前后差异表达的microRNAs及其生物信息学分析

目的：采用microRNA（miRNA）测序和生物信息学方法，分析大气细颗粒物（PM_2.5）染毒人支气管上皮HBE细胞前后差异表达的miRNAs，预测差异miRNAs的生物学功能和信号转导途径。方法：用50 μg/mL的PM_2.5混悬液染毒HBE细胞，以未染毒组作为对照组，处理24 h后提取总RNA样品，Small RNA样品预处理试剂盒构建文库，并利用illumina HiSeq^TM 2500/MiSeq测序平台进行高通量测序。以调整后P < 0.05的筛选标准得到差异miRNAs，使用miRanda和RNAhybrid两个软件共同预测差异miRNAs的靶基因并进行GO和KEGG功能富集分析，利用STRING数据库和Cytoscape软件对miRNAs和靶基因及靶基因之间的相互作用关系进行可视化分析。结果：高通量测序方法共检测到PM_2.5染毒前后的包含1 137个miRNAs的表达谱，27个为差异表达的miRNAs，其中7个上调，20个下调。GO和KEGG富集分析发现，这些差异miRNAs主要参与细胞代谢、酶活性调节等生物学过程，聚集于胞内如细胞质、细胞器等，涉及代谢途径、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路等与细胞增殖、分化、凋亡及癌症发生等相关的重要信号通路。此外，通过构建相互作用网络图，鉴定了miR-371b-3p、miR-371a-5p、miR-27a-3p、miR-7-5p、miR-372-3p等相互作用数量前11位的核心miRNAs，以及3个核心靶基因（VEGFA、MAPK3、CCR5）。结论：PM_2.5染毒HBE细胞后引起了27个miRNAs的差异表达，涉及PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路及MAPK信号通路等与癌症发生发展相关的重要信号通路，其中筛选了11个核心miRNAs和3个核心基因，为深入研究PM_2.5致癌毒理作用机制提供了实验依据。     

PM2.5染毒HBE细胞前后差异表达的microRNAs及其生物信息学分析

目的：采用microRNA（miRNA）测序和生物信息学方法，分析大气细颗粒物（PM_2.5）染毒人支气管上皮HBE细胞前后差异表达的miRNAs，预测差异miRNAs的生物学功能和信号转导途径。方法：用50 μg/mL的PM_2.5混悬液染毒HBE细胞，以未染毒组作为对照组，处理24 h后提取总RNA样品，Small RNA样品预处理试剂盒构建文库，并利用illumina HiSeq^TM 2500/MiSeq测序平台进行高通量测序。以调整后P < 0.05的筛选标准得到差异miRNAs，使用miRanda和RNAhybrid两个软件共同预测差异miRNAs的靶基因并进行GO和KEGG功能富集分析，利用STRING数据库和Cytoscape软件对miRNAs和靶基因及靶基因之间的相互作用关系进行可视化分析。结果：高通量测序方法共检测到PM_2.5染毒前后的包含1 137个miRNAs的表达谱，27个为差异表达的miRNAs，其中7个上调，20个下调。GO和KEGG富集分析发现，这些差异miRNAs主要参与细胞代谢、酶活性调节等生物学过程，聚集于胞内如细胞质、细胞器等，涉及代谢途径、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路等与细胞增殖、分化、凋亡及癌症发生等相关的重要信号通路。此外，通过构建相互作用网络图，鉴定了miR-371b-3p、miR-371a-5p、miR-27a-3p、miR-7-5p、miR-372-3p等相互作用数量前11位的核心miRNAs，以及3个核心靶基因（VEGFA、MAPK3、CCR5）。结论：PM_2.5染毒HBE细胞后引起了27个miRNAs的差异表达，涉及PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路及MAPK信号通路等与癌症发生发展相关的重要信号通路，其中筛选了11个核心miRNAs和3个核心基因，为深入研究PM_2.5致癌毒理作用机制提供了实验依据。     

