人参皂甙 Rh2对人肝癌细胞 SMMC-7721的诱导分化作用

背景与目的:目前寻找低毒高效的分化诱导剂是肿瘤诱导分化治疗的关键.人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学活性,其主要的活性有效成分人参皂甙 Rh2( ginsenoside Rh2,G-Rh2)具有较强的抗癌活性,但其抗肿瘤机制还不十分清楚.因此,本研究探讨 G-Rh2对人肝癌细胞株 SMMC-7721的生长抑制作用及抗癌机制.方法:以 MTT法、光镜、电子显微镜观察 G-Rh2对 SMMC-7721细胞增殖、形态、超微结构的影响.用免疫组化染色和 ELISA法检测细胞浆中甲胎蛋白( alpha-fetoprotein, AFP)合成情况,酶促反应试剂盒检测细胞浆中碱性磷酸酶( alkaline phosphatase, ALP)和γ谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT)活性,放射免疫法检测细胞 AFP和白蛋白( albumin, Alb)分泌量,并观察 G-Rh2对以上指标的影响.结果: G-Rh2以时间依赖性和浓度依赖性抑制 SMMC-7721细胞增殖, 10 μ g/ml G-Rh2作用 6天抑制率达 50%;而 20 μ g/ml G-Rh2作用 4天抑制率近 50%.经 20 μ g/ml G-Rh2作用 4天,肝癌细胞形态及亚细胞结构向正常肝细胞方向逆转. 10 μ g/ml、 20 μ g/ml G-Rh2作用 SMMC-7721细胞后, AFP合成明显下降( P< 0.05),分泌量从 6.60± 0.30下降到 2.35± 0.06( P< 0.01);γ-GT及耐热型 ALP活性显著降低( P< 0.01); ALP活性及 Alb分泌量显著升高( P< 0.01).结论: G-Rh2具有诱导人肝癌细胞 SMMC-7721向正常细胞分化的作用.     

长春瑞滨对人肺腺癌Anip973细胞凋亡和端粒酶表达的影响

目的 探讨长春瑞滨(NVB)对人肺腺癌Anip973细胞的凋亡、端粒酶活性以及人端粒酶逆转录酶mRNA(hTERT mRNA)表达的影响.方法 以不同浓度的NVB作用于Anip973细胞,在不同时间内收集细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察NVB对Anip973细胞的生长抑制作用;通过流式细胞术观察Anip973细胞凋亡率;用倒置显微镜和电镜观察细胞形态学变化;应用以聚合酶链反应(PCR)为基础的端粒重复序列扩增(TRAP-PCR)银染法检测端粒酶活性;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA表达.结果 不同浓度的NVB可诱导Anip973细胞凋亡,而且可降低Anip973细胞中端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,并呈时间-剂量依赖性.0.08μg/ml NVB作用Anip973细胞24 h,细胞增殖被抑制,细胞凋亡率为(7.37±0.35)%,hTERT mRNA表达为57.01±1.71,与对照组差异均有统计学意义(P＜0.01);端粒酶活性值为6.36±0.06,与对照组差异无统计学意义(P＞0.05);hTERT mRNA表达的改变比端粒酶活性更敏感.0.4μg/ml NVB组和2.0μg/mlNVB组各时间点的细胞凋亡率、端粒酶活性和hTERT mRNA表达与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).2.0μg/ml NVB作用Anip973细胞72 h时,端粒酶活性为1.36±0.27,而细胞凋亡率为(74.87±1.88)%,表明细胞凋亡率的增加与细胞hTERT mRNA表达呈负相关(r=-0.96046,P＜0.01).结论 NVB的作用机制与端粒酶有关,诱导凋亡是其发挥抗癌作用的机制之一.检测端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,有助于判定NVB诱导肺癌细胞凋亡的敏感性.     

