PUMA通过线粒体途径诱导骨肉瘤细胞凋亡的研究

目的:研究p53上调凋亡调控因子(PUMA)对骨肉瘤细胞凋亡的影响及机制。方法:在骨肉瘤细胞F5M2中转染PUMA过表达载体，同时转染对照阴性载体，以qRT-PCR和Western blot法测定转染后细胞中PUMA表达情况，以流式细胞术检测细胞凋亡情况，用JC-1法检测细胞线粒体膜电位，以Western blot法测定线粒体和胞浆中细胞色素C（Cyt C）蛋白表达情况，同时检测细胞中剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水 解酶3（Cleaved Caspase-3）、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Cleaved Caspase-9）蛋白水平。结果:转染PUMA过表达载体后的F5M2细胞中PUMA mRNA和蛋白水平升高，而转染对照阴性载体对F5M2细胞中PUMA mRNA和蛋白水平没有影响。过表达PUMA后的F5M2细胞凋亡率升高，细胞线粒体膜电位下降，线粒体中Cyt C蛋白水平降低，胞浆中Cyt C蛋白水平升高，同时细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平也升高，与未做转染的F5M2细胞比，差异有统计学意义（P<0.05）。转染对照阴性载体后的细胞凋亡率、线粒体膜电位、线粒体和胞浆中Cyt C蛋白水平、Cleaved Caspase-3蛋白水平、Cleaved Caspase-9蛋白水平与未做转染的F5M2细胞相比没有明显变化（P>0.05）。结论:PUMA通过促进线粒体中Cyt C释放，降低线粒体膜电位，激活Caspase-3诱导骨肉瘤细胞凋亡。     

敲低EN2诱导肝癌细胞凋亡并提高PTEN蛋白的表达

 目的 探讨EN2对肝癌细胞凋亡及细胞中PTEN蛋白表达的影响。方法 用EN2 siRNA慢病毒感染肝癌细胞HuH-7，qRT-PCR和Western blot方法检测干扰效果。MTT方法测定细胞活力变化，PI单染法测定细胞周期分布，Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡变化，Western blot测定细胞中激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、激活型Caspase-9（Cleaved Caspase-9）、第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）及细胞周期素B 1( Cyclin B l)蛋白水平，JC-1法测定线粒体膜电位变化，Western blot测定胞浆中细胞色素C（Cytochrome C）蛋白水平。结果 EN2 siRNA慢病毒感染可明显下调肝癌细胞中EN2的表达。沉默EN2表达后的肝癌细胞活力降低，细胞凋亡率升高，细胞G2/M期比例升高，细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、PTEN蛋白水平明显升高，Cyclin B1蛋白水平明显降低，线粒体膜电位下降，胞质中Cytochrome C蛋白水平升高。结论 敲低EN2可以阻滞肝癌细胞周期，诱导肝癌细胞凋亡，其作用机制可能与PTEN、线粒体凋亡途径有关。     

RNA干扰沉默DcR3对人胰腺癌细胞化疗药物敏感性影响的实验研究

背景与目的：大部分胰腺癌具有高表达诱骗受体-3(decoy receptor 3,DcR3)的特征,而后者与FasL凋亡途径相关,可能导致胰腺癌对化疗耐药。该研究旨在探讨RNA干扰沉默DcR3基因对人胰腺癌细胞化疗药物敏感性的影响及其可能机制。方法：构建带有DcR3-siRNA序列的稳定表达质粒,通过Lipofectamine^TM2000转染至人胰腺癌细胞AsPC-1细胞株,筛选出转染后稳定低表达DcR3的胰腺癌细胞,同时设未转染对照组(control组)和转染阴性质粒对照组(mock组)。应用ELISA和蛋白［质］印迹法(Western blot)检测各组AsPC-1细胞中DcR3的蛋白表达;MTT实验检测各组AsPC-1细胞对吉西他滨的敏感性;流式细胞术检测各组AsPC-1细胞凋亡情况;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测各组AsPC-1细胞中FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白和mRNA的表达。结果：转染DcR3-siRNA后AsPC-1细胞中DcR3蛋白较其他对照组明显降低;转染DcR3-siRNA后AsPC-1细胞对吉西他滨的敏感性显著增加;沉默DcR3基因可以上调FasL、Caspase-8和Caspase-3的表达并促进吉西他滨诱导的细胞凋亡。结论：RNA干扰沉默DcR3基因可激活FasL/Caspase凋亡途径,促进肿瘤细胞凋亡,增加人胰腺癌AsPC-1细胞对化疗药物的敏感性。     

