顺铂间歇性干预对A549中干细胞及EMT相关基因表达的影响

目的:研究肺癌细胞A549在顺铂(DDP)间歇性干预后肿瘤干细胞(CSC)标志物(CD133)和上皮细胞间质转化(EMT)标志物(E-cadherin、β-catenin、Vimentin和Fibronectin)表达的变化,探讨肺癌耐药和CSC及EMT之间的相关性。方法:应用CCK-8法检测A549细胞对DDP的敏感性,DDP IC50间歇性处理A549细胞,采用Western blot法检测CD133蛋白表达变化,RT-q PCR法测定A549细胞处理前后E-cadherin、β-catenin、Vimentin和Fibronectin mRNA的表达。结果:肺腺癌细胞A549经DDP间歇性干预后,CSC标记物CD133蛋白表达增高,E-cadherin和β-catenin mRNA的相对表达量均显著降低,Vimentin mRNA的相对表达量显著增高。结论:A549细胞经DDP间歇性干预后有CSC标志物的表达,并表现出EMT的特性。     

β-catenin对非小细胞肺癌细胞A549顺铂耐药作用及机制的探讨

目的:探讨β-catenin介导的信号通路在人非小细胞肺癌顺铂(DDP)耐受中的作用及可能机制.方法:MTS法检测人非小细胞肺癌A549及其衍生的DDP耐受细胞A549/DDP对DDP的敏感性;蛋白质印迹法检测A549和A549/DDP细胞内β-catenin及其靶基因Survivin和Bcl-2的蛋白表达,并以TCF/LEF报告基因检测β-catenin的活性;实时定量PCR检测Survivin和Bcl-2的转录水平;将β-catenin反义寡核苷酸片段转染入A549/DDP细胞沉默β-catenin的表达,MTS检测干扰前后细胞对DDP的敏感性,实时定量PCR及蛋白质印迹法检测相关基因的表达.结果:A549/DDP对DDP的耐受性是A549细胞的3.14倍,P=0.006 9;A549/DDP细胞中β-catenin蛋白含量上调且其活性上调4.28倍(P=0.003 6),β-catenin的靶基因Survivin及Bcl-2在mRNA及蛋白水平均上调;干扰下调A549/DDP细胞中β-catenin 明显下调了Survivin及Bcl-2的mRNA及蛋白水平,增加了对DDP的敏感性.结论:β-catenin在耐药细胞A549/DDP对DDP的耐受中起着重要作用,是逆转肺癌DDP耐受的可能潜在靶标.     

全反式维甲酸与顺铂联合对肺腺癌A549细胞株增殖与凋亡影响的观察

目的:体外观察全反式维甲酸(ATRA)联合顺铂(DDP)抑制肺腺癌细胞株A549增殖及诱导其凋亡的作用.方法:应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定A549细胞生长抑制率,荧光定量RT-PCR法测定A549细胞维甲酸受体-β(RARβ)mRNA、血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的转录情况.结果:应用DDP(5、 10 和 50 mg/L)之后,与对照组相比,可以显著抑制A549细胞的增殖作用,且随着药物浓度的增加,其抑制作用增强,P＜0.05;ATRA+DDP联合用药组的细胞增殖抑制作用较单独应用DDP有更高的抑制强度,与DDP组相比,ATRA+DDP组增加了RARβ的表达,抑制了VEGF的表达,A549细胞的凋亡率增加,P＜0.05.结论:全反式维甲酸联合顺铂能更有效抑制A549细胞的增殖,增加非小细胞肺癌对顺铂化疗的敏感性.     

SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响

背景与目的 肺癌是最严重的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌发病率在肺癌中居首位.部分患者对顺铂耐受是导致化疗失败的主要原因.SOX4是转录调节因子,在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用,通过调控β-catenin的表达对Wnt信号通路进行调控.本研究旨在探讨SOX4对非小细胞肺癌细胞A549的顺铂耐药作用的影响.方法 体外诱导法建立顺铂耐药的肺癌细胞株A549/DDP,CCK8法检测A549及A549/DDP细胞对顺铂的耐药性.绘制A549与A549/DDP细胞生长曲线.Western blot检测耐药细胞株中SOX4的蛋白表达水平.CCK8法检测敲减SOX4后耐药细胞株A549/DDP对顺铂耐药性.实时定量PCR和免疫印迹法检测敲减SOX4后A549/DPP细胞中β-catenin和Survivin蛋白的表达.结果 成功构建非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP,其耐药性是亲本细胞的13.7倍,差异有统计学意义(P<0.001).生长曲线显示耐药细胞株与亲本细胞增殖速度没有统计学差异(P<0.05);与A549细胞相比,耐药细胞A549/DDP细胞中SOX4的表达显著增高(P<0.001).敲减SOX4后,A549/DDP细胞的耐药性显著降低;敲减SOX4后,A549/DDP细胞中β-catenin和Survivin的mRNA和蛋白表达水平显著降低.结论 SOX4的表达水平影响非小细胞肺癌细胞A549对顺铂的耐药性.     