端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验

目的研究端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞株的凋亡诱导作用及其机制。方法以人肝癌细胞株SMMC-7721、正常肝细胞株L-02为研究对象,采用TRAP-ELISA法对肿瘤细胞端粒酶活性进行定性定量分析;细胞形态学、TUNEL染色、DNA 琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用,用流式细胞仪对细胞周期进行时相分析,Western杂交对细胞周期蛋白进行研究。结果一定浓度的端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性,肝癌细胞端粒酶活性被抑制后传代23～26次出现细胞凋亡。细胞凋亡与细胞周期蛋白有关。结论端粒酶反义寡核苷酸可抑制肝癌细胞端粒酶活性并诱导其凋亡。     

反义寡核苷酸对K562细胞增殖和端粒酶活性的影响

 目的　研究靶向封闭端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASPSODN）对K562细胞目的基因的抑制及其对端粒酶活性及细胞增殖周期和凋亡的影响 。方法　ASPSODN转染到人类红白血病细胞株K562,采用MTT法、酶联免疫吸附（ELISA）法和流式细胞术（FCM）检测K562细胞的增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达。结果　0.6 μmol／L的ASPSODN（0.42±0.16）能明显下调hTERT表达（P＜0.05）,端粒酶相对活性降至52 %;MTT法检测显示明显抑制K562细胞增殖活性;FCM显示细胞凋亡率为10.31 %,PI染色显示细胞被阻止在G1／G0期,S期及G2／M期的细胞减少,但无特征性的凋亡峰。结论　ASPSODN靶向 hTERT 能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调端粒酶活性,抑制K562细胞增殖,并通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞凋亡。     

GP1对人肝癌细胞SMMC—7721细胞周期和端粒酶活性的研究

[目的]研究GP1对人肝癌细胞细胞周期和端粒酶活性的影响。探讨其抗癌机制。[方法]以SMMC-7721细胞为研究对象,采用MTT法,流式细胞术和端粒重复序列扩增法。[结果]GP1可抑制SMMC-7221细胞增殖;阻滞细胞从G2/M期进入G1期;降低细胞端粒酶活性。[结论]GP1阻滞细胞周期于G2/M期和降低端粒酶活性是其重要的抗癌机制。     

榄香烯诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡及对端粒酶活性和hTERT表达影响的研究

目的：探讨榄香烯诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡及其影响端粒酶活性及其催化亚单位人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达的机制。方法：将榄香烯处理人脑胶质瘤U251细胞株后，用MTT法检测细胞增殖抑制率．并求出半数抑制浓度（IC50），倒置显微镜和电镜观察经榄香烯处理的U251细胞形态。流式细胞仪和原位末端标记技术检测细胞周期及细胞凋亡率的变化，免疫荧光技术观簪凋亡小体．流式细胞仪测定bcl-2表达水平．端粒重复扩增（TRAP）法测定端粒酶活性的变化，RT—PCR检测bcl-2和hTERT的表达。结果：榄香烯对U251细胞株增殖具有抑制作用，呈剂量和作用时间的依赖性，IC50为0.062mg／ml，倒置显微镜下可见榄香烯组细胞皱缩、变小，电镜下可见具有典型新月形核的凋亡细胞和凋亡小体，流式细胞仪检测榄香烯阻滞U251细胞周期中S期向G2／M期的转变过程，减少有丝分裂，并引起细胞凋亡，免疫荧光技术观察凋亡小体，TRAP法发现榄香烯可以降低端粒酶活性的变化＋呈时间和剂量依赖型。RT—PCR分别证实榄香烯降低bcl-2和hTERT基因表达水平。结论：榄香烯诱导人脑胶质瘸U251细胞凋亡，并抑制U251细胞端粒酶的活性，榄香烯作用于胺质瘤的分子生物学机制可能通过抑制bc1-2表达，下调hTERT基因，降低端粒酶的活性，从而诱导细胞调亡。     

三氧化二砷对HL-60细胞hTERT基因表达和端粒酶活性的影响

目的：探讨三氧化二砷（As2O3)处理HL－60细胞前后人类端粒酶逆转灵酶（hTERT)基因表达和端粒酶活性的改变。方法：采用姬姆萨染色及碘化丙锭染色置流式细胞仪检测来观察细胞的凋亡，以RT－PCR分析hTERT 基因的mRNA表达水平；应用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白含量；利用多聚酶链反应－酶联免疫反应（PCR－ELISA）方法检测As2O3处理HL－60前后端粒酶活性的改变。结果：2umol/L As2O3诱导HL－60细胞凋亡的过程中，hTERT mRNA表达水平显著下降，细胞内hTERT蛋白含量也相应降低，其端粒酶活性明显受到抑制，结论：As2O3可通过下调hTERT基因的表达而抑制HL－6细胞的端粒酶活性。     