IRF-2对胰腺癌细胞生物学特性及化疗敏感性的影响

目的 探讨干扰素调控因子2(interferon regulatory factor 2,IRF-2)在胰腺癌细胞中的生物学特性及其对吉西他滨化疗敏感性的影响.方法 Western blot检测IRF-2基因在胰腺癌细胞株PANC-1及MIAPaCa-2中的表达水平,采用MTT检测吉西他滨对PANC-1及MIAPaCa-2的半数有效浓度(IC50),选择较为耐药的PANC-1细胞进行IRF-2基因干扰表达,并采用MTT检测吉西他滨对PANC-1及干扰IRF-2表达的PANC-1 si1#的半数有效浓度(IC50).结果 PANC-1及MIAPaCa-2中细胞中均存在IRF-2基因的表达,且PANC-1细胞中表达水平比MIAPaCa-2高.吉西他滨对PANC-1细胞的IC50显著高于MIAPaCa-2细胞,差异有统计学意义(P＜0.05);干扰IRF-2表达的PANC-1 si1#细胞其IC50值显著低于PANC-1对照细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 IRF-2基因可作为影响胰腺癌对吉西他滨化疗敏感性的基因之一,干扰IRF-2基因能够有效地提升胰腺癌细胞对吉西他滨化疗的敏感性.     

GOLPH3对食管癌细胞系增殖凋亡及放射敏感性影响研究

目的 研究GOLPH3对食管癌细胞系增殖凋亡及放射敏感性的影响。方法 以qRT-PCR和蛋白印迹法分别检测食管癌细胞系和正常食管上皮细胞GOLPH3 mRNA和蛋白水平,在OE33细胞中转染GOLPH3 siRNA,同时给予照射处理。MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞克隆实验检测放射敏感性,蛋白印迹法检测活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的Caspase-9(Cleaved Caspase-9)蛋白水平。结果 食管癌细胞中GOLPH3 mRNA和蛋白水平明显高于正常食管上皮细胞(P<0.05)。GOLPH3 siRNA可明显下调食管癌OE33细胞中GOLPH3 mRNA和蛋白水平。下调GOLPH3或者照射处理以后的食管癌细胞的增殖活性降低,细胞凋亡率升高,并且细胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平也升高(P<0.05)。下调GOLPH3后的OE33细胞经照射处理以后,细胞增殖活性下降更多,细胞凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Cleaved Caspase-9蛋白水平升高更多(P<0.05)。下调GOLPH3后OE33细胞经照射处理后,细胞放射增敏比为1.673。结论 GOLPH3在食管癌细胞中高表达,下调其表达可以增加OE33细胞放射敏感性,诱导细胞凋亡并抑制其增殖。     

赖氨酸去甲基化酶5C抑制剂CPI-455对ESCC细胞系 Eca-109增殖、凋亡的影响及其机制探讨

目的:本研究探讨赖氨酸去甲基化酶5C（lysine demethylase 5C,KDM5C）抑制剂CPI-455对食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞系Eca-109增殖、凋亡的影响及其机制。方法:运用MTT法、平板克隆形成实验检测 CPI-455对Eca-109细胞增殖的抑制作用;透射电镜观察CPI-455对Eca-109细胞线粒体内部超微结构的影响;流式细胞仪检测CPI-455诱导Eca-109细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;Western blot测定CPI-455对Eca-109细胞中p53、Bax、KDM5C、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平的影响。结果:MTT法、平板克隆形成实验结果分析显示:CPI-455能够抑制Eca-109细胞的增殖,具有时间、浓度依赖性,差异有统计学意义（P均＜0.01）;电镜下观察Eca-109细胞内结构显示:CPI-455引起Eca-109细胞中的线粒体固缩,线粒体缩小,结构紧密;流式细胞术和Western blot显示:CPI-455可以上调Eca-109细胞中ROS含量、p53、Bax、Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3的蛋白表达,同时下调KDM5C蛋白表达（P＜0.05）。结论:CPI-455具有抑制Eca-109细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用,其作用机制可能与下调KDM5C蛋白的表达有关。     