全反式维甲酸增强顺铂对A549 细胞化疗敏感性及对Survivin mRNA 和COX-2 mRNA表达的影响

目的:体外观察全反式维甲酸（all-trans retinoic acid ,ATRA）增强顺铂（cisplatin,DDP ）对人类非小细胞肺癌细胞株A549 细胞的增殖抑制及对凋亡抑制蛋白Survivin mRNA和环氧化酶-2（cyclooxygenase- 2,COX-2）mRNA 表达的影响。方法:应用不同浓度组DDP（0.5、5、50mg/L）、ATRA（0.1、1、10μ mol/L）以及联合用药组（ATRA 1 μ mol/L,DDP 5mg/L）,处理肺腺癌细胞株A549 细胞,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法观察不同浓度DDP 组、不同浓度ATRA 组及联合用药组对A549 细胞生长的影响;应用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction ,RT-PCR）检测DDP 组、ATRA 组及联合用药组处理前后A549 细胞中Survivin mRNA和COX-2 mRNA 表达变化;应用流式细胞术观察DDP 组、ATRA 组及联合用药组处理前后细胞凋亡率。结果:与空白对照组相比,单独应用DDP 、ATRA 处理A549 细胞均诱导细胞凋亡,且呈浓度依赖性。与单独应用DDP 的作用相比,联合用药组可更显著抑制A549 的增殖,增加细胞的凋亡率（P<0.05）,并增强对A549 细胞Survivin mRNA和COX-2 mRNA表达的抑制作用（P<0.05）;并且,流式细胞术测定结果显示联合用药组的早期凋亡率（7.37± 3.83）% 、中晚期凋亡率（34.37±2.08）% 、继发性坏死率（7.44± 0.46）% 均较单独应用DDP 组高（3.55± 0.75）% 、（6.62± 0.33）% 、（3.03± 0.05）% ,P 均<0.05。结论:全反式维甲酸能够明显提高非小细胞肺癌对顺铂的敏感性,其机制可能与抑制非小细胞肺癌细胞Survivin mRNA和COX-2 mRNA 的表达有关。      

Wnt／β-catenin信号转导通路与肺腺癌顺铂耐药作用机制研究

目的：探讨Wnt／β-catenin信号转导通路在肺腺癌顺铂耐药中的分子作用机制。方法：体外常规培养人肺腺癌A549细胞和其顺铂耐药A549／DDP细胞,取对数生长期的细胞用于实验。采用MTT法检测A549和A549／DDP细胞对顺铂的IC50;采用AnnexinV／PI法和Hoechst33342染色法检测顺铂处理后2种细胞的凋亡率;采用蛋白质印迹法检测2种细胞中β-catenin和Survivin的表达;采用siRNA干扰沉默pcatenin的表达,检测A549／DDP细胞的Ic5。值、细胞凋亡率及β-catenin和Survivin的表达。结果：顺铂对A549／DDP细胞的IC50值为（28．984±1．404）μmol／L高于A549细胞的（5．888±0．338）umol／L,t=27．696,P〈0．001;20umol／L顺铂诱导A549／DDP细胞凋亡率为（21．75±0．96）％,显著低于A549细胞的（39．38±0．88）％,t=23．474,P〈0．001。A549／DDP细胞中β-catenin蛋白的表达为1．890±0．060,显著高于A549细胞的1．063±0．035,t=20．595,P〈0．001;在A549／DDP细胞中Survivin蛋白表达量为1．107士0．061,明显高于A549细胞的0．503±0．025,t=15．814,P〈0．001。RNAi技术沉默β-catenin蛋白耐药性（14．615±0．939）gmol／L,显著低于未沉默β-cateninA549／DDP细胞的（28．984±1．404）μmol／L,t=14．732,P〈0．001;RNAi技术沉默pcatenin蛋白细胞凋亡率为（37．57±0．64）％,显著高于未沉默β-cateninA549／DDP细胞的（21．75±0．96）％,t=23．699,P〈0．001;RNAi技术沉默伊catenin蛋白下游靶基因Survivin蛋白的表达为0．527±0．065,显著低于A549／DDP组的1．027±0．025和瞬时转染阴性对照siRNA组的1．033±0．040,F=116．944,P〈0．001。结论：抑制Wnt／β-catenin信号转导通路的活性可以降低A549／DDP细胞对顺铂的耐药性。     