高三尖杉酯碱对Jurkat细胞端粒酶活性的影响及机制研究

目的 探讨高三尖杉酯碱（HHT）对人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞端粒酶活性的影响及其机制.方法 采用改良的Krupp荧光素标记的端粒重复扩增（TRAP）方法检测HHT对Jurkat细胞端粒酶活性的影响.半定量RT-PCR方法检测HHT作用后Jurkat细胞端粒酶逆转录酶（hTERT）及c-myc原癌基因mRNA的表达水平.结果 HHT对Jurkat细胞端粒酶活性及hTERTmRNA、c-myc基因mRNA表达有明显抑制作用.结论 HHT可通过下调hTERT基因转录抑制淋巴细胞的端粒酶活性.c-myc可能参与调控淋巴细胞hTERT基因转录.     

RNA干扰抑制Hep-2细胞人端粒酶逆转录酶基因表达对放射敏感性的影响

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因特异性短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,观察其联合射线对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性和细胞存活的影响,研究hTERT基因在放射增敏中的作用。方法根据hTERT mRNA编码序列设计RNA干扰(RNAi)靶点,构建重组表达质粒pshRNA-hTERT,构建成功后,转染Hep-2细胞并作射线处理,用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR- EHSA)检测端粒酶活性的动态变化,采用克隆形成分析方法观察质粒pshRNA-hTERT对Hep-2细胞放射敏感性的影响,计算放射增敏比SER_(SF2)。结果转染质粒pshRNA-hTERT后,Hep-2细胞的hTERT mRNA表达抑制率为60.8%,质粒pshRNA-hTERT不仅能够抑制Hep-2细胞的端粒酶活性(P<0.05),而且还可以抑制辐射诱导的端粒酶活性上升(P<0.05)。照射前经pshRNA-hTERT处理24h,明显降低了2Gy照射后Hep-2细胞的存活分数(85.7%),与单纯放射组(67.7%)相比,差异有统计学意义(P<0.05),pshRNA-hTERT的放射增敏比SER~(SF2)为1.27。结论RNAi显著抑制了靶基因hTERT的表达,质粒pshRNA-hTERT能明显抑制2Gy照射诱导的Hep-2细胞端粒酶活性升高,并显著提高其体外放射敏感性;质粒pshRNA-hTERT的放射增敏作用可能与端粒酶活性受抑制有关。     

AZT对肝癌细胞端粒酶活性及相关蛋白表达的影响

背景与目的：端粒酶抑制剂抑制端粒酶活性的机制十分复杂,可能涉及多个蛋白的共同作用。本研究通过3’-叠氮脱氧胸苷（3’-azido-deoxythymidine,AZT）作用于人肝癌细胞SMMC-7721。比较AZT作用后癌细胞端粒酶活性及相关蛋白的变化,探讨AZT抑制端粒酶活性的可能机制。方法：利用噻唑蓝[3（4,5-demethyhhiazole-2-y1）-2,5-diphenyl tetrazolium-bromide,MTT]实验确定AZT作用的最佳作用时间和浓度;实时荧光定量端粒重复序列扩增法（real-time fluorescent quantitative TRAP assay,FQ-TRAP法）检测AZT作用后,SMMC-7721细胞端粒酶活性变化;用缺口末端标记技术（terminal deoxyribonucleotidyl transferse（TdT）-mediated biotin-16-dUTP nick-end labelling,TUNEL）法和流式细胞术检测AZT作用后．SMMC-7721细胞凋亡情况;单细胞激光拉曼光谱技术和蛋白质芯片-飞行时间质谱仪,检测AZT作用后特异蛋白质的变化。结果：AZT抑制癌细胞生长的最佳作用时间为48h,最佳作用浓度为20mmol／L;FQ-TRAP法检测发现,AZT作用后肝癌细胞端粒酶活性与对照组相比受到明显抑制（P=0．0001）;TUNEL法观察到AZT诱导肝癌细胞凋亡形态学改变．流式细胞术检测AZT诱导肝癌细胞凋亡率为13．5％：单细胞激光拉曼光谱技术观察到,AZT作用后有7个与蛋白代谢相关的特征峰变化;蛋白质芯片．飞行时间质谱仪检测发现,AZT作用后有24个蛋白分子在癌细胞中高表达,8个蛋白分子在癌细胞中低表达,32个差异蛋白均属于小分子蛋白。结论：AZT可抑制SMMC-7721细胞端粒酶活性,诱导凋亡与相关特异小分子蛋白有关。     

Apoptosis in human hepatoma cell line SMMC-7721 induced by water-soluble macromolecular components of Artemisia capillaris Thunberg.