大黄素联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖能力的研究

目的:验证大黄素联合吉西他滨(gemcitabine,GEM)抑制胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖的作用,探讨大黄素促PANC-1细胞凋亡的抗肿瘤作用机制.方法:MTT方法检测大黄素单药以及与吉西他滨联合应用对PANC-1细胞增殖能力的影响.ELISA方法测定细胞上清IL-6水平.RT-PCR方法检测大黄素处理后PANC-1细胞内侵袭相关基因MMP-9的表达情况.Western blot方法分别检测大黄素以及吉西他滨处理PANC-1后凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平.结果:MTT检测结果显示,加药处理细胞72h后,大黄素组(40 μmol/l)PANC-1细胞抑制率为31％,GEM组(20μmol/l)的抑制率为35％,联合用药组的抑制率为49％,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).IL-6浓度大黄素组为(22.41±2.27) ng/ml,联合用药组为(15.44±3.91) ng/ml.实验组均显著低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).大黄素组、联合用药组MMP-9 mRNA表达水平显著低于对照组,GEM组较对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).大黄素组、GEM组、联合用药组Bax表达水平上调,但Bcl-2差异无统计学意义.大黄素组、GEM组、联合用药组的Bax/Bcl-2分别为2.71 ±0.25,4.73---0.17,5.72 ±0.36,均显著高于对照组1.14 ±0.15,结论:体外研究结果显示大黄素能够抑制肿瘤PANC-1细胞增殖,具有促细胞凋亡的作用,与吉西他滨联合应用具有协同效应.     

下调fascin抑制卵巢癌细胞从G0/G1期向S期转变的实验研究

目的:研究下调聚束蛋白（fascin）对卵巢癌细胞周期、增殖和凋亡的影响。方法:卵巢癌细胞SKOV3感染阴性对照慢病毒载体、shRNA fascin 1慢病毒载体、shRNA fascin 2慢病毒载体，用Real-time PCR和Western blot检测干扰效果。MTT检测增殖活性，克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，Western blot检测细胞中活化型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、细胞周期依赖性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinase 4，Cdk4)、活化型Caspase-9（Cleaved Caspase-9）和p21蛋白水平。结果:shRNA fascin 1慢病毒载体、shRNA fascin 2慢病毒载体感染后的SKOV3细胞中fascin mRNA和蛋白表达水平均降低，并且shRNA fascin 1慢病毒载体感染后细胞中fascin mRNA和蛋白表达水平下降更多。下调fascin后的卵巢癌细胞增殖能力降低，细胞克隆形成能力也降低，细胞G0/G1期比例升高，细胞凋亡率升高，细胞中活化型Caspase-3、活化型Caspase-9蛋白水平升高，p21蛋白水平也升高，Cdk4蛋白水平降低，与感染阴性对照慢病毒载体和未经感染的细胞比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论:下调fascin可降低卵巢癌细胞增殖能力、抑制卵巢癌细胞从G0/G1期向S期转变并诱导卵巢癌细胞凋亡。     

凋亡抑制蛋白XIAP和促凋亡因子Smac在胰腺癌化疗抵抗中的调控作用

目的探讨凋亡抑制蛋白XIAP和促凋亡因子Smac在胰腺癌细胞化疗抵抗中的作用及其分子机制。方法应用流式细胞术检测顺铂、5-FU介导的Panc-1、BXPC-3的凋亡率及胞浆染色分析细胞XIAP表达变化,Western-blot分析XIAP、Smac、Caspase-3表达水平；构建pEGFP-N1／Smac真核表达载体并转染胰腺癌Panc-1细胞,流式细胞术检测转染胞浆表达型 Smac基因对Panc-1细胞凋亡敏感性的作用。结果与BXPC-3细胞相比,Panc-1对顺铂或5-FU介导的凋亡具有较强抵抗性,Western blot分析显示Panc-1细胞高表达XIAP,在化疗药物作用下化疗敏感细胞BXPC-3胞浆内XIAP水平下降明显多于Panc-1细胞,而且凋亡的BXPC-3细胞释放入胞浆内的成熟 Smac蛋白水平明显高于Panc-1细胞。转染胞浆表达型Smac基因至化疗抵抗Panc-1细胞,可明显下调其XIAP表达水平,促进效应 Caspase-3分子活化,显著提高顺铂、5-FU诱导的细胞凋亡率。结论在化疗药物诱导的凋亡中,线粒体释放Smac下调XIAP是胰腺癌化疗敏感性的重要决定因素,而上调Smac活性蛋白的胞浆表达作为一种有效调节信号,通过拮抗XIAP的凋亡抑制作用协同化疗药物促进胰腺癌细胞凋亡。     