p38MAPK基因对PM2.5染毒HK-2细胞部分癌基因和凋亡相关基因表达的影响

目的：探讨p38MAPK基因对PM_2.5染毒人肾上皮细胞（HK-2）部分癌基因和凋亡相关基因表达的影响。方法：根据GenBank提供的p38MAPK mRNA序列,设计合成干扰序列,将重组慢病毒载体转染HK-2细胞,构建p38MAPK基因沉默细胞株。分别采用实时荧光定量PCR （qPCR）和Western blot法检测p38MAPK mRNA和蛋白的表达水平鉴定沉默效果。用50 μg/mL的PM_2.5混悬液分别染毒正常HK-2细胞和p38MAPK基因沉默细胞24 h,利用荧光定量PCR和Western blot检测癌基因c-myc,c-fos、p53和凋亡相关基因Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2的mRNA和蛋白的相对表达水平。结果：qPCR和Western blot检测结果显示,与正常HK-2细胞比较,p38MAPK基因沉默细胞中p38MAPK mRNA的表达下降了58.50%,p38MAPK蛋白表达水平下降了51.33%（P<0.01）。PM_2.5混悬液对HK-2细胞和p38MAPK基因沉默HK-2细胞染毒后,qPCR检测结果显示,与正常HK-2细胞未染毒组比较,正常HK-2细胞PM_2.5染毒组中c-myc、c-fos、Caspase-8和Casepase-9基因表达分别升高39.89%、15.12%、19.47%和15.45%,p53和Bcl-2基因表达分别下降21.54%和31.77%,差异均具有统计学意义（P<0.05）;与正常HK-2细胞PM_2.5染毒组比较,p38MAPK基因沉默HK-2细胞PM_2.5染毒组中c-myc、c-fos、p53、Caspase-8和Caspase-9 mRNA表达分别下降了84.55%、63.55%、34.49%、37.19%和54.97%,差异均具有统计学意义（P<0.05）。Western blot检测结果显示,与正常HK-2细胞未染毒组比较,正常HK-2细胞PM_2.5染毒组中的c-myc和Caspase-8蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少;与正常HK-2细胞PM_2.5染毒组比较,p38MAPK基因沉默HK-2细胞PM_2.5染毒组中的c-myc、Caspase-8和Bcl-2蛋白表达减少（均为P<0.05）。结论：成功构建了p38MAPK基因沉默细胞株,PM_2.5可引起HK-2细胞癌基因和凋亡相关基因表达水平升高,p38MAPK基因可能参与PM_2.5对HK-2细胞的毒性作用过程。     

PM2.5对HK-2细胞氧化损伤和凋亡的影响

目的：探讨深圳和太原市PM_2.5对人肾上皮细胞（HK-2）氧化损伤和凋亡的影响。方法：用中流量采样器分别采集太原某大学校园和深圳市疾病预防控制中心楼顶空气,将吸附有PM_2.5的滤膜洗脱后制备PM_2.5混悬液。设置阴性对照组、50 μg/mL深圳PM_2.5样品组、50 μg/mL太原PM_2.5样品组和10 μmol/L Cr⁶⁺阳性对照组,分别处理HK-2细胞24 h,测定4组细胞氧化损伤指标丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的变化,并应用流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果：与阴性对照组相比,深圳PM_2.5样品组、太原PM_2.5样品组和阳性对照组中MDA含量分别升高8.16%、34.51%和72.23%;SOD活性分别降低7.49%、19.67%和29.55%;GSH含量分别降低10.43%、16.39%和37.43%。太原PM_2.5样品组与阴性对照组的差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。GSH-PX活性分别降低42.70%、61.62%和60.98%,细胞凋亡率分别升高197.25%、301.22%和399.08%,上述3组与阴性对照组间的差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。结论：深圳和太原市PM_2.5均可引起HK-2细胞发生氧化损伤和细胞凋亡率增加,且太原市PM_2.5的作用更为明显。     

Antiproliferative effect of a vitamin D3 analog, EB1089, on HL-60 cells by the induction of TGF-beta receptor

EB1089 is a novel 1,25(OH)₂D₃ analog that has more potent antitumor properties with reduced hypercalcemic effects than 1,25(OH)₂D₃. We investigated the role of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in the growth inhibition of human acute myeloid leukemia cell line, HL-60, by EB1089. Clonal growth of HL-60 cells was inhibited in a dose-dependent manner by EB1089. Although TGF-β1 alone slightly inhibited proliferation of HL-60 cells, the addition of TGF-β1 into culture treated with 10⁻⁸ M of EB1089 showed a significant synergistic antiproliferative effect in a dose-dependent manner. EB1089 up-regulated the expression of TGF-β receptor type I (TGF-β RI), type II (TGF-β RII) and TGF-β1. Antiproliferative effect of EB1089 was partially reversed by TGF-β1 neutralizing antibody (anti-TGF-β1). Vitamin D receptor (VDR) expression was increased by TGF-β1, suggesting synergistic action of TGF-β1 and EB1089. Combined treatment of EB1089 and TGF-β1 resulted in an increased expression of cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKI), p27 protein, compared to either ligand alone. Up-regulation of p27 protein expression by either TGF-β1 or EB1089 was reduced by anti-TGF-β1. These findings suggest that TGF-β1 is involved in the antiproliferative effect of EB1089 on HL-60 cells.     

维生素D及其受体在妇科癌症中的研究进展

在过去的二十几年中,国内外大量的研究是关于维生素D及维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)在癌症发生、发展中所起的作用.维生素D的活性代谢产物1,25(OH)2 D3除了维持体内矿物质的稳态和骨骼的功能外,还具有抑制细胞增殖、诱导细胞分化、凋亡及免疫调节的作用.近些年,越来越多的研究证据表明,维生...