The aim of this study was to investigate the effect of water-soluble macromolecular components of Artemisia capillaris Thunberg (ACT) on human hepatoma cell line SMMC-7721 (SMMC-7721). The morphological changes of SMMC-7721 were observed under a light microscope and an electron microscope. Inhibition of proliferation was measured with a colorimetric MTT assay. It was discovered that ACT extract-treated cells exhibit morphological changes typical of apoptosis, including condensed chromatin and a reduction in volume. ACT extract at 25-200 microg/ml dose-dependently inhibited the proliferation of SMMC-7721. The 50% effective dose, evaluated on day 3 of exposure to the extract, was 64.52+/-3.53 microg/ml. Upon gel electrophoresis, the fragmented DNA showed a characteristic ladder pattern. Cell cycle analyses revealed that ACT induced cell cycle arrest at the G0/G1 phase.     

The Effect of PEI-Mediated E1A on the Radiosensitivity of Hepatic Carcinoma Cells

Objective: The study was undertaken to investigate the effects of polyethyleneimine (PEI)-mediated adenovirus 5 early region 1A (E1A) on radiosensitivity of human hepatic carcinoma cell in vitro and to disclosure the underlying mechanism. Materials and Methods: Human hepatic carcinoma SMMC-7721 cell line was transfected with E1A gene using PEI vector. Untransfected cells (SMMC-7721 group), cells transfected with blank-vector (SMMC-7721-vect group), and cells transfected with E1A gene (SMMC-7721-E1A group) were treated with 6 MV X-ray irradiation at doses of 0, 1, 2, 4, 8 and Gy, respectively. Radiosensitivity was determined by MTT assay and quantified by calculating the cell survival rate. Cell-cycle distribution and apotosis rate were monitored by flow cytometry. Results: The survival rate of SMMC-7721-E1A was significantly lower than that of SMMC-7721 cell. Apoptosis rate of SMMC-7721-E1A group was significantly higher than that of SMMC-7721group (P<0.01).The ratio of S stage in cell cycle of SMMC-7721-E1A was significantly lower than that in SMMC-7721 cell. The ratio of G2/M stage in cell cycle of SMMC-7721-E1A was significantly higher than that in SMMC-7721 cell (P<0.01). Conclusion: PEI could transfect E1A gene into hepatic carcinoma cells PEI-mediated E1A could effectively enhance radiosensitivity of hepatic carcinoma cells which may be related to its effects on apoptosis promoting leading to S phase suppression and G2/M phase arrest.     

Interferon-alpha repressed telomerase along with G1-accumulation of Daudi cells.

The implications of telomerase on senescence and human carcinogenesis are widely accepted, but the changes of telomerase activity along with cell cycle modulation by anticancer treatment still remain obscure. In this paper, we issued whether the telomerase activity fluctuated along with cell cycle of cultured cancer cells using the antiproliferative effect of interferon-alpha (IFN-alpha). Daudi Burkitt lymphoma cells, treated with IFN-alpha, showed proliferation inhibition and cell cycle arrest at G1. The telomerase activity at 72 h was repressed to about 20% of control cells. Furthermore, after 72 h IFN-alpha treatment, the cells in G1 phase showed the marked decrease of telomerase activity, while cells in S and G2/M still possessed it. Among expressions of telomerase-related genes, only the catalytic subunit of telomerase (hTERT) decreased from 48 h, while the template RNA component (hTERC) and telomerase-associated protein 1 (TEP-1) were not affected. The downregulation of c-Myc preceded the change of hTERT. Moreover, the analysis of cells treated with IFN-alpha for 24 h revealed that cells in G1-to-S transition mainly expressed high hTERT, while S and G2/M cells had higher level of telomerase activity than that of G1 cells. These results indicate that (i) the expression of hTERT precedes the telomerase activity which is higher in S and G2/M phases than G1 phase, (ii) IFN-alpha repressed the telomerase activity in a cell cycle-dependent manner with the downregulation of hTERT.     