缺氧状态下人胰腺癌细胞对吉西他滨反应的实验研究

目的:观察缺氧状态对人胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响并分析其相关机制。方法:将人胰腺癌细胞SW1990分为常氧组、缺氧组、常氧+吉西他滨组和缺氧+吉西他滨组。MMT法检测各组细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡、Real-time PCR和Western blot分别检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、多药耐药基因(MDR-1)mRNA和蛋白的表达。结果:与常氧+吉西他滨组相比,低氧+吉西他滨组的细胞增殖率明显增加,细胞凋亡率显著下降(P<0.05);低氧组和低氧+吉西他滨组HIF-1α蛋白表达分别显著高于常氧组(P<0.05或P<0.01);与常氧组相比,低氧组和低氧+吉西他滨组的MDR1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:缺氧状态可增加人胰腺癌细胞SW1990对吉西他滨的化疗抵抗,其机制与缺氧环境可诱导HIF-1α和MDR1基因表达有关。     

TPX2 shRNA对乳腺癌细胞生长、凋亡、侵袭、迁移能力的影响

目的:研究Xklp2靶蛋白（TPX2）shRNA对乳腺癌细胞生长、凋亡、侵袭、迁移能力的影响。方法:乳腺癌细胞MCF-7感染靶向TPX2基因shRNA慢病毒和阴性对照慢病毒,设置为TPX2 shRNA组、shRNA-NC组,把不做慢病毒感染的细胞设为对照组（Control组）。Real time PCR和Western blot测定沉默效果,MTT测定细胞增殖活性,克隆形成实验测定细胞克隆形成能力,流式细胞术测定细胞凋亡,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力,Western blot测定细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、活化型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、活化型Caspase-9（Cleaved Caspase-9）蛋白水平。结果:TPX2 shRNA组TPX2 mRNA和蛋白水平均低于shRNA-NC组和Control组（P<0.05）。TPX2 shRNA组细胞增殖活性和细胞克隆形成能力降低,细胞凋亡率升高,细胞侵袭和迁移能力降低,细胞中MMP-2、MMP-9蛋白水平降低,Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平升高,与shRNA-NC组和Control组比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:下调TPX2明显抑制乳腺癌细胞生长、侵袭和迁移能力,并诱导乳腺癌细胞凋亡。     

STAT3基因沉默对胰腺癌细胞放射敏感性的影响及其机制

目的:探讨信号转导和转录激活因子3（STAT3）基因沉默对人胰腺癌细胞AsPC-1和PANC-1放射敏感性的影响及其机制。方法:体外培养人胰腺癌细胞AsPC-1和PANC-1，通过脂质体转染STAT3 shRNA作为实验组（shSTAT3组），设置阴性对照（shNC组）和空白对照组（NC组）。采用qRT-PCR检测转染后各组AsPC-1和PANC-1细胞中STAT3 mRNA表达水平，Western blot检测细胞中STAT3蛋白表达水平。MTT实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞仪检测各组细胞电子射线照射后的凋亡情况，qRT-PCR和Western blot分别检测各组细胞电子射线照射后的Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA和蛋白的表达情况。结果:shSTAT3组AsPC-1和PANC-1细胞中STAT3 mRNA和蛋白表达水平比NC组和shNC组明显降低（P<0.05）。接受电子射线照射后，shSTAT3组AsPC-1和PANC-1细胞增殖率显著低于shNC组（P<0.05），其细胞凋亡率较shNC组明显升高（P<0.05）。接受电子射线照射后，转染STAT3 shRNA后能够明显上调细胞中Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达（P<0.05）。结论:沉默STAT3基因能够通过上调Bax和Caspase-3的表达和下调Bcl-2的表达促进细胞凋亡，增强胰腺癌细胞的放射敏感性。     

Enhanced effect of gemcitabine by emodin against pancreatic cancer in vivo via cytochrome C-regulated apoptosis