TOB1高表达抑制肺癌A549细胞体外迁移和侵袭

目的:探讨TOB1 (transducer of ErbB 2,1)高表达对人肺癌A549细胞体外迁移和侵袭的影响.方法:应用RT-PCR法检测人支气管上皮细胞HBE和10种肺癌细胞中TOB1、PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)、乳腺癌转移抑制基因1(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1)、RHOC(ras homolog gene family,member C)和NME1 (non-metastatic cells 1)mRNA的表达水平;将重组表达载体质粒pcDNA3.0-TOB1和“空载体”质粒pcDNA3.0转染到A549细胞中,建立TOB1高表达的A549/TOB1细胞和对照组A549/PC3细胞,应用体外划痕和Transwell实验检测细胞的体外迁移和侵袭能力,RT-PCR法检测细胞中PTEN、BRMS1、RHOC和NME1 mRNA的表达,蛋白质印迹法检测细胞中α-N-catenin、β-catenin、γ-catenin、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和MMP9蛋白的表达.结果:10种肺癌细胞中TOB1 mRNA的表达水平明显低于HBE细胞(P＜0.05),不同细胞株中TOB1 mRNA与PTEN、BRMS1和NME1 mRNA的表达水平间呈正相关(P＜0.05).A549/TOB1细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于A549细胞(P＜0.05).A549/TOB1细胞中PTEN、BRMS1和NME1 mRNA的表达水平明显高于A549细胞(P＜0.05),而RHOC mRNA的表达水平明显低于A549细胞(P＜0.05); A549/TOB1细胞中α-N-catenin、β-catenin、γ-catenin、MMP2和MMP9蛋白的表达水平明显低于A549细胞(P＜0.05).结论:外源性TOB1高表达可以明显抑制肺癌A549细胞的体外转移和侵袭,其机制可能与TOB1调控PTEN、BRMS1、RHOC和NME1的表达,进一步下调α-N-catenin、β-catenin、γ-catenin、MMP2和MMP9蛋白的表达水平有关.     

纳米雄黄抑制A431细胞株新生血管的机制研究

目的:探讨纳米雄黄抑制人皮肤鳞癌A431细胞新生血管的作用及其相关机理。方法:对皮肤鳞癌A431细胞进行体外培养,分别采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测不同浓度纳米雄黄处理后其色素上皮源性因子(PEDF)和VEGF mRNA的表达情况。结果:对照组、5%、15%、25%纳米雄黄组、DDP组、综合组A4 3 1细胞PEDF表达阳性率分别为(21.50±2.28)%、(28.81±2.75)%、(42.23±2.35)%、(56.80±3.80)%、(46.33±2.07)%、(59.82±4.80)%;VEGF mRNA相对表达量为(86.30±6.44)%、(72.45±5.37)%、(52.74±7.21)%、(44.81±4.34)%、(30.92±4.12)%、(18.35±5.09)%。可见,经纳米雄黄作用后,人皮肤鳞癌A431细胞PEDF的生成量明显升高,VEGF转录mRNA水平显著降低,均呈剂量依赖性,与顺铂联合有协同作用。结论:体外实验表明纳米雄黄抑制A431新生血管生成的作用可能与上调PEDF的表达和下调VEGF的表达有关。     

姜黄素对耐顺铂人肺腺癌细胞Survivin表达及其化疗敏感性的影响

目的:探讨姜黄素(Cur)对耐顺铂(DDP)人肺腺癌细胞A549/DDP Survivin表达及其化疗敏感性的影响。方法:以非毒性剂量(10μmol/L)的姜黄素作用于A549/DDP细胞,采用RT-PCR和免疫组化SABC法分别检测Survivin mRNA和蛋白的表达,MTT法检测A549/DDP细胞对DDP的半效抑制浓度IC50、耐药指数和细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:Cur能使A549/DDP细胞Survivin mRNA相对表达水平由(79.17±5.96)%下调至(57.8±9.8)%,P=0.014;而蛋白表达强度也由1.174±0.059降至1.009±0.072,P=0.023。A549/DDP细胞对DDP IC50及耐药指数分别由(206.77±9.19)μmol/L和10.90降低至(160.80±3.91)μmol/L和7.42,P值分别为0.041和0.035;细胞凋亡率由7.1%增至17.7%,Cur和DDP联合应用后凋亡率达40.61%,P=0.012。结论:Cur下调A549/DDP细胞Survivin表达,可能与部分解除Survivin导致的细胞凋亡抑制有关。     

顺铂对人肺腺癌细胞作用与ERCC1表达的相关性研究

背景与目的核苷酸切除修复机制可修复顺铂(DDP)造成的DNA损伤,作为其中的关键酶之一,切除修复交叉互补基因1(ERCC1)表达可能与DDP耐药有关。本研究的目的是证实ERCC1表达与DDP作用的关系,推测ERCC1在DDP耐药中的作用。方法选择人肺腺癌细胞A549及其耐DDP细胞株A549/DDP为研究对象,RT-PCR及免疫细胞化学方法检测不同浓度、不同作用时间DDP干预后细胞中ERCC1的表达,采用MTT法检测A549/DDP细胞耐药指数。结果10μmol/LDDP作用12h,A549细胞中ERCC1 mRNA表达开始增高,随着作用时间的延长,ERCC1 mRNA的表达逐渐增高,在72h组ERCC1 mRNA表达最强,为66.69%±5.30%。浓度为5μmol/L的DDP即可刺激A549细胞中ERCC1基因水平上升,而随着DDP浓度的增加,ERCC1 mRNA水平逐渐上升,20μmol/L组达高峰(79.50%±5.46%),为对照组的3.9倍。蛋白表达的增高趋势与mRNA基本平行,但二者幅度不完全一致。与亲本细胞比较,经长期小剂量DDP诱导的耐药株A549/DDP中ERCC1表达明显增高。结论随着小剂量DDP作用时间的延长,A549细胞中ERCC1 mRNA和蛋白的表达量增加,推测ERCC1可能参与了继发耐药的形成。