RNA干扰技术靶向hTERT基因治疗肝癌的实验研究

背景与目的：RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的新基因阻断技术,在基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。目前,利用RNAi已抑制了包括cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc在内的多个内源基因的表达。同时在艾滋病、病毒性肝炎等的治疗研究中也已取得一定进展。但对肝癌等恶性肿瘤中高表达的hTERT基因,国内外还未见相关研究报道。本研究利用RNAi技术,在体内外抑制hTERT基因表达,探讨RNAi对肝癌治疗的可行性。方法：设计干扰hTERT基因的小片段RNA,构建重组表达质粒pTzu6 1-shRNA-hTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi,采用流式细胞检测技术、RT—PCR法、免疫组化等同时检测RNAi治疗组和对照组hTERT基因表达及细胞增殖变化,结果：体外细胞实验显示,重组质粒pTZU6 1—shRNA—hTERT导入肝癌SMMC7721细胞株3～7天后,肝癌细胞生长抑制率达37．5％;细胞周期相分布发生显著变化,S期细胞明显减少,G1／G0期细胞显著增加;hTERT的mRNA表达由99．4％下调到53．1％,hTERT蛋白表达由86．3％下调到46．6％。裸鼠体内实验结果显示,质粒pTZu6 1-shRNA-hTERT注射裸鼠皮下移植瘤7天后,瘤体积明显缩小,hTERT的mRNA表达由99．1％下调到76．2％,hT．ERT蛋白表达由87．2％下调到61．8％。体内、外对照组各指标均无变化。结论：RNAi明显抑制了靶基因hTERT的表达及肝癌细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法。     

Survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察Survivin反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响.方法：设计合成特异性Survivin 反义寡核苷酸,转染肝癌SMMC-7721细胞,MTT法测定Survivin ASODN对细胞增殖抑制情况的影响,FCM法检测对细胞周期、凋亡及Survivin蛋白表达的影响.结果：Survivin ASODN可抑制SMMC-7721细胞的生长增殖,并呈浓度和时间依赖性.ASODN转染组可诱导SMMC-7721细胞凋亡（P＜0.01）,细胞周期阻滞于G2/M期（P＜0.05）.ASODN转染组Survivin蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）.结论：Survivin ASODN能下调SMMC-7721细胞Survivin表达,并可抑制其增殖并诱导凋亡.     

人剪切修复基因XPD对肝癌细胞生长的抑制作用

目的探讨野生型人剪切修复基因着色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D,XPD)对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响,并探讨其机制。方法用脂质体转染法瞬时转染SMMC-7721细胞,转染重组质粒XPD-N2和空载质粒N2,并用未转染的与XPD-N2、N2具有相同遗传背景和代数的SMMC-721细胞作为空白对照。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot法检测细胞中XPD、c-myc、cdc25A、cdK2表达量变化,MTT法观察细胞增殖的活力。结果提取出的重组质粒pEGFP-N2-XPD用酶切鉴定,与Genebank上的相符。在荧光显微镜下,可以在SMMC-7721-pEGFP-N2、SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,质粒的转染效率为30%左右。流式细胞仪结果显示,pEGFP-N2-XPD重组质粒转染入细胞后,肝癌细胞进入S期发生阻滞,停滞在G1期。RT-PCR、Western blot检测发现SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞与SMMC-7721-pEGFP-N2和SMMC-7721两对照组相比,其XPD 表达明显增高（P<0.05）。c-myc、cdc25A、cdK2相对表达量明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与两对照组相比,SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD细胞增殖率明显减弱（P<0.05）。结论野生型XPD基因可以在转录和翻译水平抑制SMMC-7721细胞内c-myc、cdc25A、cdK2的表达。而且野生型XPD基因通过抑制cdK2的表达作用于S期DNA损伤检控点,从而抑制SMMC-7721细胞增殖。