Gemcitabine is currently the best treatment available for pancreatic cancer, but causes high toxicity. Agents that can enhance the effects of gemcitabine with no or low toxicity are needed for the treatment of pancreatic cancer. Emodin, a natural anthraquinone derivative, is one such agent that has been shown to induce apoptosis in other tumor cells via down-regulation of Bcl-2/Bax and promoting the release of Cytochrome C (CytC), but with very low toxicity. The aim of this study was to evaluate whether emodin can enhance the effect of gemcitabine on pancreatic cancer in?vitro and in?vivo and to investigate the possible mechanisms of the enhancement. In?vitro, emodin inhibited the proliferation of the SW1990 cell line and potentiated the apoptosis induced by gemcitabine, which was demonstrated by activation of caspase-3 in the combination group. In?vivo, tumors from nude mice subcutaneously injected with SW1990 cells and treated with a combination of emodin (40?mg/kg) and gemcitabine (80?mg/kg) showed significant reductions in volume, Ki-67 proliferation index and expression of the Bcl-2/Bax ratio (compared with tumors from mice treated with sodium chloride, emodin alone (40?mg/kg) or gemcitabine alone (125?mg/kg), which induced increasing release of CytC from the mitochondria to the cytoplasm and triggered caspase-3 activation leading to apoptosis. Taken together, our results suggest that emodin improved the anti-tumor effect of gemcitabine, even at a lower dose of gemcitabine which could decrease the toxicity of chemotherapy, on transplanted tumors of the SW1990 cell line through the enhancement of apoptosis induced by gemcitabine, the mechanism of which may be through down-regulation of the Bcl-2/Bax ratio and promoting release of CytC from the mitochondria into the cytoplasm.     

CDX1对结直肠癌细胞增殖凋亡及p38MAPK磷酸化水平的影响

目的:探讨尾侧同源盒转录因子1（CDX1）对结直肠癌细胞增殖凋亡及p38MAPK磷酸化水平的影响。方法:用荧光定量PCR和Western blot检测正常肠上皮细胞FHC和结直肠癌细胞SW480、HCT116、Caco2中CDX1 mRNA和蛋白表达水平。在SW480细胞中转染pIRES-CDX1和pIRES记为CDX1组和载体组,以不做转染的细胞为对照组,荧光定量PCR和Western blot测定CDX1 mRNA和蛋白表达水平,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot测定细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、信号转导与转录因子3(STAT3)、磷酸化的STAT3（p-STAT3）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷酸化的p38MAPK（p-p38MAPK）蛋白水平。结果:结直肠癌细胞SW480、HCT116、Caco2中CDX1 mRNA和蛋白表达水平均明显低于正常肠上皮细胞FHC（P<0.05）,SW480细胞中CDX1 mRNA和蛋白表达水平明显低于HCT116、Caco2（P<0.05）。CDX1组细胞中CDX1 mRNA和蛋白水平明显高于对照组（P<0.05）,载体组细胞中CDX1 mRNA和蛋白水平与对照组相比没有统计学差异（P>0.05）。CDX1组细胞存活率明显降低,细胞凋亡率明显升高,细胞中Cleaved Caspase-3、p-p38MAPK水平升高,细胞中Bcl-2、p-STAT3水平降低,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。载体组细胞存活率、凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2、STAT3、p-STAT3、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白水平与对照组相比没有明显变化（P>0.05）。结论:CDX1抑制结直肠癌细胞增殖,诱导Caspase-3介导的细胞凋亡,促进细胞中p38MAPK磷酸化,抑制细胞中STAT3磷酸化。     

shRNA靶向沉默ZEB2表达通过Wnt/β-catenin信号通路降低肺癌细胞增殖活性的实验研究

目的:研究shRNA靶向沉默E盒结合锌指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox,ZEB2）表达对肺癌细胞增殖活性的影响。方法:用shRNA-ZEB2慢病毒和shRNA阴性对照慢病毒感染肺癌细胞,Real time PCR和Western blot检测沉默效果。MTT检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中激活型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、β-连环蛋白（β-catenin）、C-myc蛋白水平。用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂处理沉默ZEB2的肺癌细胞,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中激活型Caspase-3、β-catenin、C-myc蛋白水平。结果:shRNA-ZEB2慢病毒可以明显沉默肺癌细胞中ZEB2的表达和转录,shRNA阴性对照慢病毒对肺癌细胞中ZEB2的表达没有影响。沉默ZEB2后的肺癌细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中激活型Caspase-3蛋白水平升高,β-catenin、C-myc蛋白水平降低。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂下调沉默ZEB2的肺癌细胞株中Wnt/β-catenin信号通路的激活水平,同时可以降低细胞存活率,诱导细胞凋亡,促进细胞中激活型Caspase-3的表达。结论:shRNA靶向沉默ZEB2表达通过Wnt/β-catenin信号通路降低肺癌细胞增殖活性。